馮慧渝，許瀛引，張志遠(yuǎn)，何曉蘭，郭秀蘭，彭衛(wèi)紅,

（1.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610106；2.四川省食用菌研究所，四川成都 610066）

姜黃素（Curcumin）是從姜黃根莖中提取出來(lái)的一種脂溶性多酚類(lèi)化合物，呈橙黃色結(jié)晶粉末狀，味稍苦[1]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等多方面有廣泛的藥理作用[2-5]。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)腸道黏膜有保護(hù)作用[6]，能緩解伊立替康化療導(dǎo)致的遲發(fā)性腹瀉及其帶來(lái)的腸道損傷[7]。雖然姜黃素具有多種生物活性，但其耐光性、耐熱性、耐鐵離子性較差，易被氧化，穩(wěn)定性低，且姜黃素屬于脂溶性成分，在水中的溶解度僅有0.6 μg/mL，極大地限制了姜黃素的應(yīng)用[8]。姜黃素進(jìn)入人體后，在體內(nèi)代謝過(guò)程極快，很快被排出體外，難以發(fā)揮生理功效，導(dǎo)致生物利用度極低[9]。因此尋求一種方法來(lái)保護(hù)姜黃素，使其免受環(huán)境破壞，安全到達(dá)指定部位并增加其保留時(shí)間，達(dá)到緩釋的目的很重要。

微膠囊技術(shù)是利用天然或合成的高分子材料對(duì)固體、液體或氣體等核心物質(zhì)進(jìn)行包埋的技術(shù)[10]，由于能起到保護(hù)芯材、控制芯材釋放、增強(qiáng)芯材穩(wěn)定性、提高芯材利用率等作用[11]，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、化妝品等多個(gè)行業(yè)領(lǐng)域。采用微膠囊包埋技術(shù)可以將姜黃素制備成微膠囊顆粒，不僅可以提高姜黃素在水中的溶解性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性，而且便于儲(chǔ)運(yùn)、應(yīng)用范圍也更加廣闊。目前制備微膠囊的方法繁多，其中銳孔法因其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、投資少，所制得的微膠囊形態(tài)和粒徑都較為均一等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注[12]。但使用銳孔法制備姜黃素的研究較少，并且包埋率偏低。劉欣等[13]采用銳孔法以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材制備的姜黃素微囊，包埋率僅為60%，需要改進(jìn)制備工藝。另外鮮少有 關(guān)于姜黃素微膠囊應(yīng)用于腹瀉的研究，因此探索包埋效果好且能用于腹瀉治療的姜黃素微膠囊配方和制備方法具有應(yīng)用推廣的研究?jī)r(jià)值。

本試驗(yàn)選用姜黃素、海藻酸鈉、海綿膠煤炱菌多糖、吐溫80 和CaCl2為原料，通過(guò)銳孔法制備姜黃素微膠囊，以成型效果和包埋率為主要考察指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得到最佳制備工藝，并對(duì)制得的微膠囊進(jìn)行形貌分析。首次采用動(dòng)物模型探究了姜黃素微膠囊對(duì)小鼠腹瀉的干預(yù)作用及其機(jī)制，為優(yōu)化姜黃素微膠囊制備工藝及其干預(yù)腹瀉的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素 純度98%，西安圣青生物科技有限公司；吐溫80 廣東潤(rùn)華化工有限公司；無(wú)水氯化鈣、無(wú)水乙醇 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；羧甲基纖維素鈉 食品級(jí)，同發(fā)食化商行有限公司；番瀉葉 毫州市譙城區(qū)康美中藥城；海綿膠煤炱菌由四川省宜賓市竹海鎮(zhèn)提供；ELISA 試劑盒（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10） 江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；試劑盒（DAO、D-乳酸、SOD、MDA） 南京建成生物工程研究所；蛋白抽提試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠 體重18～22 g，6～7 周齡，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（川）2020-030，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20180412）。

