呂晨豪，李俊健，陳昶安，何致霖，杜 冰,2，黎 攀,2,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

衰老（Aging）是生物學(xué)中機(jī)理最復(fù)雜的現(xiàn)象之一[1]。隨著機(jī)體的衰老，細(xì)胞對(duì)外部和內(nèi)部損傷的調(diào)節(jié)能力逐漸減弱，多種生物活動(dòng)也出現(xiàn)生理性的減少[2-3]，是一種隨著年齡增長(zhǎng)而必然發(fā)生的、不可逆轉(zhuǎn)的一種機(jī)體退化的過(guò)程[4]。有研究指出[5]，過(guò)量的自由基可使細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，影響機(jī)體的正常生理功能，從而導(dǎo)致機(jī)體加速衰老。因此，提高機(jī)體的抗氧化活性對(duì)延緩衰老具有重要作用，而植物源的天然抗氧化劑是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，利用植物提取物研發(fā)具有抗氧化功效的食品和保健品具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，是一種藥食同源的中藥，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”[6]。廣陳皮也被稱為新會(huì)陳皮，傳統(tǒng)認(rèn)為新會(huì)陳皮為道地藥材，品質(zhì)最為優(yōu)良[7]。廣陳皮提取物中的多甲氧基黃酮含量最高，相比其他陳皮有著更好的抗氧化和抗炎活性[8]。黃酮類化合物具有多種抗氧化活性，柑橘果皮因富含黃酮等物質(zhì)具有比果肉更強(qiáng)的抗氧化活性[9]，且柑橘果皮的自由基清除能力與黃酮之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性[10]。據(jù)報(bào)道，補(bǔ)充黃酮類物質(zhì)可以有效降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的水平，提高動(dòng)物體內(nèi)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等抗氧化酶的活力[11]。以上研究結(jié)果表明陳皮具有一定的抗氧化活性，其體外抗氧化活性已被1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH）自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力、氧化自由基吸收能力等實(shí)驗(yàn)所證明[12-14]。

研究表明經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后可以有效提高植物源提取物中多種功效物質(zhì)的釋放，如黃酮、多酚等，可提高機(jī)體抗氧化活性。乳酸芽孢桿菌DU-106 具有良好的產(chǎn)左旋乳酸性能[15]，本課題組成功將乳酸芽孢桿菌DU-106 應(yīng)用于巴戟天等中藥材發(fā)酵上，顯著提高了巴戟天的抗氧化活性，延長(zhǎng)了秀麗隱桿線蟲的壽命并改善了氧化損傷[16]。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans, C. elegans）是首個(gè)被完整測(cè)序的多細(xì)胞真核生物，形體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生命周期適中，繁殖能力強(qiáng)，有60%～80%的基因與人類同源，在衰老過(guò)程中體現(xiàn)出的運(yùn)動(dòng)能力下降、攝食減少、自由基積累等與人類衰老表現(xiàn)十分相似，因此線蟲已經(jīng)在衰老與壽命研究領(lǐng)域被廣泛使用[17-18]。楊雪妍[19]建立線蟲衰老模型，使用不同濃度的柑橘黃酮提取物對(duì)線蟲進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示川陳皮素在沒(méi)有影響線蟲生殖能力的基礎(chǔ)上，可顯著延長(zhǎng)線蟲正常和不良環(huán)境下的壽命，同時(shí)提升了抗氧化酶活性和降低了活性氧、丙二醛的水平，為柑橘黃酮提取物的抗衰老研究提出思路。鑒于此，本研究利用乳酸芽孢桿菌DU-106 對(duì)陳皮進(jìn)行發(fā)酵，比較陳皮發(fā)酵前后水提物中功效物質(zhì)總多酚、總黃酮和總糖及其清除自由基的能力的變化，此外，以秀麗隱桿線蟲為模式動(dòng)物，研究陳皮水提物的體內(nèi)抗氧化活性的變化，為陳皮的開(kāi)發(fā)研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮陳皮 取樣于廣東省江門市新會(huì)區(qū)，鑒定為茶枝柑Citrus reticulata cv. 'Chachiensis'品種；乳酸芽孢桿菌DU-106 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源與功能性原料研究及評(píng)價(jià)中心保藏；N2 秀麗隱桿線蟲和OP50大腸桿菌 美國(guó)秀麗隱桿線蟲遺傳中心；DPPH、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma 公司；丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活力測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（Catalase, CAT）活力測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所；胡桃醌（分析純）、鏈霉素硫酸鹽 上海源葉生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白砂糖 安琪酵母（赤峰）有限公司；氯化鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、氯化亞鐵、菲啰嗪、水楊酸、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸三鉀、福林酚 廣州化學(xué)試劑廠；瓊脂粉、胰蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JXFSTPR-32 全自動(dòng)樣品研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；MK-3 酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Labsystems 公司；BPH-9042 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；ALPHA 2-4 LD plus 凍干機(jī) 德國(guó)CHRIST公司；SZ760BLED 型體式顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式高壓滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 陳皮及發(fā)酵陳皮水提物的制備及主要成分測(cè)定

