鐘 華,宋杉杉,邵浣婷,趙 瑜,康勁文,吳 瑤,蘇仁偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642)

犬子宮蓄膿是一種犬常見的在子宮腔內(nèi)積聚膿液并伴有子宮內(nèi)膜異常增生的疾病,據(jù)統(tǒng)計,子宮蓄膿可以在25%的成年雌性犬科動物中發(fā)生[1]。如不及時治療,可能導(dǎo)致一系列嚴(yán)重并發(fā)癥,包括膿毒癥、感染性休克、腹膜炎和多器官功能障礙[1],并有致命的危險。子宮蓄膿的病因較為復(fù)雜,許多因素包括年齡、細(xì)菌感染、激素水平和生殖生理都是其發(fā)生的風(fēng)險因素[2]。其中,最常從子宮蓄膿中分離出的病原體是大腸桿菌[3-4]。

然而,盡管進(jìn)行了廣泛的研究,目前仍未完全了解子宮蓄膿的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制。因此,子宮蓄膿缺乏治愈性的非手術(shù)療法,最有效的治療方法是卵巢子宮切除術(shù),但仍會導(dǎo)致3%～4%的術(shù)后死亡[5-6]。此外,因為早期子宮蓄膿的癥狀十分輕微,寵主難以及時發(fā)現(xiàn)、獸醫(yī)難以及時進(jìn)行診斷,在沒有干預(yù)和治療的情況下,隨著病情的發(fā)展,子宮蓄膿有危及生命的可能。因此,快速、早期的診斷和有效的干預(yù)在臨床實踐中具有非常高的價值,為該病尋找可靠的生物標(biāo)記物是一項重要而迫切的任務(wù),而子宮蓄膿特異性上調(diào)基因及其相關(guān)產(chǎn)物是潛在的生物標(biāo)志物或治療靶點。

近年來,隨著新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測序已被廣泛用于分子機(jī)制的研究。與微陣列相比,RNA-seq是一種具有較高準(zhǔn)確性和靈敏度的測序技術(shù),且不會受到交叉雜交和非特異性雜交的影響[7]。本研究通過RNA-seq,分析蓄膿犬子宮中的轉(zhuǎn)錄組水平變化,篩選差異表達(dá)基因、調(diào)控通路以及中樞基因,為了解子宮蓄膿的分子機(jī)制提供寶貴資源。

1 材料與方法

1.1 動物和樣本采集

對經(jīng)超聲診斷為子宮蓄膿的犬只,記錄臨床資料,包括名字或登記證號、品種、性別、絕育情況、最后發(fā)情時間、發(fā)病時間、年齡、體重、是否開放型子宮蓄膿、有無膿液流出等基本情況。在征得寵物主人的同意并去除膿液后,立即進(jìn)行拍照記錄。先用PBS洗滌組織,洗去表面的血液和宮內(nèi)膿液,然后去除子宮系膜。將組織切成大約5 mm3的立方體。所有收集的子宮樣本在液氮中快速冷凍或在4% PFA中固定并儲存在-80 ℃。所有動物樣本均來自廣州奈谷動物醫(yī)院和廣州福懋動物醫(yī)院。一共收集了19只患犬的組織,包括10只子宮蓄膿犬和9只健康犬。

1.2 基因文庫構(gòu)建與測序

利用TRIzol RNA試劑(TaKaRa,大連,中國)從組織中提取總 RNA。使用 ND-1000 Nanodrop和Agilent 2200 TapeStation(諾禾致源生物信息技術(shù),北京,中國)評估總RNA的純度和完整性具有以下質(zhì)量控制參數(shù):A260/A280>1.8,A260/A230>2.0,RNA完整性≥8.0。cDNA文庫由TruSeq RNA樣品制備試劑盒(Illumina,圣地亞哥,加利福尼亞州,美國)生成。使用 Illumina HiSeqTM2500測序平臺進(jìn)行RNA-seq。

1.3 RNA-Seq和數(shù)據(jù)分析

RNA-seq 生成的原始數(shù)據(jù)首先用Fast-QC做質(zhì)量評估,刪除3′端測序接頭序列和低質(zhì)量(質(zhì)量低于20個堿基)的堿基。利用Tophat v1.4.0將干凈讀數(shù)序列與參考基因組EnsemblCanFam進(jìn)行比對,用Cufflinks v1.3.0分析差異表達(dá)基因。原始數(shù)據(jù)保存在Gene Expression Omnibus (GEO)中,登錄號為GSE208124。以log2FC>2和FDR<0.05選擇差異表達(dá)的基因。