B-395 Pro 型微膠囊造粒儀、L-200 Pro 型冷凍干燥機(jī) BUCHI 公司；AH-NANO 型均質(zhì)機(jī) 安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；WB-2000 型水浴鍋鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SB-5200DT 型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPECORD 210 PLUS 型分光光度計(jì) Analytikjena 公司；SD-90 型離子濺射儀 北京博遠(yuǎn)微納科技有限公司；FlexSEM 1000 型掃描電鏡 HITACHI 公司；JXFST PRP-CL 型冷凍研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；ST16R 型高速冷凍離心機(jī)、Micro21R 型高速冷凍離心機(jī)、Multiskan GO 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海綿膠煤炱菌多糖的制備 將海綿膠煤炱菌鮮樣粉碎，以1:11 的料液比加入純水，然后在100 ℃熱水浴浸提20 min，8000 r/min 離心20 min 收集上清液，添加3 倍上清液體積的98%乙醇，攪拌均勻后靜置過(guò)夜，8000 r/min 離心20 min 后收集沉淀物，烘箱40 ℃烘干后得到海綿膠煤炱菌多糖，經(jīng)硫酸苯酚法檢測(cè)多糖含量為92.16%。

1.2.2 微膠囊的制備步驟 a.壁材溶液的配制：稱(chēng)取一定質(zhì)量的海藻酸鈉和海綿膠煤炱菌多糖于燒杯中，加入蒸餾水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，?0 ℃恒溫條件下保溫4 h，使海藻酸鈉完全吸水溶脹后備用；b.芯材和壁材混合液的配制：將乳化劑吐溫80 加入壁材溶液中混勻，再稱(chēng)量一定量的姜黃素固體粉末加入壁材溶液中充分?jǐn)嚢?，?5 ℃條件下超聲2 min 混勻；c.乳液的制備：在4 ℃條件下，將混合液倒入高壓均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)，壓力為330 bar，每100 mL 單次均質(zhì)5 min；d.凝固液的配制：配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CaCl2溶液，冷卻到室溫，備用；e.造粒：利用微膠囊造粒儀將乳液緩慢滴入凝固液（CaCl2溶液）中，形成微膠囊。其中凝固液的體積為混合乳液體積的三倍，參數(shù)設(shè)置分別為噴嘴孔徑200 μm，流速7 mL/min，頻率1200 Hz，電壓700 mV，攪拌速度30%；f.包埋、干燥：將微膠囊在室溫條件下攪拌包埋一定時(shí)間，分離出微膠囊，用清水洗去微膠囊表面殘留的CaCl2，置于-50 ℃，0.5 mbar 條件下冷凍干燥72 h，即得姜黃素微膠囊產(chǎn)品。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)在姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、海綿膠煤炱菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、吐溫80 體積分?jǐn)?shù)0.5%、包埋時(shí)間1 h 的基礎(chǔ)上，依次變換相應(yīng)的因素水平來(lái)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。選擇海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；包埋時(shí)間分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 h；海綿膠煤炱菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%；姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%；吐溫80 體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。按上述條件制備姜黃素微膠囊，考察各因素對(duì)微膠囊包埋率的影響。

1.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)姜黃素微膠囊工藝進(jìn)一步優(yōu)化，考察A（海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、B（姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)微膠囊制備的影響，選擇L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

1.2.5 姜黃素的測(cè)定

1.2.5.1 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考高鳳苑等[14]方法，稱(chēng)取10.0 mg 姜黃素置于燒杯中，用無(wú)水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，再用無(wú)水乙醇進(jìn)行定容，得到100 μg/mL 的儲(chǔ)備液。分別移取2、3、4、5、6 mL 儲(chǔ)備液到100 mL 的容量瓶中，用無(wú)水乙醇進(jìn)行定容，制成2～6 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，分別在425 nm 處測(cè)定其吸光度。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。姜黃素溶液在425 nm 處的回歸方程為y=0.163x-0.0006，R2=0.9999＞0.99，姜黃素在2～6 μg/mL 范圍內(nèi)具有可行度和良好的線性關(guān)系。

1.2.5.2 樣品中姜黃素的測(cè)定 微膠囊產(chǎn)品中總姜黃素含量測(cè)定：參考吳玲玲等[15]方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01 g姜黃素微膠囊，加入1.5 mL 無(wú)水乙醇，放入冷凍研磨機(jī)，-20 ℃條件下研磨5 min，使姜黃素微膠囊完全破碎，再加入少量蒸餾水，攪拌，超聲10 min，使姜黃素完全溶解，離心后取上清液。用適量蒸餾水反復(fù)洗滌殘?jiān)^(guò)濾收集洗滌液，定容稀釋至合適濃度，用無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，在425 nm 處測(cè)定其吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素的含量。