1.2.1.1 發(fā)酵陳皮水提物的制備 將陳皮切分、洗凈，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻后按陳皮質(zhì)量的兩倍加入無(wú)菌水，裝入泡菜壇中，再添加總質(zhì)量的2%食鹽和4%白砂糖攪拌均勻；按陳皮質(zhì)量的0.1%添加乳酸芽孢桿菌DU-106（菌粉濃度1012CFU/g），混勻，于25 ℃下密封發(fā)酵10 d，取陳皮固體樣品后在50 ℃恒溫下烘干至恒重，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

陳皮水提物的制備參考文獻(xiàn)[20]的方法略作修改，將烘干后的陳皮磨粉過(guò)40 目篩，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量，按料液比1:10（g/mL）于100 ℃恒溫水浴鍋熱水浸提1 h，4000 r/min 離心10 min 后收集上清液，濾渣重復(fù)加水抽提兩次，合并上清液，經(jīng)濃縮冷凍干燥后得陳皮水提物。其中未發(fā)酵陳皮水提物命名為WE （Water Extract），發(fā)酵陳皮水提物命名為FWE（Fermented Water Extract）。

1.2.1.2 總黃酮含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[21]采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=19.56X-0.0023 （R2=0.9998）。取1 mL 陳皮水提物上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方式依次加入試劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水提物的總黃酮含量。

1.2.1.3 總多酚含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[22]采用福林酚分光光度計(jì)法，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=183.68X+0.0022 （R2=0.996）。取1 mL 陳皮水提物上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方式依次加入試劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水提物的總多酚含量。

1.2.1.4 總糖含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[20]采用苯酚硫酸法，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=8.5148X+0.0204（R2=0.996）。取1 mL 陳皮水提物上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方式依次加入試劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水提物的總糖含量。

1.2.2 陳皮水提物體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.2.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[23]方法略作改動(dòng)，分別取1、2、3、4、5 mg/mL 濃度的樣品溶液1 mL 于試管中，加入1 mL 的DPPH 溶液，充分搖勻后，室溫避光靜置30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度。DPPH 自由基的清除率公式為：

式中：A2為樣品實(shí)驗(yàn)組吸光度；A1為用蒸餾水替代DPPH 溶液的對(duì)照組吸光度；A0為用蒸餾水與DPPH 溶液混合的空白組吸光度。

1.2.2.2 羥基自由基清除能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[24]方法略作改動(dòng)，分別取1、2、3、4、5 mg/mL 濃度的樣品溶液1 mL 于試管中，依次加入6 mmol/L 的FeSO4溶液和H2O2溶液各1 mL，搖勻后靜置10 min，再加入6 mmol/L 的水楊酸1 mL，搖勻后室溫避光靜置30 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度。羥基自由基的清除率公式為：

式中：A2為樣品實(shí)驗(yàn)組吸光度；A1為用蒸餾水替代水楊酸的對(duì)照組吸光度；A0為用蒸餾水替代樣品溶液的空白組吸光度。

1.2.2.3 亞鐵離子螯合能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[25]方法略作改動(dòng)，分別取1、2、3、4、5 mg/mL 濃度的樣品溶液1 mL 于試管中，依次加入蒸餾水3.7 mL、2 mmol/L 的FeCl2溶液0.1 mL 和5 mmol/L 的菲啰嗪溶液 0.2 mL，振蕩搖勻，室溫避光靜置10 min 后，5000 r/min 離心10 min，取上清液在562 nm 處測(cè)定吸光度。亞鐵離子螯合率公式為：

