賈寶珠，何鎮(zhèn)熹，黃心洳，邱芷靖，郭琳苑，袁鈺佩，王碧蔓，羅 林,

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）

磷酸酶是能催化正磷酸酯化合物水解的一類水解酶，包括堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和酸性磷酸酶（Acid phosphatase）兩類[1]。ALP 由兩個相似的單體組成，含有五個半胱氨酸殘基，兩個鋅原子和一個鎂原子[2]，是一種在堿性條件下，可以催化各種含磷酸酯鍵的化合物（包括核酸、蛋白質(zhì)和生物堿）水解脫磷酸的酶。ALP 可以由乳腺細胞自然產(chǎn)生，廣泛存在于生牛乳中，是牛奶中的主要內(nèi)源酶之一。巴氏殺菌是一種相對溫和的熱殺菌方式，既能殺滅牛奶中天然存在的致病菌，又能最大限度地保留鮮牛奶中的營養(yǎng)物質(zhì)和風味物質(zhì)[3]。營養(yǎng)豐富的牛奶為致病菌的生長提供了條件，副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis）是牛奶中最耐熱的細菌，而鮮牛奶中ALP 吸附在乳脂肪球膜上[4]，比副結(jié)核分枝桿菌更耐熱，通常將牛奶中ALP 活性是否低于350 mU/L 作為判定巴氏殺菌是否徹底的標準[5]。因此，ALP 活性的檢測對鮮牛奶的質(zhì)量控制具有重要意義。

當前，檢測ALP 活性的分析方法可大致分為比色法[6]、化學發(fā)光法[7-8]、熒光法[9-10]以及電化學分析法[11]四類。然而，只有比色法、化學發(fā)光法、熒光法被公認為巴氏殺菌驗證的有效方法。其中，比色法通常是以磷酸苯二鈉或酚酞磷酸鹽等為底物，在ALP的催化作用下底物脫去磷酸基團，形成苯酚、無機磷酸鹽和硝基酚或酚酞[12]，通過所釋放的酚類物質(zhì)吸光值測定ALP 的活性，但比色法存在抗干擾能力弱、檢測限高等缺點[13]。熒光法檢測巴氏殺菌乳中ALP主要是通過ALP 催化4-甲基傘形酮磷酸酯、α-萘酚磷酸酯等底物生成強熒光物質(zhì)，通過測定生成物的熒光強度計算酶活力[14]。熒光法雖然靈敏度更高、操作簡便、檢測時間短，但是商業(yè)化的熒光底物價格昂貴檢測成本高，并且所產(chǎn)生的熒光物質(zhì)抗光漂白能力差，熒光穩(wěn)定性不足[15]。熒光碳點（Carbon dots，CDs）作為一種新型熒光納米材料具有比傳統(tǒng)有機染料更為優(yōu)異的光穩(wěn)定性，制備成本低、生物兼容性好[16]。近些年，采用熒光內(nèi)濾效應(yīng)（Inner filter effect，IFE）[17]、光誘導電子轉(zhuǎn)移[18]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[19]或其他非輻射熒光猝滅策略構(gòu)建基于碳點為探針的熒光傳感器吸引了國內(nèi)外眾多研究者的關(guān)注。IFE 是光譜分析中光吸收劑吸收熒光團的激發(fā)光或發(fā)射光而產(chǎn)生的一種非輻照能量傳遞模型。由于吸光度的變化轉(zhuǎn)化為指數(shù)變化的熒光強度變化，基于IFE 的熒光傳感器與分光光度法相比，具有更高的靈敏度[20]。同時，由于IFE 傳感器不需要對熒光團表面修飾或在受體和熒光團之間建立任何共價連接，為探針的制備中提供了相當大的靈活性和便利性[21]。然而，目前尚未見IFE 傳感器用于牛奶中ALP 檢測的報道。

