張蕙竹，陶 立，劉 睿，熊博宇，于 雷,2,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118）

西洋參多糖（American ginseng polysaccharides，AGP）是一類大分子多糖，相對(duì)分子質(zhì)量范圍為2×104～7×104，主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成[1]，主要糖苷鍵類型為β-（1,4）[2]。其作為西洋參主要的功能成分之一，具有抗氧化、降血糖和抗腫瘤等功能活性[3]，但其相對(duì)分子質(zhì)量大，難以有效地跨膜來(lái)發(fā)揮生物效應(yīng)[4]，限制了西洋參多糖在生物體內(nèi)的應(yīng)用[5]。而低聚糖不僅具有低熱量、穩(wěn)定性高和安全無(wú)毒等理化特性，還具有調(diào)節(jié)腸道功能、調(diào)節(jié)血糖和抗氧化等功能活性，并且其相對(duì)分子質(zhì)量較低，更容易被人體吸收利用[6]。

酶的特異性、高效性、溫和性以及可調(diào)性使其在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，酶能夠作用于糖苷鍵使其斷裂從而達(dá)到水解多糖的目的。按照酶促反應(yīng)的性質(zhì)，可將酶進(jìn)行分類，纖維素酶、淀粉酶和殼聚糖酶等催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶歸類于水解酶類[7]。目前關(guān)于酶解多糖的研究中，利用纖維素酶作用于β-（1,4）糖苷鍵水解阿拉伯木聚糖，其水解產(chǎn)物具有更好的益生活性[8]，通過α-淀粉酶水解牡蠣多糖的α-（1,4）糖苷鍵，可以成功制備牡蠣寡糖[9]，利用殼聚糖酶制備得到的甲殼低聚糖可以克服殼聚糖在中性溶液中難溶的缺點(diǎn)[10]，利用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶解蘋果多糖，對(duì)酶解前后的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)估，其酶解產(chǎn)物具有更強(qiáng)的抗氧化活性[11]，通過纖維素酶降解得到的黑木耳低聚糖具有更強(qiáng)的DPPH、OH-和O2-自由基清除能力[12]。相對(duì)于淀粉酶和殼聚糖酶而言，纖維素酶是一種復(fù)合酶，研究認(rèn)為纖維素酶可以將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖是其各組分協(xié)同作用的結(jié)果，這種協(xié)同作用機(jī)制，更加適合作用于復(fù)雜的多糖結(jié)構(gòu)[13]。李立新等[5]利用纖維素酶將西洋參多糖進(jìn)行酶解，并研究了酶解產(chǎn)物的初級(jí)結(jié)構(gòu)，吳憲玲等[14]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解西洋參多糖的工藝條件，但目前尚未報(bào)道關(guān)于西洋參多糖酶解產(chǎn)物及西洋參低聚糖的生物活性研究。

吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)西洋參資源豐富，在人參皂苷加工產(chǎn)業(yè)中，提取完皂苷后的西洋參殘?jiān)腥源嬖诖罅康亩嗵穷愇镔|(zhì)，常作為廢物被丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此本研究充分利用西洋參殘?jiān)械亩嗵牵蒙锩阜▽?duì)西洋參多糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化具有重要的研究?jī)r(jià)值。將酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾得到西洋參低聚糖，對(duì)其體外功能活性進(jìn)行研究，彌補(bǔ)研究空缺，為深入研究西洋參低聚糖奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)提高西洋參資源的綜合利用，減少浪費(fèi)，創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參多糖 吉林省宏久生物科技股份有限公司提供（多糖含量：75%，將西洋參提取皂苷后過濾得到的殘?jiān)?，采用水提濃縮法將得到的組分噴霧干燥制得）；纖維素酶（50 U/mg）、葡萄糖、纖維二糖、α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、α-淀粉酶（50 U/mg）、脂肪酶（30 U/mg）、抗壞血酸、p-NPG、阿卡波糖、DPPH、ABTS 上海源葉生物技術(shù)有限公司；鄰苯二甲醛、3,5-二硝基水楊酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，所有試劑均為分析純。