式中：A2為樣品實(shí)驗(yàn)組吸光度；A1用蒸餾水替代FeCl2的溶液對(duì)照組吸光度；A0為用蒸餾水替代樣品溶液的空白組吸光度。

1.2.2.4 總還原能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[25]方法略作改動(dòng)，分別取1、2、3、4、5 mg/mL 濃度的樣品溶液1 mL 于試管中，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和5%鐵氰化鉀溶液各1 mL，搖勻后50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸溶液1 mL；充分搖勻后3000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加入1 mL 的蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3溶液，搖勻后室溫靜置10 min，在700 nm 測(cè)其吸光度?？傔€原能力公式為：

式中：A2為樣品實(shí)驗(yàn)組吸光度；A1為用蒸餾水替代樣品溶液的空白組吸光度。

1.2.3 陳皮水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 線蟲培養(yǎng)、同期化和給藥途徑 線蟲的培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[26]方法略作修改。線蟲培養(yǎng)在線蟲生長(zhǎng)固體培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium, NGM）上進(jìn)行，稱取1.2 g 氯化鈉、8 g 瓊脂粉、1 g 胰蛋白胨、0.08 g 鏈霉素硫酸鹽于錐形瓶中，加入390 mL蒸餾水混勻密封后于滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌30 min，待培養(yǎng)液溫度降至65 ℃時(shí)，依次加入400 μL 1 mol/L CaCl2溶液、400 μL 1 mol/L MgSO4溶液、400 μL 5 mg/mL 的膽固醇以及10 mL 1 mol/L K3PO4緩沖液?；靹蚝?，在無(wú)菌條件下，趁熱分裝至培養(yǎng)皿中。每個(gè)平板加入100 μL 大腸桿菌OP50菌液作為線蟲食物，置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

線蟲同期化參考文獻(xiàn)[27]方法略作修改，采用高氯酸鈉漂白法，用1 mL M9 緩沖溶液將培養(yǎng)72 h左右的成蟲洗至無(wú)菌EP 管中，加1 mL 裂解液，反復(fù)振蕩3 min，3000 r/min 離心1 min，棄上清。再用1 mL M9 緩沖液沖洗線蟲，重復(fù)2 次。離心棄上清后用移液槍吸取EP 管底部蟲卵滴于平板的無(wú)菌區(qū)，約48 h 后蟲卵基本發(fā)育成L4 期幼蟲，完成同期化。

給藥途徑參考文獻(xiàn)[28]方法略作修改。配制1 mg/mL（低劑量組）、3 mg/mL（中劑量組）、5 mg/mL（高劑量組）的陳皮水提物（WE）和發(fā)酵陳皮水提物（FWE）溶液，分別命名為WE-1、WE-3、WE-5、FWE-1、FWE-3、FWE-5。過(guò)濾除菌后，與大腸桿菌OP50菌液（OD 值=1.0）等體積混勻，吸取100 μL涂布于NGM 平板上喂養(yǎng)線蟲。此條件下，藥物主要是通過(guò)線蟲攝食進(jìn)入線蟲體內(nèi)。

1.2.3.2 線蟲壽命測(cè)定 試驗(yàn)分為空白組（CD）和實(shí)驗(yàn)組，空白組以不含樣品提取物的OP50菌液涂布培養(yǎng)基，以此判定樣品效果。將蟲卵均勻加入至各組平板上，20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，得同期化后生長(zhǎng)至L4 期線蟲。每組平均挑取150 條同期化至L4 期的線蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將線蟲轉(zhuǎn)移至新的給藥NGM 平板上。從轉(zhuǎn)移當(dāng)天開(kāi)始記為0 d，每24 h 轉(zhuǎn)移線蟲至對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組新平板中，記錄每天線蟲的存活與死亡數(shù)，直至所有線蟲死亡。

