鄧 龍，周 思 ，黃佳佳，曾上敏，張靜文

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520；2.廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440）

乳及乳制品營養(yǎng)豐富，是人們生活中的重要食品之一。生乳作為配方乳粉、液體乳及其他乳制品的主要原料，其質(zhì)量安全問題向來是消費者和行業(yè)關(guān)注的焦點。研究表明，包括生乳在內(nèi)的動物源性食品不僅受到獸藥殘留、金屬元素等危害因素的影響，還面臨著農(nóng)藥殘留的污染等問題[1]。我國作為農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥用量大、利用率低等問題普遍。環(huán)境中的農(nóng)藥殘留通過食物、飲水、殺蟲、環(huán)境接觸等途徑進(jìn)入動物體內(nèi)，易在脂肪含量較高的乳類等產(chǎn)品中蓄積，通過食物鏈持續(xù)影響人類健康[2-3]。對此，食品法典委員會、歐盟等制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)以降低其對健康造成的風(fēng)險[4-5]。我國GB 2763-2021 規(guī)定了生乳中125 種農(nóng)藥殘留的最大限量，涉及檢驗方法25 項[6]。存在操作復(fù)雜、項目不全、檢出限高于限量值等問題，限量標(biāo)準(zhǔn)配套方法尚不完善[7-8]。文獻(xiàn)報道動物源性食品中農(nóng)殘檢測多為肉及其制品、水產(chǎn)品、雞蛋等[9-11]，有關(guān)生乳的檢測項目少、種類單一[10,12]，難以滿足生乳中農(nóng)藥多殘留快速篩查的要求[12]。因此，建立生乳中農(nóng)藥多殘留快速檢測方法對保障乳制品食品安全具有現(xiàn)實意義。

生乳中農(nóng)藥多殘留檢測面臨兩大挑戰(zhàn)：a. 目標(biāo)物種類多，性質(zhì)差異大，用同一種方法難以獲得好的回收率；b. 含量水平低，基質(zhì)效應(yīng)強，前處理復(fù)雜，生乳不易保存、時效性要求高[13]。傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取處理步驟多、操作繁瑣[14-15]，QuEChERS 影響因素多、方法摸索耗時長[16-17]、凝膠色譜需專用設(shè)備[18]等，簡單、高效的樣品前處理方法有待進(jìn)一步研究[19]。固相支撐液液萃?。╯upported liquid extraction，SLE）是1997 年Johnson 團(tuán)隊提出的一種新型的樣品前處理技術(shù)[20]。以均勻多孔材料為支撐介質(zhì)，吸附水性樣品形成理想的液膜萃取界面，加入與水不相溶的洗脫溶劑后，溶劑與樣本之間形成連續(xù)的濃度差，從而實現(xiàn)目標(biāo)物的高效萃取，萃取流程見圖1。SLE 在生物樣本中藥物、環(huán)境污染物、煙草及其代謝物的檢測中應(yīng)用廣泛[21-25]。SLE 本質(zhì)是液液萃取，但克服了傳統(tǒng)液液萃取效率低、易乳化等缺點，且操作十分簡單，只需上樣和洗脫兩個步驟。在水系樣本有機物萃取方面優(yōu)勢明顯，可用于生乳中農(nóng)藥多殘留樣品的前處理，在農(nóng)藥殘留方面的應(yīng)用暫無相關(guān)報道。

圖1 SLE 實驗流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental procedures of SLE

本研究以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《禁限用農(nóng)藥名錄》中32 種高風(fēng)險禁限用農(nóng)藥殘留為目標(biāo)物，采用固相支撐液液萃取進(jìn)行樣品前處理，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在多殘留分析中靈敏度高、速度快、抗干擾能力強的優(yōu)勢[10-12]，建立生乳中32 種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，為動物源性樣品中農(nóng)藥多殘留的檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32 種農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品 100 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；乙腈、甲酸銨、甲酸 LC-MS 級，德國Merck 公司；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯 HPLC級，德國Merck 公司；去離子水 18.0 MΩ·cm，由Milli-Q 去離子水發(fā)生器制備；生乳樣品 采自本地乳品生產(chǎn)企業(yè)及鮮乳配送點，4 ℃冷藏保存。

