賀名揚,馬鈺靜,王 泳,楊若晨,劉月琴,張英杰,段春輝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,保定 071000)

綿羊是短日照動物,季節(jié)性繁殖特征明顯。前人研究表明MT作為光周期節(jié)律因子,其分泌隨光照變化呈現(xiàn)春夏低秋冬高、夜間高白晝低的特點,并可調(diào)控季節(jié)性繁殖動物的卵泡發(fā)育、排卵等生殖活動[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),MT可通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPO)調(diào)控卵泡的發(fā)育。埋植MT后,其可通過與下丘腦上的受體結(jié)合刺激神經(jīng)元分泌促性腺激素釋放激素,進而提高垂體對非繁殖期母鹿促黃體素(LH)和促卵泡素(FSH)的分泌水平[4]。此外,MT也可通過HPO軸調(diào)控卵巢的生理機能。研究表明,MT可提高母羊優(yōu)勢卵泡數(shù)及腔前卵泡的生長[5-6];Adriaens等[7]研究發(fā)現(xiàn),MT可以促進小鼠腔前卵泡雄烯二酮和P4的分泌。切除小鼠松果體后,MT分泌的下降,抑制了P4的分泌,促進了E2的分泌[8]。另外,卵泡顆粒細(xì)胞分泌的類固醇激素對卵泡生長發(fā)育至關(guān)重要。研究表明,MT可通過其受體介導(dǎo)MAPK途徑調(diào)節(jié)人類顆粒-黃體細(xì)胞分泌P4[9]。以上的研究證明,MT影響了綿羊的季節(jié)性繁殖[10],但MT是否通過影響顆粒細(xì)胞功能調(diào)控卵泡發(fā)育有待研究?；诖?本研究通過在綿羊卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加MT,探究MT對顆粒細(xì)胞增殖與凋亡、激素分泌及相關(guān)基因、蛋白表達的影響,以期解析MT調(diào)控綿羊繁殖的可能路徑。

1 材料與方法

1.1 采集卵巢

綿羊卵巢來自河北省保定市唐縣屠宰場,選擇1歲齡體重相近、體況良好、來自同一牧場飼養(yǎng)條件相同的20只健康小尾寒羊母羊卵巢,收集后用生理鹽水沖洗干凈,保存在37 ℃含有青霉素(100 IU·mL-1)和鏈霉素(100 IU·mL-1)生理鹽水的保溫瓶中,在2 h內(nèi)運回實驗室。

1.2 顆粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將采集的卵巢先用75%的酒精沖洗,再用37 ℃預(yù)熱的DPBS緩沖液清洗,去除表明酒精,之后將卵巢放在盛有37 ℃預(yù)熱的含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中,洗滌2次,以細(xì)胞培養(yǎng)液為割卵液,用滅菌刀片將直徑為2～3 mm 的卵泡割破,卵泡液收集于10 mL離心管中,吹打后垂直靜置10 min,使卵母細(xì)胞和其他組織沉淀,吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個10 mL 離心管1 000 r·min-1離心10 min,棄掉上清,再加入含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中使沉淀懸浮并均勻分散,進行離心洗滌(1 000 r·min-1,10 min),此步驟重復(fù)3次,使之成為單細(xì)胞懸液,用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù),將顆粒細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,在37 ℃和5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)48 h,24 h更換1次培養(yǎng)液。

1.3 試驗設(shè)計

將生長狀況良好的綿羊顆粒細(xì)胞分別添加不同濃度MT(0、10-9、10-8、10-7、10-6mol·L-1)處理48 h檢測顆粒細(xì)胞增殖活力和凋亡率;以影響顆粒細(xì)胞增殖活力和凋亡率最好的添加量組(10-7mol·L-1MT)為試驗組,未添加MT為對照組,分析MT對綿羊顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、類固醇激素分泌、相關(guān)受體基因、類固醇合成通路基因和蛋白表達的影響。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 細(xì)胞增殖活力檢測 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度MT(0、10-9、10-8、10-7、10-6mol·L-1)處理48 h,每個濃度5個重復(fù),每孔加入10 μL CCK-8溶液,溫育4 h后,酶標(biāo)儀450 nm檢測細(xì)胞吸光度。

1.4.2 細(xì)胞凋亡檢測 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度MT(0、10-9、10-8、10-7、10-6mol·L-1)處理48 h,每個濃度5個重復(fù),收集細(xì)胞,加70%乙醇4 ℃固定過夜;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL Propidium Iodide固定細(xì)胞進行染色,37 ℃避光反應(yīng)5～15 min;BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進行流式細(xì)胞分析,并使用FlowJo 7.6軟件處理數(shù)據(jù)。

1.4.3 激素及cAMP測定 試驗組和對照組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48 h,每組3個重復(fù),收集培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液的上清,用綿羊ELISA試劑盒檢測E2、P4和cAMP濃度,按照生產(chǎn)廠家的規(guī)程(江蘇晶美生物科技有限公司)進行檢測。