1.2.3.3 線蟲熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)方法同壽命實(shí)驗(yàn)，挑選同期化后的L4 期的線蟲藥物干預(yù)4 d 后，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)高至35 ℃，此時(shí)設(shè)為0 h，每隔1 h 觀察記錄一次線蟲的存活情況，直至所有線蟲死亡。每組3 個(gè)平板，每個(gè)平板30 條線蟲。

1.2.3.4 線蟲氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)方法同壽命實(shí)驗(yàn)，挑選同期化后的L4 期的線蟲藥物干預(yù)4 d 后，每組平均挑取90 條線蟲，轉(zhuǎn)移至500 μmol/L 胡桃醌平板上。轉(zhuǎn)移后每30 min 記錄線蟲存活率（存活率（%）=存活條數(shù)/總條數(shù)×100），及時(shí)移走死亡線蟲，直至線蟲全部死亡。

1.2.3.5 線蟲運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[27]方法略有改動(dòng)。在線蟲壽命第5、10、15 d 時(shí)，觀察線蟲運(yùn)動(dòng)能力，運(yùn)動(dòng)能力可分為三個(gè)等級(jí)：線蟲自發(fā)運(yùn)動(dòng)，不需要觸碰刺激，記為狀態(tài)A；線蟲必須受到觸碰刺激才運(yùn)動(dòng)，記為狀態(tài)B；線蟲受到觸碰刺激后只擺動(dòng)頭部和尾部，記為狀態(tài)C。此外，在線蟲壽命第5、10、15 d，每組隨機(jī)觀察10 條線蟲在30 s 內(nèi)的頭部擺動(dòng)頻率，重復(fù)三次。

1.2.3.6 線蟲產(chǎn)卵量測(cè)定 每實(shí)驗(yàn)組5 個(gè)平板，每個(gè)平板單獨(dú)飼養(yǎng)2 條L4 期線蟲，此時(shí)記為第一天，每24 h 將線蟲轉(zhuǎn)移至新平板上，直至線蟲停止產(chǎn)卵。所有平板在20 ℃下繼續(xù)孵化，48 h 后計(jì)算每個(gè)平板上子代數(shù)目。

1.2.3.7 抗氧化酶活性測(cè)定 挑選L4 期線蟲至各組平板，干預(yù)4 d 后使用M9 緩沖液沖洗收集各組線蟲至離心管中，于1000 r/min 離心3 min，收集上清液。根據(jù)試劑盒中的操作方法對(duì)線蟲體內(nèi)MDA 含量、SOD 活力、CAT 活力和GSH 含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果通過(guò)蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用BCA 法，得到回歸方程為A=1.0555x+0.1031（R2=0.9986）。

1.2.3.8 線蟲體內(nèi)活性氧（ROS）含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[29]方法稍作修改。線蟲培養(yǎng)96 h 后用M9 緩沖液清洗三遍，加入研磨珠后冷凍研磨，4000 r/min離心1 min，取上清液50 μL 于96 孔板中，加入50 μL 100 μmol/L 的H2DCF-DA，避光混勻，在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm 的酶標(biāo)儀下每20 min 進(jìn)行一次熒光強(qiáng)度測(cè)定，連續(xù)測(cè)定2 h，并以上清液蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件、Prism 9 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)線蟲壽命的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及對(duì)線蟲抗氧化相關(guān)生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示顯著差異，P＜0.01 表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳皮水提物的成分分析

陳皮發(fā)酵前后水提物主要成分含量如表1 所示，F(xiàn)WE 總黃酮和總多酚含量顯著高于WE（P＜0.05），但總糖含量顯著低于WE，說(shuō)明乳酸發(fā)酵能夠提升陳皮水提物中總黃酮和總多酚的含量，而這些物質(zhì)的增加可能與陳皮水提物抗氧化活性的提升有關(guān)[30]。另外，總糖含量的下降與乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中大量消耗糖類物質(zhì)有關(guān)。

表1 陳皮發(fā)酵前后水提物主要成分含量Table 1 Content of the main components of PCR water extracts before and after fermentation