ACQUITY Xevo TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、Wat200609 固相萃取裝置 美國Waters 公司；IKA MS3 漩渦混合器 德國IKA 公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；N-EVAP112氮吹濃縮儀 美國Organomation 公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器 美國Millipore 公司；SLE 萃取柱 3 mL美國Agilent 公司；Mini-UniPrep 聚四氟乙烯非針式過濾器 0.2 μm 英國Whatman 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確吸取0.1 mL 單標(biāo)溶液于10 mL 容量瓶，乙腈定容至刻度，配制成1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用生乳空白基質(zhì)溶液稀釋為0.2、1、2、5、10、20、50 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）混勻的生乳樣品，注入裝有1.5 mL 乙腈的離心管，渦旋混勻，4000 r/min 離心5 min，取上清液。樣品沉淀加入0.5 mL 水沖洗，合并清液，轉(zhuǎn)移至SLE 小柱，等待5 min。用4.5 mL 二氯甲烷洗脫2 次，待無液滴落下后抽真空5 s，洗脫液氮吹至近干，用20%乙腈甲酸（0.1%）水溶液定容至0.5 mL，非針式過濾器過濾。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A 為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L 甲酸銨），B 為0.1%甲酸乙腈（含5 mmol/L 甲酸銨），梯度洗脫程序：0～2 min，20% B；2～13 min，B 升至100%；13～15 min，保持100% B；15～16 min，B 降至20%；16～18 min，保持20% B；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），氟蟲腈為負(fù)離子模式，其余31 種為正離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；各化合物參考保留時間、監(jiān)測離子、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 32 種目標(biāo)物的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass parameters of target compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法和控制變量法優(yōu)化實驗條件。應(yīng)用儀器配套Masslynx 工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，導(dǎo)出數(shù)據(jù)使用Origin 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。前處理和分析條件優(yōu)化中實驗重復(fù)測試3 次取均值，回收率與精密度實驗重復(fù)測試6 次計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理條件優(yōu)化

生乳含有大量的蛋白、脂肪和磷脂等物質(zhì)，易殘留在液質(zhì)系統(tǒng)中，改變分析物峰型，增加色譜柱壓力，影響離子化效率，上機測試前應(yīng)盡量去除[26]，固相支撐液液萃取以改性多孔材料為支撐，表面活性低、比表面積大，可形成微孔液膜實現(xiàn)目標(biāo)物的高效萃取。同時，保留樣本中的磷脂、蛋白等干擾物，有效減少基質(zhì)干擾[27]。SLE 只有上樣和洗脫兩個步驟，上柱樣本狀態(tài)及洗脫液的選取是影響實驗的關(guān)鍵因素[25]。上樣前對樣本進(jìn)行稀釋、調(diào)酸堿度、沉淀蛋白等預(yù)處理可以獲得更好的萃取與凈化效果[23]。生乳含有大量蛋白直接上柱易造成柱子堵塞影響柱效，采用有機試劑沉淀蛋白后上柱，可大幅降低樣品中的蛋白含量，且水溶性有機溶劑的加入可改善部分極性化合物萃取率[28]。實驗比較了甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈三種溶劑的沉淀效果，乙腈沉淀效果優(yōu)于甲醇，少量酸的加入有利于穩(wěn)定酸性農(nóng)藥但不利于蛋白沉淀，故選擇乙腈為沉淀劑。比較加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL 乙腈的沉淀效果，不同體積乙腈沉淀效果見圖2，當(dāng)加入體積達(dá)到1.5 mL，離心后樣本呈澄清狀態(tài)，且最終回收率在60%～120%之間，符合GB/T 27404 對回收率的要求，故選擇1.5 mL 乙腈進(jìn)行沉淀。此外，將生乳樣品注入乙腈中，可以讓樣本與溶劑充分接觸，沉淀效果更好。

圖2 不同乙腈用量對生乳樣品的沉淀效果Fig.2 Precipitation effect of different acetonitrile volumes on raw milk samples

2.2 萃取柱條件優(yōu)化

固相支撐液液萃取的本質(zhì)是目標(biāo)物在兩相中的分配，32 種目標(biāo)化合物中含有機磷、氨基甲酸酯、磺酰脲、苯基吡唑等多類化合物，油水分配系數(shù)差異大，洗脫溶劑的選擇需充分考慮目標(biāo)物的極性和溶解度。實驗考察乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、正己烷四種常用溶劑的洗脫效果。結(jié)果表明，正己烷極性小，對苯線磷、涕滅威、久效磷等水溶性較好的農(nóng)藥洗脫效果不佳。乙腈極性大，與水性樣本互溶，容易造成樣品穿漏，影響凈化效果。乙酸乙酯洗脫甲基異柳磷、蠅毒磷、氟蟲腈回收率低于20.0%，二氯甲烷對各目標(biāo)化合物的回收率均較理想，平均回收率為69.4%～113.6%，故選擇二氯甲烷作為洗脫溶劑。進(jìn)一步優(yōu)化洗脫溶劑用量，考察溶劑體積分別為柱容量2、3、4 倍時的洗脫效果，加標(biāo)濃度為10 μg/kg 時總體回收率比較見圖3。由圖可知，當(dāng)體積達(dá)到9 mL時全部目標(biāo)物回收率均超過60.0%，平均回收率為89.8%，繼續(xù)增加溶劑體積總體回收率增幅不明顯，基于后續(xù)操作及環(huán)保考慮不再增加溶劑用量。根據(jù)分配定律，同樣體積的溶劑多次萃取比單次萃取效率高，比較9 mL×1 和4.5 mL×2 洗脫效果，結(jié)果與理論一致，最終選擇用4.5 mL 二氯甲烷洗脫2 次。