1.4 GO、KEGG和網(wǎng)絡(luò)分析

利用DAVID工具進(jìn)行GO term富集分析[8]。調(diào)整后的P值(Benjamini-Hochberg多重檢驗校正方法)的cut-off值設(shè)為0.01。Wordcloud R包用于生成顯著富集的GO條目詞云。每個富集的GO條目詞云中的字體大小與-lg(P-adj)成正比。DAVID工具也用于通路富集分析,并采用與GO分析相同的cut-off值。用蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫(STRING)v10.0于創(chuàng)建基因網(wǎng)絡(luò)[9],最低綜合得分設(shè)置為0.900(最高置信度)。用Cytoscape軟件進(jìn)行基因網(wǎng)絡(luò)的可視化和分析,用Network Analyzer 分析每個基因的連通性[10],關(guān)鍵中樞基因的連通閾值為平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 免疫組織化學(xué)(IHC)

石蠟切片(5 μm)用于免疫組織化學(xué)染色。在脫蠟和復(fù)水后,加入pH 6.0的檸檬酸鈉溶液中在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù),用3%過氧化氫封閉15 min去除內(nèi)源性過氧化物酶,一抗在4℃孵育過夜,之后與HRP的二抗(ORIGENE,北京,中國)在37℃孵育1 h,再用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(ORIGENE,北京,中國)顯色并用蘇木精復(fù)染,最后將組織切片脫水封片。

1.6 qRT-PCR驗證

為驗證犬子宮蓄膿差異表達(dá)基因的測序結(jié)果,選擇CDK1、CDC6、PRKCB、PIEZO1、PRKCD、YWHAG、ESR1、ACTB基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。根據(jù)NCBI中犬(Canislupusfamiliaris)的參考序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,GAPDH作為參考基因以標(biāo)準(zhǔn)化靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,引物相關(guān)信息見表1。使用TRIzol試劑(TaKaRa)提取RNA,用HiSuperscript II試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用 SYBR 方法進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)。qRT-PCR檢測基因表達(dá)的數(shù)據(jù)采用相對定量2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算,使用Graph Pad Prism 8.0 軟件展開表達(dá)量分析。

表1 qRT-PCR引物

1.7 組織化學(xué)評分(H-SCORE)

使用圖像分析軟件Image J 對ER α的免疫組化染色進(jìn)行H-SCORE分析,如文獻(xiàn)所述[11-12]。

(3)企業(yè)加大與高校聯(lián)合，為大學(xué)生學(xué)習(xí)創(chuàng)業(yè)知識提供廣闊的舞臺。不管是我國早就提倡的產(chǎn)學(xué)研合作，還是以協(xié)同創(chuàng)新中心為重要載體的教育部“高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計劃”都離不開高校與企業(yè)的合作，更離不開企業(yè)的參與，通過企業(yè)與高校合作，大學(xué)生可以到實踐基地、合作企業(yè)去兼職，去實習(xí)，去工作，在這些過程中獲得企業(yè)創(chuàng)立運營的“真知識”，再結(jié)合大學(xué)生在學(xué)校的理論知識，就可以為創(chuàng)業(yè)提供強(qiáng)大的智力支持和動力保證。

1.8 統(tǒng)計分析

利用雙尾student-t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析,并由GraphPad Prism 8.0(GraphPad 軟件)執(zhí)行。數(shù)據(jù)顯示為“平均值±SEM”。P<0.05被認(rèn)為差異是顯著的。

2 結(jié) 果

2.1 犬子宮蓄膿的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的鑒定

為全面了解患有子宮蓄膿犬的基因表達(dá)變化,分別從患子宮蓄膿犬和健康犬子宮取材進(jìn)行RNA-seq測序,利用 Tophat和 Cufflinks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對與差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)子宮蓄膿與健康犬的差異表達(dá)基因(DEGs)11 812個,其中上調(diào)7 086個,下調(diào)4 726個(圖1A、1B)。

A.子宮蓄膿和健康狗差異基因表達(dá)變化的火山圖。藍(lán)色為未改變的基因,紅色表示上調(diào)基因,綠色表示下調(diào)基因。B.差異表達(dá)基因的聚類熱圖。Pyo.患子宮蓄膿犬;Nom.健康犬。下同