1.4.4 基因表達量分析 收集培養(yǎng)后的顆粒細(xì)胞用TRIzol法提取總RNA。凝膠電泳檢測純度,分光光度法測定RNA含量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫序列信息設(shè)計引物(表1),以GAPDH為內(nèi)參,采用RT-qPCR檢測MT對綿羊顆粒細(xì)胞中MT1、MT2、凋亡基因BAX、Caspase-3、Bcl-2及調(diào)控垂體激素基因LHR、FSHR和類固醇激素基因StAR、CYP11A1、CYP19A1、3β-HSDmRNA表達的影響,采用2^-ΔΔct方法分析數(shù)據(jù)。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4.5 蛋白表達量檢測 收集試驗組和對照組培養(yǎng)48 h后的顆粒細(xì)胞,提取總蛋白。測定蛋白濃度,SDS變性,將蛋白質(zhì)用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)移分離膠到NC膜,300 mA恒流,轉(zhuǎn)膜時間以目的蛋白分子大小而定。將膜完全浸沒于5%牛奶-TBST中室溫輕搖60 min。用5%牛奶-TBST稀釋一抗,室溫孵育15 min,放4 ℃搖床過夜;二抗室溫孵育60 min,放入化學(xué)發(fā)光儀器,充分滴加發(fā)光液曝光后拍照分析灰度值。抗體信息如表2所示。

表2 一抗信息

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件中的獨立樣本T檢驗和單因素ANOVA分析數(shù)據(jù),用Duncan進行多重比較。數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示,P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響

采用CCK8檢測MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響(圖1)。由圖1可知,添加MT后各組顆粒細(xì)胞的增殖活力均顯著高于對照組(NC)(P<0.05)。在MT添加組中,10-6、10-7和 10-8mol·L-1組顆粒細(xì)胞增殖活力差異不顯著(P>0.05),但顯著高于10-9mol·L-1組(P<0.05),其中10-7組細(xì)胞活力最高。

不同字母表示顯著差異(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05),下圖同

利用Annexin V-FITC檢測MT對顆粒細(xì)胞凋亡的影響(圖2、圖3)。圖2A、2B、2C、2D和2E分別為對照組和10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1組顆粒細(xì)胞凋亡結(jié)果,圖3A為不同濃度MT對顆粒細(xì)胞早期凋亡影響的統(tǒng)計分析,圖3B為不同濃度MT對顆粒細(xì)胞晚期凋亡影響的統(tǒng)計分析。由圖2和圖3可知,10-6、10-7、10-8mol·L-1MT處理組顆粒細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率極顯著低于10-9mol·L-1組和對照組(P<0.01),10-6、10-7、10-8mol·L-1MT處理組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05),其中10-7組細(xì)胞晚期凋亡率最低,10-9mol·L-1組細(xì)胞凋亡率與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。

A,B,C,D,E.分別為NC、10-6、10-7、10-8、10-9 mol·L-1 MT對綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的影響。Q1為機械損傷致死細(xì)胞;Q2為晚期凋亡細(xì)胞;Q3為早期凋亡細(xì)胞;Q4為活細(xì)胞。不同顏色代表熒光染色強度,Q1和Q3表示染色結(jié)果為單陽,Q2表示雙陽,Q4表示未染色

A.MT對綿羊顆粒細(xì)胞早期凋亡的影響;B.MT對綿羊顆粒細(xì)胞晚期凋亡的影響

2.2 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達的影響

利用RT-qPCR檢測MT對顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達的影響。由圖4可知,添加10-7mol·L-1MT處理48 h,顯著下調(diào)了凋亡基因BAX、Caspase-3及BAX/Bcl-2的表達(P<0.05),顯著上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(P<0.05),流式凋亡結(jié)果相一致。

A.MT對顆粒細(xì)胞BAX、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的影響;B.BAX/Bcl-2 mRNA相對表達量之比

2.3 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞E2、P4及cAMP分泌的影響

利用ELISA檢測MT對顆粒細(xì)胞類固醇激素和cAMP分泌的影響。由圖5A可知,添加10-7mol·L-1MT顯著抑制了顆粒細(xì)胞P4的分泌(P<0.05),由圖5B和圖5C可知,MT對E2和cAMP的分泌無顯著影響(P>0.05)。

A.MT對P4分泌的影響;B.MT對E2分泌的影響;C.MT對cAMP的影響

2.4 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞MT受體、類固醇激素相關(guān)基因及蛋白表達的影響

