李悅欣,劉愛菊,馬曉菲,鄭 忠,胡伯欣,智云霞,田樹軍*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071000;2.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程系,滄州 061000)

綿羊的排卵數(shù)/胎產(chǎn)羔數(shù)與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和閉鎖密切相關(guān)[1],顆粒細(xì)胞作為卵泡內(nèi)數(shù)量最多、比例最大以及功能最全的細(xì)胞群,其增殖、凋亡、分化和激素生成等對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育及卵泡閉鎖至關(guān)重要[2-3]。本課題組最新研究發(fā)現(xiàn),TGF-β信號(hào)通路在具有高繁殖力的綿羊卵泡內(nèi)發(fā)揮正調(diào)控作用[4]。TGFβR1作為TGF-β信號(hào)通路的核心信號(hào)分子,是否通過介導(dǎo)TGF-β/Smad分支信號(hào)通路調(diào)控綿羊卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的功能,目前尚不清楚。

TGF-β/Smad是TGF-β信號(hào)通路的一個(gè)重要分支,其中磷酸化的TGFβ受體活性因子(TGFβR1)作為核心信號(hào)分子,會(huì)依次與SMAD2/3結(jié)合并將其活化,共同與SMAD4結(jié)合后調(diào)控下游基因的表達(dá)。在小鼠和豬等哺乳動(dòng)物的卵巢顆粒細(xì)胞中,TGF-β信號(hào)通路的激活可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[5-7],而失活則會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖[8-10]。Zhang等[11]研究表明,TGFβR1和SMAD3的表達(dá)受到阻礙時(shí),導(dǎo)致豬顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化減少,并致使細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),SMAD3基因敲除會(huì)導(dǎo)致大鼠雌激素產(chǎn)生減少和顆粒細(xì)胞凋亡增加[12]。Yu和Liu[13]的研究發(fā)現(xiàn),SMAD2是miR-30d-5p的靶基因,SMAD2過表達(dá)增強(qiáng)了大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖并抑制了細(xì)胞凋亡。SMAD4是細(xì)胞核中TGF-β信號(hào)通路的介體和效應(yīng)器,調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞過程,包括細(xì)胞增殖、分化、自身免疫、多能性和可塑性以及細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、自噬、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-17]。SMAD4失調(diào)與胚胎、骨骼肌分化缺陷、干細(xì)胞丟失、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙和延遲、女性不育和其他疾病有關(guān)[18-22]。