微膠囊產(chǎn)品表面姜黃素含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01 g 姜黃素微膠囊，加入少量無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢瑁刮⒛z囊表面的姜黃素完全溶解在無(wú)水乙醇中，離心后取上清液。用適量無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌殘?jiān)?，過(guò)濾收集洗滌液，定容稀釋至合適濃度，用無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，在425 nm 處測(cè)定其吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素的含量。

1.2.6 微膠囊包埋率的計(jì)算 微膠囊包埋率的計(jì)算公式為[13]：

式中：ER 為包埋率，W1-為微膠囊產(chǎn)品總姜黃素的質(zhì)量，W2-為微膠囊產(chǎn)品表面姜黃素的質(zhì)量。

1.2.7 微膠囊載藥量的測(cè)定 微膠囊載藥量計(jì)算公式為[16]：

式中：m1-微囊中姜黃素的質(zhì)量，m2-所稱(chēng)微囊樣品的質(zhì)量。

1.2.8 微膠囊的微觀形態(tài)觀察 使用掃描電子顯微鏡觀察未包埋姜黃素的空白微膠囊和姜黃素微膠囊的微觀形態(tài)。在觀察之前，用金濺射涂覆姜黃素微膠囊30 s，再放入電鏡中觀察，觀察條件設(shè)置為20 kV，放大倍數(shù)為300 倍。

1.2.9 腹瀉試驗(yàn)

1.2.9.1 造模試劑制備 番瀉葉煎劑的制備：參考玄靜等[17]的方法稍作調(diào)整：取番瀉葉40 g，加水400 mL煎煮2 次，每次20 min，紗布過(guò)濾，濾液水浴濃縮至100 mL，即0.4 g·mL-1番瀉葉煎劑，4 ℃保存，用前水浴加熱至25 ℃。

造模劑量設(shè)置說(shuō)明：預(yù)實(shí)驗(yàn)中小鼠體重約為22 g，每只灌胃番瀉葉煎劑0.4 mL，該濃度下小鼠腹瀉率為100%，腹瀉指數(shù)穩(wěn)定且無(wú)死亡，與未灌胃的正常小鼠腹瀉指數(shù)形成顯著差異，以預(yù)實(shí)驗(yàn)為依據(jù)確定番瀉葉煎劑的小鼠灌胃量為18.18 mL/kg。

姜黃素乳液的制備：取一定量的姜黃素，使用1%羧甲基纖維素鈉溶液配制（除了未進(jìn)行包埋以外，成分和配制方法與微膠囊一致）為1.028 mg/mL的姜黃素溶液。

姜黃素微膠囊混懸液的制備：取一定量的姜黃素微膠囊，使用1%羧甲基纖維素鈉溶液配制為5、10 mg/mL 的姜黃素微膠囊混懸液。

1.2.9.2 動(dòng)物分組 40 只小鼠在SPF 環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，溫度為25 ℃，濕度為60%，光照與黑暗時(shí)間各12 h，期間小鼠自由飲食與飲水。隨機(jī)分為正常組（Normal）、腹瀉組（Control）、非微膠囊組（Non-Microcap）、低濃度微膠囊組（L-Microcap）、高濃度微膠囊組（H-Microcap），每組8 只。分組說(shuō)明：根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定姜黃素微膠囊的灌胃量，以微膠囊載藥量為20.56%計(jì)算姜黃素的含量，非微膠囊組和低濃度姜黃素微膠囊組姜黃素含量一致；高濃度姜黃素微膠囊組的姜黃素含量為低濃度姜黃素微膠囊組的姜黃素含量的兩倍，以探究微膠囊的最適使用量。由于使用1%羧甲基纖維素鈉溶液來(lái)制備姜黃素微膠囊混懸液，正常組后續(xù)灌胃1%羧甲基纖維素鈉溶液作為對(duì)照。