2.2 GO 功能注釋的差異性分析和 KEGG-pathway差異性分析

進(jìn)一步探索 DEGs在子宮蓄膿和健康犬的子宮中的功能差異,進(jìn)行了GO和KEGG分析。富集的GO術(shù)語分為生物過程 (Biological Process,BP)、細(xì)胞成分 (Cell Component,CC) 和分子功能 (Molecular Function,MF)(圖2A)。在BP類別中,有15個顯著富集的條目,其中包括G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞過程調(diào)節(jié)、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化、細(xì)胞表面受體信號通路、對刺激的反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞對刺激的反應(yīng)、趨化性、趨向性等。富集的 MF 類別是跨膜信號受體活性、信號受體活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性、金屬肽酶活性、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合、DNA 連接酶 (NAD+)活性、蛋白激酶活性。有趣的是,在所有排名靠前的富集GO術(shù)語中,來自BP的免疫系統(tǒng)過程和趨化性,以及來自MF的細(xì)胞因子活性、趨化因子活性及其受體結(jié)合均反映了子宮蓄膿過程中的炎癥和免疫反應(yīng)。此外,圖2B顯示了豐富的KEGG通路,其中大量通路參與炎癥反應(yīng),包括NF-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路、B細(xì)胞受體信號通路、吞噬體和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

2.3 差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)

基因網(wǎng)絡(luò)是使用STRING數(shù)據(jù)庫生成的。將綜合得分設(shè)置為0.9,獲得了一個由132個節(jié)點組成的基因網(wǎng)絡(luò),這些節(jié)點通過275條邊連接(圖3A)。拓?fù)浞治霰砻?該基因網(wǎng)絡(luò)是一個無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)(圖3B),網(wǎng)絡(luò)中有一些節(jié)點與其他節(jié)點相比高度連接。這些高度連接的節(jié)點,也稱為中樞基因,代表網(wǎng)絡(luò)中的重要基因,一共確定了22個中樞基因(圖3C)。值得注意的是,CDK1、ESR1、SHC1、ACTG1、PRKCB、CCNA2、LYN、AKT1、KIF23、PRKCD和CDC6 的連接數(shù)超過了平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差,因此這 11 個基因可以被認(rèn)為是這個網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵中樞基因。

2.4 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗證

為驗證犬子宮蓄膿差異表達(dá)基因的測序結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)參基因,選擇CDK1、CDC6、PRKCB、PIEZO1、PRKCD、YWHAG、ESR1、ACTB進(jìn)行qRT-PCR檢測。結(jié)果如圖4所示,qRT-PCR檢測結(jié)果與RNA-seq的結(jié)果趨勢一致。

圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

2.5 免疫學(xué)結(jié)果證實犬子宮蓄膿中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)

為了驗證 GO和 KEGG 分析,用免疫組織化學(xué)的方法對 ERα、NF-κB 和 uNK 進(jìn)行染色。ERα是一種由性激素雌激素激活的核受體[13],染色結(jié)果證實,ERα在犬子宮蓄膿的間質(zhì)和腺上皮中的表達(dá)均降低(圖5A、5B)。同時,確認(rèn)NF-κB在健康犬子宮中的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),而在發(fā)生炎癥時其易位至細(xì)胞核表達(dá),該結(jié)果與先前研究結(jié)果一致[14](圖5C)。在小鼠和人類上,子宮自然殺傷細(xì)胞(uNK)被認(rèn)為是實現(xiàn)胚胎植入和成功妊娠的關(guān)鍵[15],而目前對犬uNK細(xì)胞的發(fā)育及功能的研究仍不及其在人類與小鼠中的研究。本研究的染色結(jié)果顯示 uNK細(xì)胞在子宮蓄膿犬中的表達(dá)增加(圖5D)。

3 討 論

子宮蓄膿為發(fā)生于母犬的一種損傷生殖系統(tǒng)和其他系統(tǒng)的慢性或急性常見病,某些犬種中10歲以下有50%以上的母犬都會受其影響[5]。因此,確定用于診斷子宮蓄膿的分子標(biāo)記具有重要意義,而犬子宮蓄膿時表達(dá)增加的基因產(chǎn)物是非常好的選擇。以往的研究表明,蓄膿犬血清中多種免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子增加,如IL-6、CRP、TNF-α等[16]。然而,少有試驗研究子宮蓄膿犬子宮內(nèi)的基因表達(dá)情況。在本研究中,應(yīng)用了具有高精確度和靈敏度的RNA-seq來識別受子宮蓄膿影響時犬子宮轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的差異,一共發(fā)現(xiàn)了11 812個基因差異表達(dá),其中7 086個基因在蓄膿子宮中上調(diào),而4 726個基因下調(diào)。更重要的是,上調(diào)基因的模式反映了免疫和炎癥反應(yīng),如與免疫和炎癥系統(tǒng)過程相關(guān)的幾個基因和通路的表達(dá)均上調(diào),包括但不限于 NF-κB信號通路、B 細(xì)胞受體信號通路、吞噬體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等。