鑒于此，本研究采用水熱法，以乙二胺（Ethylenediamine，EDA）為氮源和鄰苯二酚為碳源制備了發(fā)綠色熒光的氮摻雜碳點（Nitrogen-carbon dots，N-CDs），利用ALP 能催化并水解對硝基苯磷酸二鈉（PNPP）生成對硝基苯酚（PNP），由于PNP 的吸收光譜與NCDs 的激發(fā)光譜剛好重合，PNP 可作為光吸收劑，通過IFE 競爭性與N-CDs 吸收激發(fā)光，從而導致N-CDs的猝滅建立一種可快速、高靈敏檢測鮮牛中ALP 活性的熒光分析方法（圖1 所示），對檢測體系中的PNPP 濃度、緩沖液pH、酶促反應(yīng)時間進行優(yōu)化，并對該分析方法的抗干擾性能、準確度以及可靠性進行評價。該研究首次構(gòu)建基于碳點內(nèi)濾效應(yīng)檢測鮮牛奶中ALP 的熒光分析方法，既具有熒光分析法的高靈敏度同時克服傳統(tǒng)熒光底物熒光穩(wěn)定性不足的劣勢。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿性磷酸酶（10 U/mg）、溶菌酶（2000 U/mg）、乳糖、維生素C、維生素A、維生素B1、對硝基苯磷酸二鈉 上海源葉生物科技有限公司；CaCl2、FeCl2、NaCl、KCl 天津市大茂化學試劑廠；對硝基苯酚天津西恩思生化科技有限公司；乙二胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰苯二胺 上海易恩化學技術(shù)有限公司；Tris 健陽生物科技有限公司；鹽酸天津市大茂化學試劑廠；鮮牛奶樣品 購于華南農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)超市。

聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜 南京瑞尼克科技有限公司；Tecnai-12 高分辨透射電子顯微鏡 荷蘭FEI；Unique R10 超純水凈化儀 廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司；Evolution 300 紫外-可見分光光度計、ESCALAB 250Xi X 射線電子能譜儀、Sorvall ST 8R 高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；VERTEX 70 型傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker 公司；SpectraMax-i3x 多功能微孔板檢測平臺 美國Molecular Devices 公司；DHG-9038A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；ZNCL-G 智能磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；MS 3 basic 漩渦混勻振蕩器 德國IKA；FE28-StandardpH 酸度計 德國梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市儀器有限公司；SSW-600-2S 電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；ME 104 電子分析天平 德國梅特勒—托利多儀器有限公司；10 kDa 超濾離心管Millipore。

1.2 實驗方法

1.2.1 N-CDs 的合成與表征

1.2.1.1 N-CDs 的制備 參照文獻[22]的方法，具體合成步驟如下：將300 μL 乙二胺和25 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚用超聲波混合（25 kHz，5 min，25 ℃），然后轉(zhuǎn)移到50 mL 聚四氟乙烯高壓釜中，在180 ℃下加熱12 h，得到的深棕色混合物，用20 mL 一級水稀釋，在12000 r/min 離心10 min，去除沉淀物，然后收集上清液，通過透析袋 (MWCO：1000 Da) 在超純水中透析48 h，將所制備的N-CDs 保存在4 ℃下。

1.2.1.2 透射電鏡（TEM）表征 取10 μL N-CDs 溶液滴于鍍有碳膜的銅網(wǎng)（300 目）表面，室溫干燥后，于FEI 透射電子顯微鏡下進行表征。

1.2.1.3 熒光光譜測試（UV-Vis） 使用SpectraMaxi3x 多功能微孔板檢測平臺的熒光檢測模式進行NCDs 最佳熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的測量，測試溫度為25 ℃。

1.2.1.4 X 射線光電子能譜測試（XPS） 將N-CDs溶液凍干后的粉末用研缽研細，稱量100 mg 樣品于ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜儀，進行表征。

1.2.1.5 紅外光譜測試（FT-IR） 使用VERTEX 70型傅立葉變換紅外光譜儀對樣品進行測試（波數(shù)范圍：0～4000 cm-1）。

1.2.2 熒光分析方法可行性驗證

1.2.2.1 ALP 催化猝滅N-CDs 效果 設(shè)置酶標板中只加PNPP（2 mmol/L），只加ALP（20 U/L）和同時加PNPP 及ALP 三種分組，每個分組三組平行重復實驗，檢測加入相同濃度N-CDs 后（10 mg/L）的熒光強度。