1.2.9.3 造模及處理方法 實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水，第1～3 d 除正常組按體重灌胃18.18 mL/kg 的蒸餾水外，其余組每天每只小鼠按體重灌胃18.18 mL/kg 番瀉葉煎劑，期間正常自由飲食。第4～6 d 正常組灌胃18.18 mL/kg 的蒸餾水、其余組小鼠灌胃18.18 mL/kg的番瀉葉煎劑1 h 后，正常組和腹瀉組按體質(zhì)量灌胃18.18 mL/kg 的羧甲基纖維素鈉，非微膠組按體質(zhì)量灌胃18.18 mL/kg 姜黃素乳液，微膠囊組小鼠按體重灌胃18.18 mL/kg 微膠囊混懸液。灌胃結(jié)束后，把小鼠置于有墊紙的小鼠籠內(nèi)，每籠1 只，每隔1 h 換一次墊紙，連續(xù)觀察6 h。6 h 內(nèi)觀察糞便，不成形或稀便且濾紙上有污跡者，視為造模成功。以稀便率（LSIR）、稀便級(jí)（ALSG）、腹瀉指數(shù)（DI）、腹瀉率為腹瀉指標(biāo)，觀察并記錄連續(xù)6 h 內(nèi)各小鼠的總排便次數(shù)、稀便數(shù)、稀便級(jí)、小鼠腹瀉數(shù)，統(tǒng)計(jì)相關(guān)腹瀉指標(biāo)。

1.2.9.4 指標(biāo)測(cè)定 觀察指標(biāo)：參考文獻(xiàn)[18]。a.腹瀉率：一組動(dòng)物中排稀便的動(dòng)物數(shù)與該組動(dòng)物總數(shù)之百分比。b.稀便率（LSIR）：每只動(dòng)物所排的稀便數(shù)與總便數(shù)之比。c.稀便級(jí)（ALSG）：表示稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級(jí)，分為4 級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)表2。統(tǒng)計(jì)時(shí)先逐個(gè)統(tǒng)計(jì)每一堆稀便的級(jí)數(shù)，然后將該鼠所有稀便級(jí)數(shù)相加除以稀便次數(shù)得稀便的平均級(jí)數(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)稀便級(jí)。d.腹瀉指數(shù)（DI）：稀便率與稀便級(jí)的乘積。

表2 稀便等級(jí)表Table 2 Loose stool scale

檢測(cè)指標(biāo)：第6 d 最后一次觀察結(jié)束后，立即將小鼠麻醉處死后腹腔動(dòng)脈取血，將全血4 ℃靜置30 min 后，3000 r/min，4 ℃離心10 min，上清即為血清，4 ℃保存，用于炎癥指標(biāo)IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、DAO、D-乳酸檢測(cè)，具體檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。將小鼠空腸取出后按重量1:9 加緩沖液進(jìn)行勻漿，用于檢測(cè)SOD 和MDA，具體檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用碧云天蛋白抽提試劑盒對(duì)空腸蛋白抽提，通過(guò)BCA 濃度測(cè)定后用于Western blot 測(cè)定。取蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后隨即轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)），洗滌，染色脫色、洗滌、孵育一抗、二抗、洗滌、曝光顯影等步驟，得到蛋白p-Nrf2、HO-1、NQO1、Keap1、Occludin、Claudin-1、ZO-2、TRL4、IRAK1、Myd88、TRAF6、NF-κB 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 22.0、Origin 2018 和 Excel 2016 等對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每組實(shí)驗(yàn)三次平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊化效果的影響由圖1A 可知，隨著海藻酸鈉濃度的增加，溶液的粘稠度增加，形成的微囊硬度變大，包埋率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)海藻酸鈉濃度達(dá)到1.5%以后緩慢增加。在實(shí)際操作中，海藻酸鈉濃度低于1.5%時(shí)，形成的微囊質(zhì)地軟、流動(dòng)性大、容易破裂，凍干后呈塊狀粘連嚴(yán)重，無(wú)法形成單獨(dú)的微膠囊顆粒。海藻酸鈉濃度大于2.0%，儀器造粒較困難，濃度大于2.5%，無(wú)法通過(guò)銳孔，不能造粒。所以后續(xù)正交試驗(yàn)海藻酸鈉濃度選擇1.5%、2.0%、2.5%作為試驗(yàn)水平。

圖1 各因素對(duì)包埋率的影響Fig.1 Effects of various factors on microencapsulation efficiency