2.2 陳皮水提物體外抗氧化活性

DPPH 自由基清除率由圖1A 所示，發(fā)酵前后水提物對(duì)DPPH 自由基的清除能力在1～5 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)均具有上升趨勢(shì)，且呈現(xiàn)出劑效關(guān)系。FWE 在5 mg/mL 的濃度時(shí)清除能力達(dá)到最高，達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照VC的94.65%，且FWE 的DPPH 自由基清除能力優(yōu)于WE，毛傳亮等[31]通過(guò)研究青錢柳葉提取物抗氧化活性與黃酮含量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黃酮含量與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)，與羥基自由基清除率呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明黃酮類化合物可能是其中主要的抗氧化成分之一。乳酸芽孢桿菌發(fā)酵能夠提升陳皮水提物中的黃酮含量，這可能是FWE 組具有更強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力的原因，表明乳酸發(fā)酵有助于提高陳皮的抗氧化性。

圖1 陳皮水提物的體外抗氧化活性Fig.1 In vitro antioxidant activity of PCR water extracts

羥基自由基是一種具有強(qiáng)氧化能力的活性氧，能穿透細(xì)胞膜刺激蛋白質(zhì)、碳水化合物等生物大分子，從而產(chǎn)生不同反應(yīng)造成機(jī)體產(chǎn)生損傷[32]。由圖1B可得，隨著濃度的增大，F(xiàn)WE 和WE 對(duì)羥基自由基的清除率呈上升趨勢(shì)，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。FWE 在5 mg/mL 時(shí)效果達(dá)到VC的59.11%；WE 在5 mg/mL 時(shí)效果達(dá)到VC的53.38%，表明通過(guò)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵能進(jìn)一步提升陳皮水提物的抗氧化活性。

亞鐵離子的螯合率由圖1C 所示，以EDTA 為陽(yáng)性對(duì)照，EDTA 螯合率維持在83%左右，螯合能力顯著高于兩種陳皮水提物；兩種水提物均具有一定的亞鐵離子螯合能力，且體現(xiàn)出了明顯的濃度依賴性；隨著濃度的增大，F(xiàn)WE 的螯合率由8.65%升至49.49%，WE 的螯合率由6.14%升至32.58%；在同一濃度下FWE 的螯合能力均比WE 高。因此，通過(guò)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵能夠提升陳皮水提物的螯合能力，增強(qiáng)其抗氧化的能力。

總還原能力是抗氧化活性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。不同濃度的水提物總還原能力如圖1D 所示。隨著反應(yīng)濃度的增加，F(xiàn)WE 和WE 的還原能力都在逐漸增強(qiáng)，并表現(xiàn)出了劑效關(guān)系；在同一濃度下，F(xiàn)WE 的還原能力高于WE。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，在5 mg/mL 的濃度下，F(xiàn)WE 的吸光值為0.54，達(dá)到VC的35.76%；WE 的吸光值為0.34，達(dá)到VC的22.52%。這表明發(fā)酵后的陳皮水提物放出的電子更多，具備更強(qiáng)的還原能力，具有被開(kāi)發(fā)成天然抗氧化劑的潛力。

2.3 陳皮水提物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命及衰老生理指標(biāo)的影響

2.3.1 陳皮水提物對(duì)線蟲壽命的影響 線蟲的壽命分析是線蟲抗氧化研究中最為直觀的一項(xiàng)指標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)條件下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命影響的生存率曲線如圖2，相關(guān)的存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如表2。與空白組相比，使用1、3、5 mg/mL 三個(gè)劑量的水提物處理線蟲，可以使線蟲的生存率曲線明顯右移；線蟲飼喂低劑量和中劑量的水提物后，平均壽命上升至16.41 d左右，最大壽命上升至23 d 以上，與空白組產(chǎn)生顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)線蟲飼喂5 mg/mL 的高劑量水提物后，F(xiàn)WE 組平均壽命為(20.67±1.20) d，WE 組平均壽命為(19.02±0.56) d，與空白組相比分別顯著延長(zhǎng)了28.34%和39.47%，但FWE 組最大壽命顯著高于WE 組，比WE 組延長(zhǎng)了13.85%（P＜0.05）。分析結(jié)果表明，飼喂水提物可以顯著延長(zhǎng)線蟲的壽命，壽命與樣品濃度之間有明顯的劑效關(guān)系，并且發(fā)酵陳皮水提物效果較陳皮水提物效果更為顯著。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)條件下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命的影響Fig.2 Effects of PCR water extracts on the lifespan of C. elegans under standard conditions