利用RT-qPCR檢測MT對顆粒細(xì)胞MT受體、促性腺激素受體和類固醇合成基因表達的影響。由圖6可知,MT顯著上調(diào)MT受體基因1(MT1)mRNA的表達水平(P<0.05),顯著下調(diào)促性腺激素受體FSHR的mRNA表達(P<0.05),顯著下調(diào)P4合成基因STAR、3β-HSD和CYP11A1的mRNA表達水平(P<0.05),對于MT受體基因2(MT2)、LHR和CYP19A1的表達無顯著影響(P>0.05)。

圖6 MT對綿羊顆粒細(xì)胞MT受體和類固醇合成通路相關(guān)基因mRNA表達的影響

利用Western blot檢測MT對顆粒細(xì)胞上述基因蛋白表達的影響,以印證mRNA表達結(jié)果。由圖7可知,MT顯著上調(diào)MT1的蛋白表達,顯著下調(diào)FSHR、STAR、3β-HSD和CYP11A1蛋白表達(P<0.05);而對MT2、LHR和CYP19A1的蛋白表達無顯著影響(P>0.05),與mRNA表達結(jié)果相一致。

3 討 論

3.1 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響

哺乳動物卵泡主要由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞組成,卵泡的成熟排卵和凋亡閉鎖實質(zhì)上是顆粒細(xì)胞的增殖分化和凋亡[11]。MT作為一種強效的抗氧化物質(zhì)和活性氧清除劑[12-13],可保護機體免受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn),MT不僅對人和豬卵丘細(xì)胞有明顯的抗凋亡作用[14-15],也對人和小鼠顆粒細(xì)胞的凋亡有顯著影響[16-17]。Tian等[18]發(fā)現(xiàn),10-7mol·L-1MT可促進綿羊卵丘細(xì)胞增殖及卵母細(xì)胞成熟。本研究發(fā)現(xiàn),10-9、10-8、10-7、10-6mol·L-1MT處理48 h后綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖活力均顯著升高,且細(xì)胞活力與對照組相比分別升高18.4%、31.0%、42.0%和25.6%,說明褪黑素可促進綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖。在豬卵巢顆粒細(xì)胞中,添加0.01 和0.1 ng·mL-1MT顯著提高了細(xì)胞增殖活力,抑制了細(xì)胞凋亡,且最適濃度0.01 ng·mL-1增殖活力和抗凋亡率最高[19]。在凋亡試驗中發(fā)現(xiàn),10-8、10-7、10-6mol·L-1MT不僅可以顯著降低顆粒細(xì)胞早期凋亡率,也顯著降低了晚期凋亡率,3組中10-7mol·L-1MT細(xì)胞凋亡率最低。此外,與其他MT處理組相比,10-9mol·L-1MT顯著促進了顆粒細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡。這表明MT對綿羊顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡作用與其添加量不呈線性增加關(guān)系。

3.2 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞P4、E2及cAMP分泌的影響

顆粒細(xì)胞會通過類固醇激素分泌影響卵泡發(fā)育[20],但MT與綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的功能關(guān)系尚不明確。本研究中,卵巢顆粒細(xì)胞中添加10-7mol·L-1MT處理48 h顯著降低P4的分泌水平,而對E2的分泌無顯著影響,說明在體外培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中添加MT會抑制P4的分泌,而P4水平的降低則會減緩下丘腦和垂體促性腺釋放激素和促性腺激素分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié),從而影響卵泡發(fā)育[21]。在人顆粒細(xì)胞中,200 pg·mL-1MT可顯著促進P4的分泌,小于200 pg·mL-1對P4分泌無顯著影響[22]。但在水牛顆粒細(xì)胞[23]中添加10-7mol·L-1MT處理24 h,顯著降低培養(yǎng)液中P4分泌水平,而對E2的分泌無顯著影響,與本研究結(jié)果一致。在豬卵巢顆粒細(xì)胞中[19],P4分泌水平隨MT濃度的升高而顯著降低,E2分泌隨MT添加濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低。以上研究結(jié)果說明,MT對哺乳動物卵巢顆粒細(xì)胞P4和E2分泌的影響可能存在物種差異。

MT與受體結(jié)合后通過第二信使發(fā)揮作用。研究表明,MT可能根據(jù)組織、器官和物種的不同誘導(dǎo)不同的第二信使發(fā)揮作用[24]。在下丘腦室旁核和視上核細(xì)胞中,cAMP作為第二信使在MT信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[25],在雞顆粒細(xì)胞中,MT通過與G蛋白偶聯(lián)抑制腺苷環(huán)化酶進而抑制cAMP水平[26]。除cAMP路徑外,在垂體細(xì)胞、垂體遠端部及下丘腦內(nèi)側(cè)基底部,MT也可通過鈣離子、PKC和cGMP路徑發(fā)揮作用[27-28]。Riaz等[23]發(fā)現(xiàn),在牛顆粒細(xì)胞添加10-7mol·L-1MT不影響cAMP分泌,本研究與以上研究結(jié)果一致。在綿羊卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體[18]中發(fā)現(xiàn),10-7mol·L-1MT組與對照組相比cAMP水平無顯著差異,但顯著提高了cGMP水平和促進了卵丘細(xì)胞增殖。對于MT是否通過其他第二信使對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)揮作用有待進一步研究。