1.2.2.2 對硝基苯酚（PNP）對N-CDs 的猝滅效果配制濃度為0、10、20、40、60、80、100、150 和200 μmol/L 的PNP 溶液。將N-CDs 和不同濃度PNP 各50 μL 加入到黑色酶標板中，用SpectraMaxi3x 多功能微孔板檢測平臺測定在412 nm 激發(fā)下，518 nm 處熒光發(fā)射強度。

1.2.2.3 PNPP 與PNP 紫外-可見吸收光譜與N-CDs 熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜重合情況考查 采用Evolution 300 紫外-可見分光光度計對PNPP 與PNP 進行紫外-可見吸收光譜進行掃描，測試使用的石英池的光徑為1 cm，測試溫度為25 ℃。并將其與N-CDs 的熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜進行比較。

1.2.3 熒光分析方法的優(yōu)化

1.2.3.1 反應(yīng)體系pH 的優(yōu)化 配制pH 為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液。用對應(yīng)pH 緩沖液溶解配制2 mmol/L 的PNPP和50 U/L 的ALP，分別添加50 μL PNPP 和50 μL ALP 到酶標板中，再添加50 μL 對應(yīng)pH 緩沖液，充分振蕩后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，反應(yīng)后加入50 μL N-CDs，然后用多功能微孔板檢測平臺的熒光分析模塊，測定在412 nm 激發(fā)下，518 nm處熒光發(fā)射強度。同時，用等體積對應(yīng)pH 的Tris-HCl 緩沖溶液代替ALP 作為空白對照，所有組做三組平行實驗。按照式1 計算不同pH 緩沖液反應(yīng)體系熒光強度的抑制率，探討實驗最佳的反應(yīng)pH。

式中：F0和Fn分別代表空白組與存在ALP 時體系的熒光值。

1.2.3.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化 用最適pH Tris-HCl 緩沖液溶配制2 mmol/L 的PNPP 和50 U/L 的ALP，分別添加50 μL PNPP 和50 μL ALP 到酶標板中，充分振蕩后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)，分別在反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 和80 min 時加入50 μL N-CDs，用多功能微孔板檢測平臺的熒光分析模塊，在412 nm 激發(fā)下，測定518 nm 處熒光發(fā)射強度。設(shè)置不加ALP 的組作為空白對照，所有組做三組平行實驗。計算不同反應(yīng)時間體系熒光強度的抑制率，選取抑制率趨于穩(wěn)定的時間點確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.3.3 PNPP 濃度的優(yōu)化 采用最適pH Tris-HCl緩沖液配制濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0 和4.0 mmol/L 的PNPP 溶液。分別添加50 μL PNPP和50 μL ALP（50 U/L）到酶標孔中，充分振蕩后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)50 min，隨后加入50 μL N-CDs。設(shè)置不加ALP 的組作為空白對照，所有組做三組平行實驗。然后用多功能微孔板檢測平臺的熒光分析模塊，在412 nm 激發(fā)下，測定518 nm 處熒光發(fā)射強度，并按式（1）計算緩沖液反應(yīng)體系熒光強度的抑制率，選取抑制率最高的濃度點確定為最佳PNPP 濃度。

1.2.4 熒光分析方法的選擇性 考察樣品中潛在的干擾物：Ca2+、Fe2+、Na+、K+、維生素C、維生素A、維生素B1、溶菌酶、乳糖對檢測體系熒光強度的影響。首先，用Tris-HCl 緩沖溶液（pH10.0）配制濃度均為1 mmol/L 上述干擾物的溶液，以及50 U/L 的ALP 溶液。接著將50 μL PNPP 溶液（1 mmol/L）分別與50 μL 的不同干擾物及ALP 溶液混合，充分振蕩后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)50 min，反應(yīng)后加入50 μL N-CDs。設(shè)置不加ALP 的組作為空白對照，所有組做三組平行實驗。然后用多功能微孔板檢測平臺的熒光分析模塊，在412 nm 激發(fā)下，測定518 nm 處熒光發(fā)射強度。按式（1）計算檢測體系熒光強度抑制率。公式中F0、Fn分別代表空白熒光值、各物質(zhì)的熒光值。