表2 標(biāo)準(zhǔn)條件下線蟲存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 2 Statistical analysis of C. elegans survival time under standard conditions

2.3.2 陳皮水提物對(duì)線蟲抗逆性的影響

2.3.2.1 熱應(yīng)激下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命的影響大量研究表明，線蟲壽命的提高通常與線蟲抗逆能力提高有關(guān)，35 ℃的高溫會(huì)引起線蟲體內(nèi)代謝紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧，從而引起氧化應(yīng)激降低壽命，因此抗熱應(yīng)激能力的高低成為了線蟲抗氧化活性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。熱應(yīng)激下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命影響的生存率曲線如圖3，相關(guān)的存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如表3。由圖3 可以看出，在35 ℃熱應(yīng)激環(huán)境下，經(jīng)過(guò)水提物飼喂的線蟲存活率曲線都有明顯右移，說(shuō)明兩種陳皮水提物均具有提高線蟲抗熱應(yīng)激能力的作用，且FWE 組的生存曲線較WE 組右移更明顯。另外，劉佳[33]發(fā)現(xiàn)蒲公英總黃酮對(duì)熱應(yīng)激線蟲的壽命也存在延長(zhǎng)作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。飼喂低中劑量的FWE 和WE 后，線蟲平均壽命和最大壽命都出現(xiàn)了不同程度的提高；而飼喂FWE-5 的線蟲平均壽命和最大壽命可達(dá)7.08±0.17 d 和9.34±0.00 d，比空白組線蟲提高了19.39%和22.89%，兩者均顯著高于空白組線蟲（P＜0.05），且FWE-5 組的抗熱應(yīng)激能力最強(qiáng)，整體趨勢(shì)與壽命實(shí)驗(yàn)一致。結(jié)果表明乳酸發(fā)酵陳皮水提物的抗氧化活性的提升能夠起到間接提高線蟲抵抗熱應(yīng)激能力的作用，這可能也是有效延長(zhǎng)線蟲存活時(shí)間的原因。

圖3 熱應(yīng)激下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命的影響Fig.3 Effects of PCR water extracts on the lifespan of C. elegans under heat stress

表3 熱應(yīng)激下線蟲存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 3 Statistical analysis of C. elegans survival time under heat stress

2.3.2.2 氧化應(yīng)激下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命的影響

氧化應(yīng)激下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命影響的生存率曲線如圖4，相關(guān)的存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如表4。從圖4 的曲線中可以看出，飼喂樣品后的線蟲生存率曲線明顯右移，說(shuō)明水提物溶液具有明顯的抵抗胡桃醌的氧化應(yīng)激能力。空白組線蟲的平均壽命和最大壽命分別為1.23±0.06 h 和1.70±0.00 h，飼喂低、中、高三個(gè)劑量樣品的線蟲平均壽命和最大壽命均和空白組有顯著差異（P＜0.05），壽命的延長(zhǎng)與樣品的濃度有著一定的正向相關(guān)性；其中飼喂FWE-5 的線蟲相比于空白組平均壽命可提高117.89%，最大壽命可提高152.94%，同時(shí)也顯著高于飼喂WE-5 的線蟲壽命（P＜0.05）。結(jié)果表明，發(fā)酵和未發(fā)酵陳皮水提物均能提高線蟲抵抗胡桃醌誘導(dǎo)急性氧化應(yīng)激的能力，并且發(fā)酵水提物的效果更為顯著，且對(duì)線蟲抗氧化應(yīng)激能力的影響要強(qiáng)于對(duì)線蟲抗熱應(yīng)激能力的影響。

圖4 氧化應(yīng)激下陳皮水提物對(duì)線蟲壽命的影響Fig.4 Effects of PCR water extracts on the lifespan of C. elegans under oxidative stress

表4 氧化應(yīng)激下線蟲存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 4 Statistical analysis of C. elegans survival time under oxidative stress