圖3 目標(biāo)化合物回收率與洗脫溶劑用量的關(guān)系Fig.3 Relationship between the recovery of target compounds and the amount of elution solvent

2.3 色譜條件優(yōu)化

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析農(nóng)藥多殘留，流動相多選擇水、甲醇或乙腈的流動相體系。實驗對比了幾種常用流動相的分離效果，水相包括0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸銨、5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸），有機相包括5 mmol/L 甲酸銨甲醇、5 mmol/L 甲酸銨乙腈、5 mmol/L 甲酸銨乙腈（含0.1%甲酸）。實驗發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）-5 mmol/L甲酸銨乙腈（含0.1%甲酸）流動相體系分離效果最佳[17]。乙腈洗作為流動相洗脫力強峰型更加尖銳對稱。目標(biāo)物多為酸性農(nóng)藥，加入少量甲酸有利于[M-H]+離子的生成，保持化合物穩(wěn)定，減少基質(zhì)中共萃物的干擾，提高方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。加入甲酸銨有利于[M-H]-離子的生成，增強離子響應(yīng)強度，同時降低保留時間長的化合物的柱保留，可有效改善色譜峰型[9]。初始流動相水相比例過高久效磷等極性較大的化合物難以保留，易與極性基質(zhì)一起流出影響測定。調(diào)低初始水相比例至80%，保持2 min，有利于極性化合物的分離與測定。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）是指受樣品基質(zhì)影響導(dǎo)致化合物響應(yīng)值增強或抑制的現(xiàn)象[29]。痕量水平殘留檢測易受基質(zhì)效應(yīng)影響，目前有關(guān)動物源性樣本對農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)的研究較少。本實驗用生乳空白基質(zhì)標(biāo)曲與純?nèi)軇?biāo)曲的斜率比值對基質(zhì)效應(yīng)大小進(jìn)行評估。ME 值大于1.2 為基質(zhì)增強，ME值小于0.8 為基質(zhì)抑制，ME 值在0.8～1.2 認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)可接受，32 種農(nóng)殘ME 值分布見圖4。32 種目標(biāo)化合物產(chǎn)生基質(zhì)抑制效應(yīng)的農(nóng)殘占比34.4%，產(chǎn)生基質(zhì)增強效應(yīng)的農(nóng)殘占比9.4%。目標(biāo)物在生乳中的基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，實驗中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線減小基質(zhì)效應(yīng)，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

圖4 目標(biāo)化合物ME 值分布圖Fig.4 Matrix effect distribution of target compounds

2.5 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化條件下測試1.2.1 配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以目標(biāo)物峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性擬合，得到32 種農(nóng)藥殘留的線性方程（見表2）。由表可知，32 種目標(biāo)物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9962。選擇低添加水平樣品，以3 倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，以10 倍信噪比（S/N=10）計算定量限，結(jié)合樣品前處理過程，得到檢出限為0.1～2.5 μg/kg，定量限為0.3～7.5 μg/kg。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, detection limits and quantitation limits

2.6 回收率與精密度

選取陰性生乳樣品，開展低、中、高3 水平加標(biāo)回收實驗，平行測試6 次，結(jié)果見表3。32 種目標(biāo)物平均回收率為69.4%～113.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為1.4%～8.2%，符合GB/T 27404[30]對食品理化檢測的質(zhì)量控制要求，方法具有良好的回收率與精密度。

表3 加標(biāo)回收和精密度的測定結(jié)果（n=6）Table 3 Determination results of recovery and precision (n=6)

2.7 實際樣品的檢測

采用本方法測定乳品企業(yè)樣品9 份，配送鮮乳樣品9 份，均未檢出32 種農(nóng)藥殘留。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合固相支撐液液萃取在水系樣本有機物萃取方面的優(yōu)勢，建立了生乳中32 種農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測方法。前處理過程無需活化，沉淀蛋白后上柱洗脫即可，15 min 內(nèi)完成樣品上柱與洗脫。相比于傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取，簡單快速，影響因素少，易于自動化。32 種目標(biāo)物檢出限為0.1～2.5 μg/kg，定量限為0.3～7.5 μg/kg，平均回收率為69.4%～113.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.2%，符合GB/T 27404 標(biāo)準(zhǔn)要求。以生乳基質(zhì)為研究對象, 充實了動物源性食品中農(nóng)藥殘留的檢測方法，可為乳制品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管和風(fēng)險評價提供技術(shù)支持。