2.1.2 CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊化效果的影響 由圖1B 可知，當(dāng)CaCl2濃度小于1%時(shí)，鈣離子與海藻酸鈉交聯(lián)反應(yīng)不完全、影響了微膠囊的形成，導(dǎo)致包埋率偏低。隨著氯化鈣濃度的增加，包埋率呈上升趨勢(shì)，濃度達(dá)到1.0%以后緩慢增加，到達(dá)2.0%以后基本保持穩(wěn)定。當(dāng)CaCl2濃度大于2%時(shí)，微囊膜增厚且顆粒增大，并且成品有澀味。最終確定CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，在正交試驗(yàn)中不再將其列為試驗(yàn)因素。

2.1.3 包埋時(shí)間對(duì)微膠囊化效果的影響 由圖1C可知，當(dāng)包埋時(shí)間小于0.5 h 時(shí)，鈣離子與海藻酸鈉還未充分發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致包埋率偏低。隨著包埋時(shí)間的增加，包埋率呈上升趨勢(shì)，到達(dá)1.5 h 以后基本保持穩(wěn)定。由于對(duì)包埋率影響不明顯，且為保證制備效率，最終確定包埋時(shí)間為1.5 h，在正交試驗(yàn)中不再將其列為試驗(yàn)因素。

2.1.4 海綿膠煤炱菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊化效果的影響 由圖1D 可知，隨著多糖濃度的增加，包埋率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，當(dāng)多糖濃度為0.15%時(shí)，包埋率大于未添加多糖的包埋率。并且隨著多糖濃度的增加，溶液黏度增大，濃度大于0.15%時(shí)，儀器造粒困難，因此在實(shí)際操作中選擇0.15%為最終濃度，在正交試驗(yàn)中不再將其列為試驗(yàn)因素。

2.1.5 姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊化效果的影響 由圖1E 可知，隨著芯材含量的增加，包埋率也隨之增加。當(dāng)姜黃素含量在0.3%左右時(shí)，微膠囊的成型效果和包埋率都較好。此后，由于芯材增加，通過(guò)濕微膠囊狀態(tài)在體視顯微鏡下觀察到芯材逐漸充滿(mǎn)微膠囊內(nèi)部，壁材不能將姜黃素完全包埋，部分姜黃素暴露在壁材表面，且壁材在溶液中所占百分比的減少使得形成的微膠囊膜較薄，質(zhì)地硬度有所下降，不能包埋內(nèi)部的姜黃素，導(dǎo)致包埋率明顯下降。綜上所述，姜黃素濃度在0.2%～0.4%范圍內(nèi)較適宜。

2.1.6 吐溫80 體積分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊化效果的影響 姜黃素為脂溶性物質(zhì)，加入乳化劑吐溫80 以后，能使姜黃素溶于壁材溶液中形成混合乳液，并且能使微膠囊造粒相對(duì)容易。由圖1F 可知，吐溫80 的添加量為0.3%時(shí)，包埋率達(dá)到最高，0.5%以后基本持平，由于對(duì)包埋率影響不明顯，在正交試驗(yàn)中不再將其列為試驗(yàn)因素。

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定包埋時(shí)間為1.5 h、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、海綿膠煤炱菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、吐溫80 體積分?jǐn)?shù)0.3%，采用正交試驗(yàn)對(duì)姜黃素微膠囊工藝進(jìn)一步優(yōu)化，考察 A（海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、B（姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)微膠囊包埋率的影響，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 3 Orthogonal experiment results and analysis of range

由表3 可知，A3B3組的包埋率最高，為92.26%。RB（2.43）＞RA（2.39），各因素對(duì)制備姜黃素微膠囊包埋率影響的主次順序?yàn)椋築＞A，即姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。且各因素R 值均大于空列R 值，表示各因素水平效應(yīng)存在差異，該模型可信。由K 值大小判斷銳孔法制備姜黃素微膠囊的最佳工藝條件組合為：A3B3。

所以制備姜黃素微膠囊的最佳條件是：海藻酸鈉濃度2.5%，姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，包埋時(shí)間為1.5 h、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、海綿膠煤炱菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、吐溫80 體積分?jǐn)?shù)0.3%，此時(shí)產(chǎn)品包埋率可達(dá)92.26%，載藥量為20.56%，且該條件下微膠囊易成型，質(zhì)地較硬，制備效果好。