為此,本試驗(yàn)擬構(gòu)建pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4過表達(dá)質(zhì)粒載體及shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4干擾表達(dá)質(zhì)粒載體,對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞中TGFβR1和SMAD4基因分別進(jìn)行過表達(dá)和干擾,利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)、Annexin-V FITC/PI雙染技術(shù)檢測(cè)綿羊顆粒細(xì)胞增殖、周期及凋亡功能,并結(jié)合Real-Time PCR及Western blot檢測(cè)TGFβR1、SMAD4的mRNA水平和TGF-β/Smad信號(hào)通路中TGFβR1、SMAD2/3等的磷酸化水平,探究TGFβR1、SMAD4對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、周期及TGF-β信號(hào)通路的影響,進(jìn)而揭示TGFβR1介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)控綿羊卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 綿羊卵巢 從河北省保定市唐縣屠宰場(chǎng)采集綿羊卵巢,將其放入加有1%雙抗的37 ℃生理鹽水中,于3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、胰酶、雙抗、0.25% Tripsin-EDTA均購自Gibco公司;DME/F-12、PBS購自Hyclone公司;TRIzol?Plus RNA Purification Kit購自Invitrogen公司;RNase-Free DNase Set購自Qiagen公司;SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR、Power SYBR?Green PCR Master Mix購自Roche公司;30%丙烯酰胺溶液購自Bio-Rad公司;PVDF轉(zhuǎn)印膜購自Millipore公司;ECL DualVue WB Marker購自GE公司;SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate購自Thermo Pierce公司;X-ray film購自華東醫(yī)藥;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司;Quantstudio多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國life technologies公司;Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀購自美國 Becton-Dickinson FACS Calibur公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 顆粒細(xì)胞采集及培養(yǎng) 剪下屠宰綿羊的卵巢,用75%酒精噴洗,放于37 ℃滅菌生理鹽水(含雙抗)的保溫瓶中,于4 h內(nèi)回到實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行顆粒細(xì)胞采集。采用預(yù)熱37 ℃的生理鹽水沖洗卵巢,使用滅菌剪刀剪掉卵巢周圍系膜,生理鹽水反復(fù)沖洗至干凈,在DME/F-12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中用無菌刀片劃破3～7 mm的卵泡,將卵泡液和培養(yǎng)基混合液轉(zhuǎn)移至離心管(10 mL)中,1 500 r·min-1離心8 min,棄上清,PBS清洗兩次,加入DME/F-12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)吹打混勻后接種于培養(yǎng)皿中,置于37 ℃,50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照韓紅葉[23]的方法對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4真核表達(dá)載體的構(gòu)建 使用NheI和Hind III兩個(gè)限制性內(nèi)切酶對(duì)pcDNA3.1質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切線性化處理,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物,切膠回收線性化的pcDNA3.1載體。通過PCR擴(kuò)增獲取TGFβR1和SMAD4基因的目的片段,引物由上海桑尼生物合成,TGFβR1與SMAD4引物序列見表1。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,29個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。膠回收目的片段后進(jìn)行重組反應(yīng),重組反應(yīng)體系:目的片段1 μL,線性化載體1 μL,2×Super Fusion Mix 5 μL,H2O 3 μL,50 ℃水浴1 h完成重組反應(yīng)。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,將菌液涂板37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h,挑取單克隆菌落37 ℃搖菌16 h,酶切驗(yàn)證后將陽性菌液送公司測(cè)序鑒定。對(duì)符合條件的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4質(zhì)粒載體(文中簡(jiǎn)稱為pc3.1-TGFβR1和pc3.1-SMAD4),對(duì)照組為pcDNA3.1空白載體(文中簡(jiǎn)稱為PC組)。

表1 PCR引物序列

1.2.3 shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4質(zhì)粒的構(gòu)建 使用AgeI和EcoR I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶對(duì)pLKO.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切線性化處理,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物,切膠回收線性化的pLKO.1載體。TGFβR1和SMAD4的shRNA oligo序列信息見表2。shRNA oligo退火后得到雙鏈shRNA,使用T4連接酶將雙鏈shRNA和線性化的pLKO.1載體進(jìn)行連接反應(yīng),連接反應(yīng)體系:退火得到的雙鏈DNA片段2 μL,線性化載體1 μL,T4連接酶1 μL,T4 buffer 2 μL,H2O 14 μL,16 ℃反應(yīng)過夜。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,將菌液涂板37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h,挑取單克隆菌落37 ℃搖菌16 h,酶切驗(yàn)證后將陽性菌液送公司測(cè)序鑒定。對(duì)符合條件的質(zhì)粒命名為shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4質(zhì)粒載體,對(duì)照組為shRNA-NC空白載體。

表2 shRNA oligo序列信息

1.2.4 過表達(dá)與干擾質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染 顆粒細(xì)胞正常培養(yǎng)達(dá)到70%～80%融合度后,胰蛋白酶消化、PBS清洗,完全培養(yǎng)基重懸,以5×105個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板中,每個(gè)組別3個(gè)重復(fù)。利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑分別將pcDNA3.1(+)-TGFβR1、pcDNA3.1(+)-SMAD4、shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至綿羊顆粒細(xì)胞,參照lipo3000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,取兩個(gè)1.5 mL離心管,分別加入125 μL opti-MEM、5 μL lipo3000試劑和125 μL opti-MEM、2.5 μL質(zhì)粒、5 μL lipo3000試劑,輕輕混勻,按1∶1輕輕混合兩管溶液于室溫下孵育10～15 min,將轉(zhuǎn)染溶液添加至6孔板中,在37 ℃培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞增殖、凋亡及周期的檢測(cè) 采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定,將細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h,在每孔中加入10 μL CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期情況,收集處理好的細(xì)胞,加入500 μL PI/RNase A染色工作液,室溫混勻避光30 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期情況。采用Annexin-V FITC/PI試劑盒檢測(cè)顆粒細(xì)胞的凋亡情況,在懸浮細(xì)胞中加入10 μL Annexin-V FITC和5 μL PI溶液,混勻避光20 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6TGFβR1和SMAD4基因表達(dá)水平的檢測(cè) 采用TRIzol法提取顆粒細(xì)胞的總RNA,并用cDNA鏈合成試劑盒得到cDNA,通過Real-Time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞中TGFβR1和SMAD4的mRNA表達(dá)水平,采用Primer Premier 6.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表3)。配制20 μL反應(yīng)體系:Master Mix 10.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1.0 μL,ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,63 ℃ 25 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次,各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔct表示。