1.2.5 堿性磷酸酶的檢測

1.2.5.1 建立ALP 的標準曲線 配制0、0.01、0.0125、0.025、0.5、0.1、0.15、0.25、0.5、0.8、1.0、1.25、2.5、5.0、10、15、25、50、80、100 U/L 活性梯度的ALP溶液。分別添加50 μL PNPP（1 mmol/L）和50 μL不同活性ALP 到酶標孔中，充分振蕩后在37 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)50 min，反應(yīng)后加入50 μL NCDs。設(shè)置不加酶組作為空白對照，所有組做三組平行實驗。然后用多功能微孔板檢測平臺的熒光分析模塊，在412 nm 激發(fā)下，測定518 nm 處熒光發(fā)射強度，并按式2 計算反應(yīng)體系的相對熒光強度，并以其為縱坐標值，ALP 活性濃度為橫坐標值構(gòu)建定量檢測ALP 活性的標準曲線。

式中，F(xiàn)0和F1分別代表空白組與各濃度ALP時體系的熒光值。

1.2.5.2 樣品前處理及加標回收實驗 樣品用天潤和鮮之外兩種品牌的鮮牛奶。將10 kDa 超濾離心管用超純水潤洗并預冷10 min，加入樣品后在4 ℃、4000 r/min 條件下超濾離心30 min[23]，將超濾后的牛奶樣品用pH10 的Tris-HCl 緩沖液以1:25 的比例進行稀釋處理，即可得到待測牛奶試樣。取部分待測牛奶試樣在水浴鍋中以95 ℃，加熱5 min，滅活牛奶中的ALP，即可得空白牛奶試樣，此時ALP 的含量在10 mU/L 以下。采取標準加入法，對巴氏滅菌鮮牛奶進行加標回收實驗。選取2.5、5、10 U/L 三個活性濃度水平，對兩種品牌鮮牛奶樣品進行添加，再用熒光分析方法進行測定，采用式（3）計算加標回收率。

式中，K0、K1、K2分別代表的是空白測定值、加標量、加標試樣測定值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用2016 版Excel 和Nano measurer1.2 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用Origin 2017 軟件繪制圖。使用SPSS Statistic 21 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均表示為平均值，通過單因素方差分析評估所有數(shù)據(jù)的差異，當方差分析中的P值表明統(tǒng)計學意義時，通過Tukey 檢驗評估差異，P＜0.05 的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-CDs 的合成與表征

本研究以EDA 和鄰苯二酚為原料，通過反應(yīng)合成發(fā)綠色熒光的N-CDs。圖2A 顯示出N-CDs 呈準球形，分散性好，呈顆粒狀，通過使用Nano measurer軟件對大約100 個N-CDs 納米顆粒進行統(tǒng)計分析，平均粒徑在2.3 nm。圖2B 顯示N-CDs 的最佳激發(fā)波長在412 nm，在此激發(fā)波長下，在518 nm 處有一個很強的發(fā)射峰，與以往文獻報道相符[22]。N-CDs的X 射線光電子能譜（圖2C）在284.5、399.9 及531.5 eV 顯示三個特征峰，分別對應(yīng)C1s、N1s、O1s的信號，表明N-CDs 主要有C、N、O 三種元素組成[24]；傅里葉紅外光譜（FT-IR）顯示，3435 cm-1與1580 cm-1處的峰分別屬于N-H 的伸縮振動與彎曲振動，1400 cm-1與1740 cm-1處的峰分別歸屬于C-N 與C-O 的伸縮振動，3208 cm-1處的峰屬于-OH 的伸縮振動[25]，寬的羥基吸收帶表明N-CDs 表面上存在多個羥基結(jié)構(gòu)，賦予CDs 更高的極性和親水性[17,22,24]（圖2D 所示）。上述表征結(jié)果與以往報道N-CDs 具有好的一致性，N-CDs 合成成功。