GO和 KEGG-Pathway分析表明,免疫反應(yīng)激活是犬子宮蓄膿的主要病理階段。GO分析表明,免疫系統(tǒng)過程和趨化性的活性增加,包括細(xì)胞因子和趨化因子活性的分子功能,以及細(xì)胞因子受體結(jié)合和趨化因子受體結(jié)合。細(xì)胞因子幾乎涉及免疫和炎癥的各個方面,包括抗原呈遞、細(xì)胞募集、激活、黏附分子表達(dá)等[17]。先前的研究報道,在大于94%的子宮蓄膿犬血清樣本中檢測到了IL-7、IL-8、IL-15、IL-18和TNF-α,與對照組相比,在患有子宮蓄膿的犬血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)濃度更高,且與血清內(nèi)IL-15濃度相關(guān),同時,在由子宮蓄膿引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征的犬中檢測到更高的血清IL-7濃度[16]。在另一項研究中,與其他母犬相比,在患有子宮蓄膿的母犬中檢測到的更高水平的 IL-4,并且與處于發(fā)情期和妊娠期的母犬相比,患有子宮蓄膿的母犬血清中IL-10 顯著增加[4]。這表明幾種細(xì)胞因子在子宮蓄膿疾病發(fā)展中的作用以及診斷犬子宮蓄膿的可能價值。同時,本研究也顯示趨化因子在蓄膿子宮中的激活,趨化因子是一組能夠在各種細(xì)胞中誘導(dǎo)趨化作用的小分子,這些分子通過與G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員的相互作用來調(diào)節(jié)活性[17],其誘導(dǎo)的趨化性功能在本研究的GO分析結(jié)果中也顯示為上調(diào)。與本研究一致,此前的研究在患有子宮蓄膿的犬的血清中檢測到明顯更高濃度的角質(zhì)細(xì)胞衍生趨化因子(KC),并且 KC 濃度與住院天數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)量、IL-8濃度以及帶狀中性粒細(xì)胞占比顯著相關(guān)[18]。這些研究都表明需要進(jìn)一步研究免疫細(xì)胞因子作為診斷犬子宮蓄膿生物標(biāo)志物的可能性。

本研究中KEGG-Pathway分析顯示,與健康犬科動物相比,患有子宮蓄膿的犬科動物子宮中自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性有所增加。細(xì)胞毒性是免疫系統(tǒng)對抗感染的重要效應(yīng)機(jī)制,在大多數(shù)情況下,細(xì)菌感染后免疫細(xì)胞衍生大量對抗感染的細(xì)胞因子,進(jìn)一步活化NK細(xì)胞[19],也有越來越多的研究表明NK細(xì)胞通過直接識別細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物而被激活[20]。而在人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),uNK 細(xì)胞只有在妊娠時會持續(xù)存在,組織駐留自然殺傷細(xì)胞和循環(huán)自然殺傷細(xì)胞被認(rèn)為在懷孕期間有助于uNK細(xì)胞群的形成[21]。研究表明,uNK 分泌的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲促進(jìn)細(xì)胞因子(IL-8 和 IP-10)和重塑母體脊髓動脈所需的各種血管生成因子,對于支持妊娠后期胎盤的充分灌注有非常重要作用,而其細(xì)胞毒性較差[15,22]。目前,在犬中對 uNK細(xì)胞的發(fā)育和功能的研究遠(yuǎn)不及人類和小鼠。本研究免疫組化結(jié)果顯示,與健康犬科動物相比,子宮蓄膿犬子宮中 uNK細(xì)胞表達(dá)增加。對于 uNK細(xì)胞在犬科動物中的功能仍需要進(jìn)一步研究。

本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了一個基因網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由通過275條邊連接的132個節(jié)點組成,并在該網(wǎng)絡(luò)中,確定了11個關(guān)鍵中樞基因。由于中心基因在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位置,它們可能比其他基因更為重要。這11個關(guān)鍵中樞基因分別是ESR1(Estrogen Receptor 1),CDK1(Cyclin Dependent Kinase 1),SHC1(SHC Adapter Protein 1),ACTG1(Actin Gamma 1),PRKCD(Protein Kinase C Delta),CCNA2(Cyclin A2),LYN(LYN Proto-Oncogene),AKT1(AKT Serine/Threonine Kinase 1),KIF23(Kinesin Family Member 23),PRKCB(Protein Kinase C Beta)和CDC6(Cell Division Cycle 6)。