表3 Real-Time PCR的引物序列

1.2.7 蛋白水平的檢測(cè) 提取顆粒細(xì)胞的總蛋白,通過Western blot方法檢測(cè)TGFβR1、BAX、BCL2、Caspase3、SMAD4、p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3的蛋白水平。做SDS-PAGE電泳分析,電泳結(jié)束后進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜和轉(zhuǎn)印膜封閉后進(jìn)行一抗雜交,4 ℃孵育過夜,T-TBS漂洗4次,每次5 min;二抗室溫孵育1 h,T-TBS漂洗5次,每次5 min;ECL工作液處理后放于成像儀中顯色留圖,采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 本試驗(yàn)均重復(fù)3次,使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用單因素方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異,采用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定

綿羊卵巢顆粒細(xì)胞可特異性表達(dá)FSHR蛋白,檢測(cè)FSHR的存在狀況可鑒定顆粒細(xì)胞,如圖1所示,FSHR在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),經(jīng)FSHR染色后,細(xì)胞的胞漿部分呈綠色熒光,而DAPI染色后細(xì)胞核清晰呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,通過重疊可直觀表現(xiàn)出細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的分布區(qū)域,顯微鏡下可見的FSHR表達(dá)率>90%,表明分離培養(yǎng)的綿羊顆粒細(xì)胞純度較高,符合后續(xù)試驗(yàn)對(duì)顆粒細(xì)胞的條件要求。

圖1 綿羊顆粒細(xì)胞FSHR免疫熒光染色情況

2.2 TGFβR1過表達(dá)和干擾的轉(zhuǎn)染效率

通過Real-Time PCR及Western blot對(duì)轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾TGFβR1載體的顆粒細(xì)胞中TGFβR1的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示(圖2A),pc3.1-TGFβR1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,TGFβR1的表達(dá)量較對(duì)照組(PC組)極顯著升高(P<0.01),而shRNA-TGFβR1組轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,TGFβR1的表達(dá)量較shRNA-NC組極顯著降低(P<0.01)。通過Western blot方法對(duì)轉(zhuǎn)染過表達(dá)或干擾TGFβR1載體的顆粒細(xì)胞中TGFβR1蛋白表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明(圖2B),過表達(dá)TGFβR1會(huì)極顯著增加其蛋白的表達(dá)量(P<0.01),干擾TGFβR1會(huì)極顯著降低蛋白的表達(dá)量(P<0.01)。以上結(jié)果表明,TGFβR1過表達(dá)載體和干擾載體能夠顯著改變TGFβR1的表達(dá)水平,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.TGFβR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量;B.TGFβR1蛋白相對(duì)表達(dá)量。*.P<0.05;**.P<0.01,下同。過表達(dá)組基因相對(duì)表達(dá)量均按PC=1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理;干擾組基因相對(duì)表達(dá)量均按shRNA-NC=1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。下同