3.3 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中MT受體表達的影響

在雞、豬、牛和羊等動物的卵巢、卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均檢測到MT1和MT2基因的表達。在體外研究發(fā)現(xiàn),MT主要通過MT1改善綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)量促進卵母細(xì)胞成熟[18]。在牛顆粒細(xì)胞中,MT顯著提高MT1的表達,但對MT2的表達無顯著影響[23,29]。在本研究中也有相似發(fā)現(xiàn),MT顯著上調(diào)MT1 mRNA和蛋白的表達,而對MT2 mRNA和蛋白的表達無顯著影響,說明MT1在MT調(diào)控綿羊顆粒細(xì)胞的增殖凋亡中發(fā)揮重要作用。此外,在其他物種中有不同發(fā)現(xiàn),在豬顆粒細(xì)胞中添加0.01 ng·mL-1MT顯著促進MT2表達,對MT1表達無顯著影響[19]。在雞卵巢顆粒細(xì)胞中添加1 ng·mL-1MT兩種受體表達量均顯著升高[26]。以上研究表明,MT對于不同物種可通過不同受體調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡。

3.4 MT對綿羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡基因及類固醇激素合成相關(guān)基因表達的影響

自由基和活性氧是誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要因素之一。隨著卵泡的發(fā)育,卵泡內(nèi)細(xì)胞的新陳代謝能力和類固醇激素水平的上升,可導(dǎo)致自由基在卵泡內(nèi)的堆積并引起氧化損傷[30]。在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2介導(dǎo)內(nèi)源凋亡通路調(diào)控細(xì)胞凋亡[31]。在熱應(yīng)激的綿羊顆粒細(xì)胞中,MT通過促進Bcl-2抑制凋亡基因p53表達,保護顆粒細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[32]。在牦牛黃體細(xì)胞[33]中,MT顯著上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達,下調(diào)凋亡基因BAX的表達及BAX/Bcl-2的比值,從而抑制黃體細(xì)胞凋亡。MT通過促進Bcl-2表達,降低Caspase-3表達,抑制水牛顆粒細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果與上述報道基本一致,MT通過上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)BAX、Caspase-3和BAX/Bcl-2比值,抑制綿羊顆粒細(xì)胞凋亡。

FSH通過與顆粒細(xì)胞上的受體FSHR結(jié)合活化芳香化酶,刺激P4分泌,影響卵巢顆粒細(xì)胞類固醇激素相關(guān)基因表達;也可通過誘導(dǎo)LHR表達,促進LH與受體結(jié)合介導(dǎo)雄烯二酮轉(zhuǎn)化為E2[34-35]。FSH和MT均可通過受體直接作用于卵巢顆粒細(xì)胞,且MT可抑制FSH與其受體結(jié)合[23]。在牛顆粒細(xì)胞中10-7mol·L-1MT處理24 h,顯著下調(diào)FSHR的表達,上調(diào)LHR的表達[23]。本研究中,MT顯著下調(diào)了FSHR的mRNA和蛋白表達水平,而對LHRmRNA和蛋白表達無顯著影響,這與P4和E2的分泌結(jié)果相一致。

StAR是類固醇激素合成過程中重要的調(diào)節(jié)因子,可編碼孕酮合成過程中膽固醇向線粒體內(nèi)膜的跨膜運輸。有研究發(fā)現(xiàn),CYP11A1和3β-HSD的表達與卵泡液中P4含量呈正相關(guān)[36]。CYP11A1和3β-HSD是P4合成的主要催化酶,前者調(diào)控膽固醇向孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化過程,后者將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為P4[37]。在體外培養(yǎng)水牛和豬顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),MT通過下調(diào)StAR和CYP11A1的表達抑制P4分泌[23,38]。在本研究中,MT顯著抑制了CYP11A1、StAR和3β-HSD的表達,說明MT通過抑制P4合成酶編碼基因的表達,抑制了綿羊卵巢顆粒細(xì)胞P4的分泌。在E2合成過程中,芳香化酶可調(diào)節(jié)雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為E2,是E2合成的重要限速酶,由CYP19A1編碼生成[39]。本研究發(fā)現(xiàn),MT對CYP19A1基因及蛋白的表達無顯著影響。

4 結(jié) 論

本研究表明,MT通過上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)BAX、Caspase-3表達和BAX/Bcl-2比值,抑制綿羊顆粒細(xì)胞凋亡;MT通過與顆粒細(xì)胞上MT1結(jié)合下調(diào)FSHR、StAR、3β-HSD和CYP11A1基因表達,抑制P4的分泌。