2.3 微膠囊的形態(tài)表征

由圖2 可知，制備出的姜黃素微膠囊產(chǎn)品結(jié)構(gòu)完整，表面凹凸不平，顆粒飽滿(mǎn)，多數(shù)呈球形，表面的褶皺是銳孔法微膠囊的特征，主要是因?yàn)楦稍锖笫ニ衷斐删劭s[19]。而未包埋姜黃素的空白微膠囊表面結(jié)構(gòu)致密，無(wú)凸起，較扁平，與包埋姜黃素的微膠囊形態(tài)形成鮮明對(duì)比，表明該法能夠有效將姜黃素進(jìn)行包埋。

圖2 微膠囊干燥后的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of posterior drying microcapsules

2.4 姜黃素微膠囊降低小鼠腹瀉指數(shù)

經(jīng)番瀉葉灌胃后，腹瀉組、非微膠囊組、低濃度微膠囊組、高濃度微膠囊組小鼠均出現(xiàn)穩(wěn)定的腹瀉現(xiàn)象，腹瀉率與正常組形成明顯差異，說(shuō)明造模成功。由表4 可知，隨著時(shí)間推移小鼠的腹瀉指數(shù)逐步下降可能是因?yàn)樾∈髾C(jī)體漸漸適應(yīng)了番瀉葉的刺激。非膠囊組小鼠雖然腹瀉指數(shù)逐步下降，從75.03±7.79 下降至50.09±7.91，但與腹瀉組相比不構(gòu)成顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明非膠囊組處理無(wú)法有效干預(yù)腹瀉。灌胃微膠囊后，小鼠腹瀉均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），至第6 d 時(shí)，低濃度微膠囊組腹瀉指數(shù)降至51.62±6.89，高濃度微膠囊組小鼠腹瀉指數(shù)下降至41.71±6.09，其中高濃度微膠囊組小鼠腹瀉指數(shù)下降更明顯，說(shuō)明微膠囊工藝使得各組分聯(lián)合作用能夠達(dá)到干預(yù)小鼠腹瀉的目的，且高劑量組效果更好。

表4 藥物干預(yù)后五組小鼠腹瀉指數(shù)（DI）及腹瀉率變化Table 4 Changes of diarrhea index (DI) and diarrhea rate in five groups of mice after drug intervention

2.5 姜黃素微膠囊提高腹瀉小鼠抗氧化能力

檢測(cè)小鼠腸組織勻漿中SOD 活力和MDA 含量，SOD 活力的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA 的高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[20]。由表5 可知，小鼠腹瀉后，SOD 活力顯著下降（P＜0.05），機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深，MDA 含量升高，說(shuō)明機(jī)體清除自由基能力下降。經(jīng)非微膠囊組和微膠囊組分別處理后，機(jī)體清除自由基能力有不同程度提升，其中，高濃度微膠囊提升程度最高，SOD 含量提升至9.24±0.97 U/mgprot，MDA降至5.41±0.65 nmol/mgprot，其次是低濃度微膠囊和非微膠囊組。相比非微膠囊組，經(jīng)過(guò)微膠囊包埋工藝后，姜黃素乳液的抗氧化能力明顯上升。雖然進(jìn)行干預(yù)治療后非微膠囊組、低濃度微膠囊組、高濃度微膠囊組小鼠抗氧化能力未能恢復(fù)至正常組小鼠水平，但相比于腹瀉組小鼠機(jī)體清除自由基能力已產(chǎn)生大幅度回升。

表5 小鼠腸組織SOD 和MDA 值Table 5 Value of SOD and MDA in intestinal tissue of mice

2.6 姜黃素微膠囊提高腹瀉小鼠抗炎癥能力

細(xì)胞因子是腸道免疫調(diào)控中的關(guān)鍵信號(hào)，包括促炎因子和抗炎因子。關(guān)鍵的促炎因子是白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）。抗炎因子白介素10（IL-10）參與炎癥和免疫抑制[21-22]。小鼠腹瀉后，由圖3 可知，血清中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α分別顯著升高至114.07±6.55、75.71±2.44、900.58±45.33 pg/mL（P＜0.05），抗炎因子IL-10 顯著下降至919.46±124.40 pg/mL（P＜0.05），說(shuō)明腹瀉引起了機(jī)體炎癥反應(yīng)（圖3D）。非微膠囊組血清中促炎因子IL-6 和IL-1β下降可能與樣品成分中含有抗炎作用的姜黃素和海綿膠煤炱菌多糖有關(guān)。高劑量組微膠囊灌胃后小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α分別顯著降低至79.71±6.10、56.27±5.83、596.98±43.17pg/mL（P＜0.05），IL-10 顯著升高至1147.75±124.68 pg/mL（P＜0.05），表明高劑量微膠囊能夠有效降低機(jī)體炎癥指標(biāo)。