2.3 TGFβR1過表達(dá)和干擾對(duì)顆粒細(xì)胞增殖/周期/凋亡的影響

用CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾TGFβR1載體的顆粒細(xì)胞增殖的情況,結(jié)果表明(圖3A),TGFβR1過表達(dá)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖,TGFβR1干擾較shRNA-NC對(duì)照組會(huì)抑制顆粒細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3B),TGFβR1過表達(dá),G0/G1期細(xì)胞數(shù)量極顯著降低,對(duì)應(yīng)S期細(xì)胞數(shù)量極顯著增加(P<0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)量無顯著變化(P>0.05);TGFβR1干擾可極顯著降低G0/G1和S期的細(xì)胞數(shù)量,而G2/M期細(xì)胞數(shù)量則極顯著增加(P<0.01)。通過Annexin-V FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示(圖3C),與PC組對(duì)比,TGFβR1過表達(dá)可以顯著降低顆粒細(xì)胞的凋亡數(shù)量(P<0.05);與shRNA-NC對(duì)照組相比,TGFβR1干擾則顯著增加顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量(P<0.05)。TGFβR1過表達(dá)和干擾會(huì)影響凋亡蛋白的表達(dá)(圖3D),TGFβR1過表達(dá)會(huì)極顯著抑制BAX和Caspase3蛋白的表達(dá)水平,TGFβR1干擾會(huì)極顯著抑制BCL2蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)。

A.TGFβR1過表達(dá)/干擾后顆粒細(xì)胞CCK-8檢測(cè)結(jié)果;B.TGFβR1過表達(dá)/干擾處理后顆粒細(xì)胞周期流式檢測(cè)結(jié)果;C.TGFβR1過表達(dá)/干擾處理后顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果(Q1.壞死;Q2.凋亡晚期;Q3.凋亡早期;Q4.正常);D.TGFβR1過表達(dá)/干擾處理凋亡蛋白BAX、BCL2、Caspase3表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

2.4 SMAD4過表達(dá)和干擾的轉(zhuǎn)染效率

通過Real-Time PCR及Western blot對(duì)過表達(dá)和干擾SMAD4載體的顆粒細(xì)胞中SMAD4的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示(圖4A),pc3.1-SMAD4載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,SMAD4的表達(dá)量較對(duì)照組(PC組)極顯著升高(P<0.01),而shRNA-SMAD4組轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,SMAD4的表達(dá)量較shRNA-NC組極顯著降低(P<0.01)。通過Western blot方法對(duì)轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾SMAD4載體的顆粒細(xì)胞中SMAD4的蛋白表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明(圖4B),SMAD4過表達(dá)會(huì)極顯著增加其蛋白的表達(dá)量(P<0.01),干擾SMAD4極顯著降低其蛋白的表達(dá)量(P<0.01)。以上結(jié)果表明,SMAD4過表達(dá)載體和干擾載體能夠顯著改變SMAD4的表達(dá)水平,均可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.SMAD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量;B.SMAD4蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.5 SMAD4過表達(dá)和干擾對(duì)顆粒細(xì)胞增殖/周期/凋亡的影響

通過CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)和干擾SMAD4載體的顆粒細(xì)胞增殖的情況(圖5A),SMAD4過表達(dá)可極顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖(P<0.01),干擾SMAD4可極顯著抑制顆粒細(xì)胞的增殖(P<0.01)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5B),SMAD4過表達(dá),G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量極顯著下降(P<0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),而S期細(xì)胞數(shù)量則極顯著增加(P<0.01);干擾SMAD4后的顆粒細(xì)胞,G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量極顯著下降,G2/M期和S期細(xì)胞數(shù)量極顯著增多(P<0.01)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5C),pc3.1-SMAD4載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,降低了凋亡細(xì)胞比例,對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制具有積極作用;shRNA-SMAD4組轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后與對(duì)照組(shRNA-NC組)相比,細(xì)胞凋亡數(shù)量有所增多。進(jìn)一步探究SMAD4對(duì)凋亡蛋白表達(dá)水平的影響發(fā)現(xiàn)(圖5D),SMAD4過表達(dá)會(huì)極顯著抑制BAX和Caspase3蛋白的表達(dá),干擾SMAD4會(huì)極顯著抑制BCL2蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

A.SMAD4過表達(dá)/干擾后顆粒細(xì)胞CCK-8檢測(cè)結(jié)果;B.SMAD4過表達(dá)/干擾后顆粒細(xì)胞周期流式檢測(cè)結(jié)果;C.SMAD4過表達(dá)/干擾處理后顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果(Q1.壞死;Q2.凋亡晚期;Q3.凋亡早期;Q4.正常);D.SMAD4過表達(dá)/干擾后凋亡蛋白BAX、BCL2、Caspase3的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