圖2 N-CDs 的表征圖Fig.2 Characterization of N-CDs

2.2 方法可行性驗證

為驗證熒光分析方法的可行性，本研究分別考察了ALP 及PNPP 單獨存在時對N-CDs 熒光強度的影響。由圖3A 所示，分別將ALP 與PNPP 加入N-CDs 溶液，N-CDs 的熒光強度基本不受影響；而當ALP 與PNPP 同時加入N-CDs 溶液，N-CDs 的熒光強度顯著降低。由于ALP 催化PNPP 水解生成PNP[24]，N-CDs 熒光猝滅很大可能是由PNP 引起的。因此，本研究考察不同濃度PNP 存在時N-CDs 熒光強度的變化。如圖3B 所示，隨著PNP 濃度從0 上升至200 μmol/L，N-CDs 的熒光強度不斷被猝滅。通過比較PNPP、PNP 的紫外-可見吸收光譜與N-CDs的熒光激發(fā)與熒光發(fā)射光譜可知，PNP 的吸收光譜與N-CDs 的激發(fā)光譜剛好重疊，而PNPP 吸收光譜與N-CDs 的激發(fā)光譜及發(fā)射光譜均基本沒有重疊（圖4 所示）。因此，PNP 可作為光吸收劑，通過IFE競爭性與N-CDs 吸收激發(fā)光，從而導致CDs 的猝滅[17,20]。以上結(jié)果表明該熒光分析方法用于ALP 檢測原理上是可行的。

圖3 熒光分析方法可行性驗證Fig.3 Verification the feasibility of the fluorescence assay for ALP

圖4 PNPP 與PNP 的紫外-可見吸收光譜及N-CDs 的激發(fā)與發(fā)射熒光光譜比較Fig.4 Comparison between the UV-vis adsorption spectrum of PNPP and PNP and excitation and emission fluorescence spectra of N-CDs

2.3 熒光分析方法的優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)pH 的優(yōu)化 為探究反應(yīng)體系的pH 對方法檢測性能的影響，測定了以pH 在8.0～10.5 的Tris-HCl 分別作為體系的緩沖液，用多功能微孔板檢測平臺測定各個pH 緩沖體系下，無ALP 存在下以及ALP 濃度為50 U/L 的熒光強度，計算各個pH緩沖體系下的熒光強度抑制率?？梢钥吹椒磻?yīng)體系pH 在8.0～10.0 范圍內(nèi)，抑制率隨pH 升高而升高，且在pH10.0 時達到最大值（如圖5 所示）。當pH 升高至10.5 時，抑制率呈下降趨勢。所以反應(yīng)體系最佳pH 為10.0。馬金虎等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，草魚肝胰臟ALP 催化PNPP 水解反應(yīng)的最適pH 為10.33。余同等[27]的研究表明，牛小腸ALP 催化PNPP 水解反應(yīng)的最適pH 為9.7，pH 小于6.5 和大于11.5 均不穩(wěn)定。由此可知，本研究優(yōu)化得到反應(yīng)體系最優(yōu)pH 與ALP 最適作用pH 相近。

圖5 pH 對檢測體系響應(yīng)靈敏度的影響Fig.5 Effect of pH on the sensitivity of the assay

2.3.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化 為探究反應(yīng)體系的反應(yīng)時間對檢測體系靈敏度的影響，考察了pH10 緩沖體系下，不同反應(yīng)時間（10～80 min），ALP 濃度為50 U/L時所引起熒光強度抑制率。圖6 顯示，反應(yīng)時間在10～50 min 范圍內(nèi)，抑制率呈明顯上升趨勢，在50 min時已達到60%左右，而當反應(yīng)時間繼續(xù)增加80 min，抑制率僅提升至70%左右，綜合考慮檢測時間成本，選取50 min 作為最佳反應(yīng)時間。

圖6 反應(yīng)時間對檢測靈敏度的影響Fig.6 Effect of reaction time on the sensitivity of the assay

2.3.3 PNPP 濃度的優(yōu)化 為探究反應(yīng)體系的PNPP濃度對檢測靈敏度的影響，考察了pH10 緩沖體系下，反應(yīng)時間50 min，不同PNPP 濃度（0～4 mmol/L）下，ALP 濃度為50 U/L 時所引起體系熒光強度的抑制率。由圖7 可以看出，PNPP 濃度在0～1 mmol/L范圍內(nèi)，抑制率呈顯著上升（P＜0.05），在1 mmol/L時已達到較高水平，而當PNPP 濃度繼續(xù)增加，抑制率幾乎無增加，達到平衡（P＞0.05）。綜合考慮試劑成本與檢測靈敏度，選取1 mmol/L 作為PNPP 的最佳工作濃度。

圖7 PNPP 濃度對檢測靈敏度的影響Fig.7 Effect of PNPP concentration on the sensitivity of the assay