2.3.3 陳皮水提物對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響 線蟲運(yùn)動(dòng)能力的下降一般代表著機(jī)體的衰老和肌肉的退化，運(yùn)動(dòng)行為也被用作反映神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能[34]。如圖5 和圖6，實(shí)驗(yàn)觀察了線蟲生命早、中、晚期（分別為第5、10、15 d）的自發(fā)運(yùn)動(dòng)情況和頭擺頻率。第5 d時(shí)，所有組別線蟲都保持在運(yùn)動(dòng)A 的狀態(tài)，飼喂水提物的線蟲頭擺頻率均顯著高于空白組，說(shuō)明水提物能在一定程度上提高線蟲的運(yùn)動(dòng)能力。第10 d 時(shí)，空白、WE-1、WE-3 和FWE-1 等四個(gè)組別開(kāi)始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)B 狀態(tài)，所有組別暫未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)C 狀態(tài)；頭擺頻率較第5 d 均有不同程度的下降，但是飼喂樣品的所有組別均顯著高于空白組。第15 d 時(shí)，空白組中有25%線蟲處于運(yùn)動(dòng)C 狀態(tài)，而FWE-5 組還有90%線蟲處于運(yùn)動(dòng)A 或B 狀態(tài)，顯著高于空白組，同時(shí)也優(yōu)于WE-5 組；頭擺頻率FWE-5 組可達(dá)40 次/30 s，較空白組高135.29%，較WE-5 組高17.65%。結(jié)果表明，水提物在提高線蟲壽命的前提下，還能顯著改善線蟲的運(yùn)動(dòng)能力，在同一劑量下，飼喂FWE 對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響優(yōu)于WE。

圖5 陳皮水提物對(duì)線蟲自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.5 Effects of PCR water extracts on spontaneous motility of C. elegans

圖6 陳皮水提物對(duì)線蟲頭擺頻率的影響Fig.6 Effects of PCR water extracts on the frequency of C.elegans head pendulum

2.3.4 陳皮水提物對(duì)線蟲產(chǎn)卵量的影響 有報(bào)道指出秀麗線蟲的壽命與生殖能力之間存在“利弊權(quán)衡”，即壽命的延長(zhǎng)將以降低或喪失生殖能力為代價(jià)[35]；同時(shí)也有報(bào)道指出多酚類物質(zhì)可以延長(zhǎng)線蟲壽命而不影響生殖能力[36]。因此，研究陳皮水提物在延長(zhǎng)線蟲壽命的前提下，是否會(huì)降低其生殖能力顯得尤為重要。為了研究水提物對(duì)線蟲生殖能力的影響，通過(guò)對(duì)總產(chǎn)卵量的計(jì)數(shù)，如圖7 所示，空白組和實(shí)驗(yàn)組總產(chǎn)卵量都在200 條左右，飼喂不同濃度的水提物沒(méi)有使線蟲產(chǎn)卵量有顯著變化，說(shuō)明水提物在提高線蟲壽命的基礎(chǔ)上不會(huì)對(duì)其生殖能力有影響。

圖7 陳皮水提物對(duì)線蟲產(chǎn)卵量的影響Fig.7 Effects of PCR water extracts on C. elegans egg production

2.3.5 陳皮水提物對(duì)線蟲體內(nèi)抗氧化酶系及丙二醛含量的影響 MDA 是生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用為生物體氧化損傷的指標(biāo)[37]；如圖8A 所示，飼喂水提物后的線蟲具有更低的MDA含量，與空白組相比有顯著差異（P＜0.05）；其中飼喂低、中劑量組的FWE 和WE 線蟲之間MDA 含量差異不顯著（P＞0.05），高劑量組之間有顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)WE-5 組的MDA 含量最低，較空白組和WE-5 組分別下降了66.64%和20%，說(shuō)明陳皮的水提物能在一定程度上抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，且乳酸發(fā)酵能夠提升水提物抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力，抑制程度與水提物濃度成正相關(guān)。

圖8 陳皮水提物對(duì)線蟲抗氧化防御體系的影響Fig.8 Effects of PCR water extracts on the antioxidant defence system of C. elegans