2.6 TGFβR1過表達(dá)和干擾對(duì)SMAD4蛋白表達(dá)的影響

TGFβR1過表達(dá)與干擾載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)(圖6),TGFβR1過表達(dá)會(huì)極顯著促進(jìn)SMAD4蛋白的表達(dá)(P<0.01),干擾TGFβR1后極顯著降低SMAD4蛋白的表達(dá)(P<0.01),表明TGFβR1對(duì)SMAD4蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

圖6 TGFβR1過表達(dá)和干擾對(duì)SMAD4蛋白表達(dá)的影響

2.7 SMAD4過表達(dá)和干擾對(duì)TGFβR1蛋白表達(dá)的影響

SMAD4過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,檢測(cè)TGFβR1蛋白的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)(圖7),SMAD4過表達(dá)會(huì)極顯著增加TGFβR1蛋白的表達(dá)(P<0.01),干擾SMAD4極顯著降低TGFβR1蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

圖7 SMAD4過表達(dá)和干擾對(duì)TGFβR1蛋白表達(dá)的影響

2.8 TGFβR1過表達(dá)和干擾對(duì)TGF-β信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

TGFβR1過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后,檢測(cè)TGF-β信號(hào)通路蛋白(p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3)的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)(圖8),TGFβR1過表達(dá)極顯著促進(jìn)了TGFβR1、TGFβR2及SMAD2/3蛋白的磷酸化水平(P<0.01),與此同時(shí),TGFβR1干擾會(huì)極顯著抑制p-TGFβR1與p-TGFβR2的表達(dá)(P<0.01),會(huì)降低SMAD2/3的磷酸化水平。

A.TGFβR1過表達(dá)后p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3蛋白的相對(duì)表達(dá)量;B.TGFβR1干擾后p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

綿羊胎產(chǎn)羔數(shù)的提升是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。綿羊卵泡發(fā)育影響繁殖力的高低,許多研究表明,顆粒細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)與卵泡的命運(yùn)有關(guān)。顆粒細(xì)胞增殖促進(jìn)卵泡成熟和排卵,而凋亡導(dǎo)致卵泡閉鎖和退化[24],抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡,可促進(jìn)卵泡發(fā)育,提高排卵率和胎產(chǎn)羔數(shù)。TGF-β/Smad信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化、個(gè)體發(fā)育、軟骨發(fā)生以及生殖發(fā)育、組織創(chuàng)傷修復(fù)等過程中都發(fā)揮著極其重要的作用[25-26]。本試驗(yàn)探討了TGFβR1對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖凋亡的作用,并進(jìn)一步探究TGFβR1如何通過TGF-β/Smad信號(hào)通路參與顆粒細(xì)胞功能的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)TGFβR1可加快細(xì)胞進(jìn)程進(jìn)入S期,促進(jìn)綿羊顆粒細(xì)胞增殖,抑制顆粒細(xì)胞凋亡,干擾TGFβR1會(huì)發(fā)生G2/M期阻滯,抑制綿羊顆粒細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡。這些發(fā)現(xiàn)與前人的研究結(jié)果類似,TGFβR1是TGFβ配體的1型受體[27-28],參與下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控,促進(jìn)卵子的發(fā)育成熟及黃體形成,參與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化[29];TGFβR1還可以介導(dǎo)生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)的信號(hào),促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和人腔前卵泡的生長(zhǎng)[30];敲除TGFβR1基因的小鼠能排卵和產(chǎn)生卵母細(xì)胞,但會(huì)發(fā)生胚胎死亡[31],同時(shí)還伴隨著嚴(yán)重的輸卵管畸形[28,32],這些結(jié)果顯示,TGFβR1會(huì)對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TGFβR1會(huì)抑制促凋亡基因BAX和Caspase3的表達(dá),促進(jìn)抗凋亡基因BCL2的表達(dá)。有研究表明,抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡蛋白BAX是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其主要作用部位是線粒體膜:前者抑制細(xì)胞色素c(Cytc)的釋放,后者啟動(dòng)Cytc的釋放。BCL2蛋白通過調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞和體細(xì)胞的凋亡,在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和卵泡閉鎖中發(fā)揮重要作用。BCL2基因缺陷的小鼠表現(xiàn)出卵母細(xì)胞和原始卵泡數(shù)量的減少[33],而BCL2的過表達(dá)減少了大的有腔卵泡的顆粒細(xì)胞凋亡,從而增加卵泡發(fā)生,提高排卵率。而BAX在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都有表達(dá),缺失BAX基因的小鼠表現(xiàn)出過多的異常卵泡[34]。與正常卵泡相比,閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞中BAX的表達(dá)較強(qiáng)[35]。在豬顆粒細(xì)胞中,閉鎖卵泡BAX的表達(dá)高于健康卵泡[24,36]。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用[37],Caspase3是參與多種凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵執(zhí)行分子[38-39],活化的Caspase3會(huì)裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[40]。這些結(jié)果表明,TGFβR1通過調(diào)控BCL2、BAX和Caspase3基因的表達(dá),參與顆粒細(xì)胞的增殖凋亡進(jìn)程。干擾TGFβR1會(huì)抑制TGFβR1、TGFβR2以及SMAD2/3的磷酸化,表明TGF-β信號(hào)通路被阻斷。SMAD2/3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心成分,是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的信號(hào)中間產(chǎn)物,激活的TGFβR1通過磷酸化SMAD2/3(R-Smads)蛋白激活Smad信號(hào)通路,磷酸化的R-Smads共同與SMAD4蛋白結(jié)合,將信號(hào)由胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)下游目的基因的表達(dá)[11,41]。