圖3 小鼠血清中炎癥指標(biāo)Fig.3 Inflammatory indicators in mice serum

2.7 姜黃素微膠囊對(duì)腹瀉小鼠腸道屏障的保護(hù)作用

一定程度腹瀉會(huì)影響腸粘膜屏障功能，血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-Lactate）水平能夠有效評(píng)價(jià)腸道功能損傷情況，反映腸機(jī)械屏障功能，DAO 和D-乳酸血清中含量越高，腸道功能損傷情況越嚴(yán)重[23]。經(jīng)腹瀉造模后，腹瀉組小鼠與正常組小鼠相比，血清DAO 含量顯著上升至72.25±4.15 U/L（P＜0.05），說(shuō)明腹瀉已經(jīng)一定程度損傷了小鼠腸道屏障（圖4A），高劑量的微膠囊有效抑制了DAO 在血清中釋放，DAO 顯著降至48.82±5.69 U/L（P＜0.05），緩解小鼠腸道屏障損傷。由于血清中D-乳酸是由腸道菌群無(wú)氧代謝葡萄糖形成的，除了腸道屏障受損影響血清中D-乳酸含量之外，腸道菌群的微生態(tài)平衡也影響D-乳酸含量[24]。血清中D-乳酸含量在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組間并沒(méi)有產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05）（圖4B），這可能跟小鼠腸道菌群狀態(tài)有關(guān)，因此無(wú)法直接說(shuō)明腸道屏障是否受損。

圖4 小鼠腸道屏障功能指標(biāo)Fig.4 Index of intestinal barrier function in mice

2.8 姜黃素微膠囊對(duì)腹瀉小鼠的干預(yù)機(jī)制

機(jī)體為了控制活性氧誘導(dǎo)自由基鏈反應(yīng)，形成了一套復(fù)雜的抗氧化防御體系，其中包括核因子NFE2 相關(guān)因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor2，Nrf2）[25]。小鼠腹瀉后，p-Nrf2 表達(dá)下調(diào)，經(jīng)過(guò)高劑量微膠囊灌胃后能夠顯著恢復(fù)小鼠p-Nrf2 表達(dá)活性（P＜0.05）（圖5B），結(jié)合SOD 和MDA 結(jié)果，高劑量微膠囊提升機(jī)體抗氧化能力的效果最好，證明了高劑量微膠囊通過(guò)上調(diào)Nrf2 蛋白表達(dá)提升機(jī)體氧化應(yīng)激能力的作用。醌氧化還原酶1（NAD（P）HN:quinone oxidoreductase 1，NQO1）通過(guò)維持泛醌和α-生育酚醌的還原形式保護(hù)內(nèi)源性抗氧化劑，而Nrf2 是NQO1表達(dá)的中心控制因子[26]。血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）主要催化血紅素分解，位于Nrf2下游，是一種重要的抗氧化酶[27]。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蛋白NQO1 和HO-1 沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）可能是由于此類(lèi)腹瀉模型與灌胃樣品不通過(guò)醌類(lèi)和催化血紅素影響抗氧化作用（圖5C、圖5E）。Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap）可與Nrf2 結(jié)合從而負(fù)調(diào)控Nrf2 轉(zhuǎn)錄活性[28]。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蛋白Keap-1 沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），可能是因?yàn)镵eap1 只是Nrf2 的結(jié)合位點(diǎn)之一，微膠囊樣品可能通過(guò)其他結(jié)合方式激活Nrf2 調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激功能，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究（圖5D）。

圖5 小鼠腸道Nrf2 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)豐度Fig.5 Abundances of the intestinal Nrf2 signaling pathway-related proteins in mice