2.4 熒光分析法的選擇性

本研究考察了牛奶樣品中可能存在金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Fe2+）、維生素（維生素C、維生素B1、維生素A）、乳糖、溶菌酶對檢測干擾。從圖8 可以看出，該熒光分析方法僅對ALP 產(chǎn)生明顯的熒光響應(yīng)，而對1 mmol/L 的各種潛在干擾物產(chǎn)生的響應(yīng)微弱可以忽略不計，表明該熒光分析方法選擇性好，用于ALP 活性檢測具有高的可靠性。

圖8 熒光分析方法對ALP 檢測的選擇性Fig.8 The selectivity of this fluorescence assay for the detection of ALP

2.5 鮮牛奶樣品中ALP 的檢測

在最佳條件下，用熒光光譜儀測定不同ALP 活性濃度（0～100 U/L）所引起的體系熒光強度變化值。由圖9 可知，隨著ALP 活性濃度的提高，體系熒光強度逐漸下降，并且當ALP 活性濃度在0.01～25 U/L的范圍，體系相對熒光強度F0-F1與ALP 活性濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y=15397.05X+70344.46，決定系數(shù)R2為0.995（其中Y 表示體系相對熒光強度（F0-F1），X 表示ALP 的濃度），定量限為0.003 U/L （S/N=10），檢測限達到0.001 U/L（S/N=3）。相比于前期報道的乳制品中ALP 的檢測方法（表1），該熒光分析法具有更寬的線性范圍及更高的靈敏度。

表1 乳制品中ALP 檢測方法的對比Table 1 Comparison of methods for detecting ALP in milk products

圖9 不同濃度ALP 存在下體系熒光強度的變化（A）和ALP 測定的標準曲線（B）Fig.9 Fluorescence emission spectra of assay system in the presence of various concentration of ALP (A) and the calibration curve of the fluorescence assay for ALP activity determination (B)

為了驗證方法的準確性，本研究選取市售兩種品牌的鮮牛奶進行添加回收實驗。由表2 可知，品牌1 鮮牛奶樣品的添加回收率在100.9%～107.2%之間；品牌2 樣品的添加回收率在100.1%～106.9%范圍內(nèi)。兩種品牌鮮牛奶樣品的添加回收率都在80%～120%之間，變異系數(shù)都在14.3%以下，表明該熒光分析方法具有較好的準確性可以用于鮮牛奶中ALP 活性的檢測。

表2 鮮牛奶樣品中ALP 的添加回收實驗結(jié)果Table 2 Experimental results of recovery of ALP in fresh milk

3 結(jié)論

本研究以一種綠色熒光的N-CDs 作為熒光探針構(gòu)建的熒光分析方法對ALP 具有很好的靈敏度、選擇性與抗干擾能力。以檢測體系的PNPP 濃度，工作緩沖液pH，反應(yīng)時間為單因素，優(yōu)化得到ALP 的最佳檢測條件為pH10.0，PNPP 濃度為1 mmol/L，酶促反應(yīng)時間為50 min。最優(yōu)條件下，該方法對ALP的檢測限達到0.001 U/L，并且牛奶樣品中潛在的干擾物均不對檢測產(chǎn)生明顯影響。實際樣品添加回收實驗表明，該方法回收率高（100.1%～107.2%），可準確測定巴氏殺菌奶中ALP。由于熒光碳點具有合成簡單、成本低廉、低毒或無毒性以及相對于有機熒光染料的更強的抗光漂白能力及熒光穩(wěn)定性，該方法不但具有熒光分析的高靈敏度，同時彌補傳統(tǒng)熒光分析法熒光信號穩(wěn)定性差抗干擾不足的缺陷。雖然該方法操作簡單便利，但還是依賴熒光光譜儀這類實驗室專業(yè)的設(shè)備進行信號讀取，不利于現(xiàn)場快速檢測，下一步可以在本研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)配套熒光便攜檢測裝置，以滿足對全鏈條牛奶產(chǎn)品中ALP 實時檢測的需求?？傊狙芯繕?gòu)建的鮮牛中ALP 檢測熒光分析方法具有快速、操作簡便、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢，為牛奶中ALP 的熒光快速檢測提供一種新思路。