由于在TGF-β/Smad信號(hào)通路中,TGF-β二聚體結(jié)合TGFβR2,并導(dǎo)致TGFβR2自身磷酸化激活,同時(shí)將TGFβR1募集到高度保守的近膜區(qū)域,之后TGFβR2磷酸化激活TGFβR1并和其之間形成異四聚體復(fù)合物,磷酸化的TGFβR1將依次招募SMAD2和SMAD3與其結(jié)合將其磷酸化后轉(zhuǎn)為活化狀態(tài),將信號(hào)傳遞到胞漿中,SMAD2/3與SMAD4形成異構(gòu)體復(fù)合物,最終將信號(hào)由胞漿傳遞至細(xì)胞核中,在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。SMAD4在該通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,故進(jìn)一步探究了TGF-β/Smad通路中TGFβR1下游的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SMAD4與顆粒細(xì)胞功能的關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn),TGF-β/Smad通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SMAD4與顆粒細(xì)胞的增殖凋亡有密切關(guān)系,過表達(dá)SMAD4會(huì)加快細(xì)胞進(jìn)程進(jìn)入至S期,促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖,抑制促凋亡蛋白BAX和Caspase3的表達(dá),促進(jìn)抗凋亡蛋白BCL2的表達(dá);抑制SMAD4則發(fā)生G2/M期阻滯,抑制顆粒細(xì)胞增殖,抑制BCL2的表達(dá),促進(jìn)BAX和Caspase3的表達(dá)。SMAD4作為一種常見的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì),被認(rèn)為在調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)和雌性生殖方面發(fā)揮了重要作用[9]。敲除卵巢特異性基因SMAD4的小鼠出現(xiàn)生育能力下降,生殖力隨著時(shí)間的推移而下降,卵泡發(fā)生中存在多種缺陷,如嚴(yán)重的卵丘細(xì)胞缺陷和顆粒細(xì)胞過早黃體化[42]。已有研究發(fā)現(xiàn),腔前顆粒細(xì)胞中SMAD4基因的缺失會(huì)導(dǎo)致后續(xù)卵泡發(fā)育和分化的嚴(yán)重缺陷[9]。以上發(fā)現(xiàn)證實(shí),TGFβR1介導(dǎo)的TGF-β/Smad通路可以調(diào)控綿羊顆粒細(xì)胞功能,當(dāng)SMAD4基因過表達(dá)即該信號(hào)通路信號(hào)傳遞增強(qiáng)時(shí),可促進(jìn)綿羊顆粒細(xì)胞的增殖,并抑制其凋亡。

4 結(jié) 論

TGFβR1促進(jìn)綿羊顆粒細(xì)胞的增殖及周期進(jìn)程,抑制顆粒細(xì)胞凋亡,通過介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路中SMAD2/3及SMAD4的表達(dá)正向調(diào)控綿羊顆粒細(xì)胞的增殖與周期,并負(fù)向調(diào)控其凋亡。