已有多項研究表明 ESR1對于免疫反應(yīng)基因的表達(dá)具有不一致的作用。研究表明,在紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中ESR1 促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,以響應(yīng)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的 TLR 配體刺激[23-25]。相反,在其他幾種感染性疾病模型中,高水平的雌二醇和雌三醇恰恰會降低促炎性免疫反應(yīng)[26-28]。本研究結(jié)果與后者一致,觀察到ESR1 在患有子宮蓄膿的犬科動物中的下調(diào)表達(dá)伴隨著促炎性免疫反應(yīng)的增加。雌激素差異改變ER活性以影響免疫反應(yīng)基因表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。一種可能性是,低水平或高水平的雌二醇會誘導(dǎo)不同的含 ER 的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,從而導(dǎo)致促進(jìn)或抑制炎癥的功能通路中基因的不同模式的表觀遺傳標(biāo)記[25]。同時研究表明,ERα參與NF-κB信號通路轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,在許多情況下對ER和NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用[29],ERs對 NF-κB通路的抑制通常會限制炎癥反應(yīng)的程度[30]。本研究觀察到在患有子宮蓄膿的犬科動物中ESR1的表達(dá)下調(diào)以及 NF-κB的富集。迄今為止,關(guān)于NF-κB在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用的研究較多。作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫功能的多個方面[31-32]。它誘導(dǎo)各種促炎基因的表達(dá),包括編碼細(xì)胞因子和趨化因子的基因,而在本研究中也發(fā)現(xiàn)了這些基因的富集。由于失調(diào)的 NF-κB激活與炎癥性疾病有關(guān),因此靶向 NF-κB信號通路可能是子宮蓄膿抗炎治療的一種有力的方法。

此外,本研究GO分析還揭示了金屬內(nèi)肽酶和金屬肽酶的活性富集。與此前的一項微陣列研究一致,許多基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 成員在蓄膿犬子宮中上調(diào),包括膠原酶 MMP-1 和MMP-13,以及明膠酶MMP-9 和 MMP-7/基質(zhì)溶素[33]。其他的研究也類似地在子宮蓄膿中證實了編碼 MMP 的基因轉(zhuǎn)錄增加[34]。

由于收集的子宮樣本由復(fù)雜的細(xì)胞類型組成,本研究存在一定局限性。子宮壁由子宮內(nèi)膜、子宮肌層和子宮外膜三層構(gòu)成,而子宮外膜和子宮肌層厚度的差異可能會淡化子宮內(nèi)膜基因表達(dá)的變化。之前的研究利用酶分離的方法對子宮腔上皮進(jìn)行微陣列分析[35],這種方法的缺點在于酶分離細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組可能發(fā)生變化。也有研究使用激光捕獲顯微切割 (LCM) 從小鼠子宮中分離管腔上皮[36]。迄今,RNA-seq 技術(shù)的進(jìn)步已使得研究單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組成為可能[37],毫無疑問單細(xì)胞測序技術(shù)的應(yīng)用將為子宮轉(zhuǎn)錄組提供更好的分辨率。然而,與 LCM 一樣,靈敏度的妥協(xié)是目前這種方法的限制因素[38]。

目前,本研究下一步擴(kuò)展應(yīng)評估是否有任何已識別的上調(diào)基因可以用作疾病的生物標(biāo)志物或治療靶點。此外,對于鑒定的基因產(chǎn)物是否與子宮細(xì)菌感染特異性相關(guān)、其上調(diào)是否是細(xì)菌損傷的一般結(jié)果仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

運用 RNA-seq探索了子宮蓄膿犬和健康犬的全面基因表達(dá)譜,鑒定出11 812個差異表達(dá)基因,其中7 086個基因在患犬的子宮中上調(diào),4 726個基因下調(diào)。GO功能分析顯示,差異表達(dá)基因主要涉及免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物過程。KEGG-Pathway分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因參與炎癥與免疫反應(yīng)激活的信號通路,例如NF-κB 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、B 細(xì)胞受體信號通路、吞噬體和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,說明炎癥和免疫反應(yīng)激活是犬子宮蓄膿的主要病理階段。通過使用 STRING 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò),確定了11個關(guān)鍵中樞基因,其產(chǎn)物可能作為診斷子宮蓄膿的分子標(biāo)記。本研究為深入了解犬子宮蓄膿的機(jī)制提供了寶貴的資源。