腸道氧化應(yīng)激會(huì)通過(guò)多種途徑破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接狀態(tài)，導(dǎo)致腸上皮屏障功能受損和腸道通透性增加，提升氧化應(yīng)激能力也是維持機(jī)體腸道屏障的重要途徑[29]。緊密連接蛋白是腸道機(jī)械屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，包括跨膜蛋白Occludin 和Claudin，以及細(xì)胞質(zhì)蛋白ZO-2 等，用于維持腸道細(xì)胞旁通透性，防止大分子有毒物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞旁連接入侵機(jī)體[30-31]。小鼠腹瀉后，ZO-2 表達(dá)顯著下降（P＜0.05），經(jīng)非微膠囊和微膠囊樣品灌胃后，ZO-2 表達(dá)量有效回復(fù)，說(shuō)明非微膠囊和微膠囊樣品成分對(duì)緊密連接蛋白均能起一定作用（圖6C）。實(shí)驗(yàn)組對(duì)跨膜蛋白o(hù)ccludin 和claudin沒(méi)有顯著作用（P＞0.05）（圖6A、圖6B），可能是因?yàn)榉瑸a葉誘導(dǎo)的腹瀉模型主要細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白ZO-2 起作用，姜黃素微膠囊也是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ZO-2 起到恢復(fù)腸道屏障的作用[32]。結(jié)合高劑量微膠囊對(duì)DAO的抑制作用，表明高劑量微膠囊能一定程度改善小鼠腸道細(xì)胞質(zhì)緊密連接蛋白，干預(yù)DAO 釋放至血清。

圖6 小鼠腸組織緊密連接蛋白表達(dá)豐度Fig.6 Abundances of the intestinal tight junction proteins in mice

Toll 樣受體4（TLR4）在腸道中可特異性識(shí)別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式[33]。MyD88、IRAK1、TRAF6、p-NF-κB 是TLR4 信號(hào)通路下游分子，其中NF-κB 是調(diào)控促炎因子產(chǎn)生的重要核轉(zhuǎn)錄因子[34]。小鼠腹瀉后TLR4 和p-NF-κB 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），高濃度微膠囊有效降低TLR4、MyD88、p-NF-κB 表達(dá)活性（圖7），這與炎癥指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果一致，而實(shí)驗(yàn)組對(duì)IRAK1 和TRAF6 沒(méi)有顯著作用（P＞0.05），表明微膠囊樣品是通過(guò)TLR4/NF-κB 通路抑制炎癥因子釋放，調(diào)控腹瀉小鼠炎癥反應(yīng)。

圖7 小鼠腸組織Toll 樣受體4（TRL4）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)豐度Fig.7 Abundances of the intestinal Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway-related proteins in mice

3 結(jié)論

本研究采用單因素變量法結(jié)合正交試驗(yàn)確定了銳孔法制備姜黃素微膠囊的最佳工藝條件，海藻酸鈉、海綿膠煤炱菌多糖、姜黃素、吐溫80、CaCl2濃度分別為2.5%、0.15%、0.4%、0.3%、2.0%，包埋時(shí)間1.5 h，此條件下制備的姜黃素微膠囊包埋率高達(dá)92.26%。制備出的姜黃素微膠囊產(chǎn)品結(jié)構(gòu)完整，顆粒飽滿(mǎn)。

采用灌胃番瀉葉誘導(dǎo)的腹瀉小鼠模型來(lái)檢測(cè)姜黃素微膠囊的作用效果。試驗(yàn)結(jié)果表明工藝優(yōu)化后的姜黃素微膠囊能通過(guò)TRL4/NF-κB 通路提升機(jī)體氧化應(yīng)激能力，降低促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6 并促進(jìn)抗炎因子IL-10 釋放；通過(guò)Nrf2 信號(hào)通路提升小鼠腸道抗氧化性，促進(jìn)超氧化物歧化酶SOD 生成，抑制丙二醛MDA 生成；最終在抗氧化和抗炎的共同作用下維持小鼠腸道屏障，降低小鼠腹瀉指數(shù)，緩解小鼠腹瀉程度，證實(shí)了姜黃素微膠囊干預(yù)小鼠腹瀉的效果，并研究了微膠囊的作用機(jī)理，為姜黃素微膠囊干預(yù)腹瀉制劑的推廣應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。