SOD 和CAT 是線蟲體內(nèi)主要的抗氧化酶，提高SOD 活力有助于催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，提高CAT 活力則能夠催化H2O2生成水，在此反應(yīng)過(guò)程可以清除線蟲體內(nèi)多余的自由基，減少氧化損傷[38]。如圖8B 和圖8C 所示，飼喂不同劑量的水提物均能顯著提高SOD 和CAT 酶活力，其中FWE-5 和FWE-3 組的SOD 活力與WE-5 和WE-3 組有顯著差異（P＜0.05），而FWE 組所有劑量的CAT 酶活力均與WE 組有顯著差異（P＜0.05）。其中FWE-5 組的SOD 和CAT 酶活力最高，相比WE-5 組分別提升了11.50%和23.11%。

GSH 是一種低分子清除劑，GSH 的量是衡量線蟲抗氧化活性大小的重要因素[39]。如圖8D 所示，飼喂水提物能顯著提高GSH 的含量，最高的FWE-5 組比空白組高出53.52%，但中、高劑量下FWE 和WE 組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。以上數(shù)據(jù)表明線蟲攝入水提物均能在一定程度上提高其抗氧化活性，在激活線蟲抗氧化防御體系方面FWE 比WE 顯示出了更大的潛力。

2.3.6 陳皮水提物對(duì)線蟲體內(nèi)活性氧自由基積累量的影響 機(jī)體由于正常衰老或受不良環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，導(dǎo)致ROS 與抗氧化酶失衡，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)和DNA 等物質(zhì)結(jié)構(gòu)，加速機(jī)體衰老和凋亡[38]。由圖9 可知，在反應(yīng)的120 min內(nèi)，線蟲體內(nèi)的ROS 水平隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第100 min 后趨于穩(wěn)定；經(jīng)飼喂不同濃度的水提物后，線蟲可顯著改善ROS 異常積累。與空白組相比，F(xiàn)WE 組的低、中、高劑量分別降低了32.43%、48.65%、62.16%的ROS 相對(duì)含量；WE 組的低、中、高劑量則分別降低25.41%、45.94%、54.05%。以上結(jié)果表明，水提物可以有效清除線蟲體內(nèi)的ROS，清除效率與水提物濃度具有依賴性，在同一濃度下，F(xiàn)WE 的ROS 清除效果優(yōu)于WE，該結(jié)果與抗氧化防御體系分析一致。路璐璐[40]的研究表明毛蕊異黃酮可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體清除活性氧自由基的能力，提高機(jī)體的抗氧化活性，從而延長(zhǎng)線蟲的壽命，由此推測(cè)發(fā)酵后陳皮水提物清除活性氧自由基能力的提升可能與其中黃酮含量的提升有關(guān)。

圖9 陳皮水提物對(duì)線蟲體內(nèi)ROS 積累量的影響Fig.9 Effects of PCR water extracts on the accumulation of ROS in C. elegans

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用了DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率、亞鐵離子螯合能力和總還原能力4 個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)陳皮水提物的體外抗氧化活力，結(jié)果表明，在最高劑量下，發(fā)酵后的陳皮水提物較未發(fā)酵的陳皮水提物在DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率、亞鐵離子螯合能力和總還原能力4 個(gè)指標(biāo)上分別提升了16.65%、10.73%、51.88%和59.23%。因此，陳皮水提物具有良好的體外抗氧化活性，且經(jīng)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵后的陳皮水提物（FWE）的抗氧化活性優(yōu)于發(fā)酵前陳皮水提物（WE）。乳酸芽孢桿菌發(fā)酵還提高了陳皮水提物的體內(nèi)抗氧化活性和對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗衰老功效。與空白對(duì)照組相比，兩種水提物均能提高秀麗隱桿線蟲壽命和改善抗逆性，提高運(yùn)動(dòng)能力的同時(shí)不影響生殖能力，提升線蟲體內(nèi)抗氧化防御體系和減少活性氧自由基的積累，并且發(fā)酵后的陳皮水提物具有更加顯著的效果，說(shuō)明乳酸芽孢桿菌發(fā)酵提高了陳皮的體內(nèi)抗氧化活性以及對(duì)秀麗隱桿線蟲的抗衰老功效。

本研究初步表明陳皮可作為天然的食品抗氧化劑加以開(kāi)發(fā)利用，為以后陳皮在功能食品方面的進(jìn)一步研究提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考，但是其產(chǎn)生抗氧化作用的具體作用機(jī)制較為復(fù)雜，還需要后續(xù)更進(jìn)一步的研究。