Y-PL300 型實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī) 上海宇硯機(jī)械設(shè)備有限公司；MSC-300 超濾杯、500 Da 超濾膜、2 kDa 超濾膜 上海摩速科學(xué)器材有限公司；硅膠板G 青島海洋化工有限公司；R3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海沃瓏儀器有限公司；UV-2600I 紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參多糖的制備 西洋參與75%乙醇以1:8（w/w）的比例混合，在70 ℃下反應(yīng)3 h。將反應(yīng)結(jié)束過濾得到的料渣與蒸餾水以1:15（w/w）的比例混合，在100 ℃下充分反應(yīng)3 h。將反應(yīng)結(jié)束后過濾得到的濾液進(jìn)行濃縮后噴霧干燥得到西洋參多糖（American ginseng polysaccharides，AGP）。

1.2.2 西洋參多糖酶解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 西洋參多糖酶解的影響因素 以pH5.0 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制西洋參多糖溶液，分別考察反應(yīng)溫度、底物濃度、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)西洋參多糖酶解的影響。各因素設(shè)置如下：反應(yīng)溫度40、45、50、55、60、65 ℃，設(shè)定底物濃度20 mg/mL，加酶量100 U/mg，酶解時(shí)間60 min；底物濃度10、20、30、40、50、60 mg/mL，設(shè)定反應(yīng)溫度55 ℃，加酶量100 U/mg，酶解時(shí)間60 min；加酶量20、50、100、150、200、250 U/mg，設(shè)定反應(yīng)溫度55 ℃，底物濃度20 mg/mL，酶解時(shí)間60 min；酶解時(shí)間30、60、90、120、150、180 min，設(shè)定反應(yīng)溫度55 ℃，加酶量100 U/mg，底物濃度20 mg/mL。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶10 min，冷卻后4800 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行薄層色譜（TLC）分析并測(cè)定平均聚合度。

1.2.2.2 薄層色譜分析 將硅膠板G 在105 ℃條件下活化30 min，葡萄糖和纖維二糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，稀釋酶解液，點(diǎn)樣量為5 μL。使用展開劑為乙酸乙酯:乙酸:異丙醇:甲酸:水=25:10:5:1:15，在4 ℃條件下重復(fù)展開3 次，85 ℃烘干后使用顯色劑顯色，顯色劑為10%硫酸乙醇[15]。

1.2.2.3 平均聚合度的測(cè)定 參照楊書艷[16]的方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，配制0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加入蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL；加入6%苯酚溶液1.0 mL，緩慢加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置30 min，冷卻至室溫。用紫外分光光度計(jì)在490 nm 處測(cè)量吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=13.473x+0.0076，R2=0.990。樣品的測(cè)定：配制0.1 mg/mL 西洋參多糖溶液，吸取1.0 mL，按照上述步驟操作，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

采用DNS 法測(cè)定還原糖含量，配制0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加入蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入DNS 溶液2.0 mL，沸水浴加熱5 min，加入蒸餾水補(bǔ)至10.0 mL，冷卻至室溫，用紫外分光光度計(jì)在540 nm 處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=13.259x-0.1907，R2=0.999。樣品的測(cè)定：配制0.1 mg/mL 西洋參多糖溶液，吸取1.0 mL，按照上述步驟操作，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

平均聚合度（DP）的計(jì)算公式如下：

1.2.3 西洋參低聚糖的分離制備 室溫下，以鋼瓶氮?dú)鉃榧訅簹怏w，控制壓力為0.15±0.02 MPa，配制西洋參多糖酶解產(chǎn)物溶液濃度為20 mg/mL，在4800 r/min 下離心10 min，收集上清液。首先將上清液經(jīng)過2 kDa 超濾膜過濾，收集濾液，將收集的濾液經(jīng)過500 Da 超濾膜過濾，收集截留液，超濾至10 min內(nèi)無(wú)過濾液滴下為終點(diǎn)[17]。將截留液冷凍干燥后得到西洋參低聚糖（American ginseng oligosaccharides，AGOS）。

1.2.4 西洋參低聚糖和西洋參多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 參考劉昊等[18]的方法并修改，按體積比為1:1，將2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液與7 mmol/L ABTS 溶液混合，于黑暗處避光反應(yīng)12 h，稀釋使ABTS 儲(chǔ)備液在734 nm波長(zhǎng)處吸光值為0.7±0.05。取100 μL 不同濃度的樣品溶液，再加入170 μL ABTS 儲(chǔ)備液，搖勻后置于黑暗處反應(yīng)6 min，以抗壞血酸作為對(duì)照，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值。

ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：C：ABTS+自由基清除率，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；A2：背景組測(cè)試值。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參考王鑫等[19]的方法并修改，配制DPPH 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.2 mmol/L），再分別取1.0 mL 不同濃度的樣品溶液，依次加入1.0 mL DPPH 溶液，振蕩搖勻后避光反應(yīng)30 min，以抗壞血酸作為對(duì)照，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度。

DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：C：DPPH 自由基清除率，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；A2：背景組測(cè)試值。

1.2.4.3 OH 自由基清除能力的測(cè)定 參考Zhao 等[20]的方法并修改，吸取1.0 mL 不同濃度的樣品溶液，依次加入各為1.0 mL 的FeSO4溶液和水楊酸溶液（濃度均為9 mmol/L），振蕩混勻后靜置15 min，再加入1.0 mL 8.8 mmol/L 的H2O2，置于37 ℃的恒溫振蕩箱中1 h，以抗壞血酸作對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度。

OH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：C：OH 自由基清除率，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；A2：背景組測(cè)試值。

1.2.4.4 O2-離子清除能力的測(cè)定 參考計(jì)艷艷[21]的方法并修改，吸取1.0 mL 不同濃度的樣品溶液，依次加入9.0 mL Tris-HCL 緩沖液（50 mmol/L；pH8.2），搖勻，37 ℃條件下預(yù)熱20 min，然后加入2.5 mL 在37 ℃條件下預(yù)熱過的鄰苯二酚（3 mmol/L）溶液，以HCl（10 mmol/L）作空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，在325 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

O2-離子清除率計(jì)算公式如下：

式中：C：O2-陰離子清除率，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；

1.2.4.5 Fe2+螯合能力的測(cè)定 參考Gül?in[22]的方法并修改，吸取2.0 mL 不同濃度的樣品溶液，依次加入100 μL 氯化亞鐵溶液（2 mmol/L）、500 μL 菲洛嗪溶液（5 mmol/L）和5.5 mL 去離子水，混勻后室溫反應(yīng)10 min，在562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

Fe2+螯合能力計(jì)算公式如下：

式中：C：Fe2+螯合能力，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；A2：背景組測(cè)試值。

1.2.4.6 總還原力的測(cè)定 參考Zhao 等[23]的方法并修改，吸取1.0 mL 不同濃度的樣品溶液，依次加入2.0 mL 鐵氰化鉀溶液（1% w/v）、2.0 mL PBS 緩沖液（0.2 mmol/L；pH6.6），在50 ℃條件下反應(yīng)20 min，加入2.0 mL 三氯乙酸溶液（10% w/v），混勻后離心10 min（3000 r/min），取上清液2.0 mL，加入2.0 mL去離子水和100 μL 三氯化鐵溶液，室溫反應(yīng)10 min后在700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。吸光值即為樣品的總還原力。

1.2.5 西洋參低聚糖和西洋參多糖降血糖能力的測(cè)定

1.2.5.1α-葡萄糖苷酶抑制能力的測(cè)定 參照羨榮華等[24]的方法稍作修改，將1.0 mL 不同濃度樣品溶液與2.0 mLα-葡萄糖苷酶（2 U/mL）充分混合，于37 ℃溫育20 min 后加入4.5 mLp-NPG（20 mmol/L）。在37 ℃繼續(xù)溫育30 min 后，加入7.0 mL 2 mol/L碳酸鈉溶液，終止反應(yīng)。在對(duì)照管中，使用相同量的緩沖液代替樣品，于405 nm 處測(cè)量的吸光度來(lái)測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制能力，阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。

α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：C：α-葡萄糖苷酶抑制率，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；A2表示背景組測(cè)試值。

1.2.5.2α-淀粉酶抑制能力的測(cè)定 參照李潔等[25]的方法稍作修改，分別準(zhǔn)確稱取100 μLα-淀粉酶，與200 μL 不同濃度樣品溶液，于37 ℃反應(yīng)15 min，加入5.0 mL 1%淀粉溶液反應(yīng)10 min，再加入6.0 mL DNS 溶液，混合均勻后沸水加熱15 min，冷卻后于540 nm 測(cè)定樣品的α-淀粉酶抑制能力，阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。

α-淀粉酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：C：α-淀粉酶抑制率，%；A0：空白組測(cè)試值；A1：樣品組測(cè)試值；A2：背景組測(cè)試值。

1.2.6 西洋參低聚糖和西洋參多糖降血脂能力的測(cè)定

1.2.6.1 膽固醇結(jié)合能力的測(cè)定 參照張婷婷[26]的方法稍作修改，將新鮮的雞蛋黃與9 倍體積的蒸餾水混合攪拌成均一狀態(tài)的乳濁液，將pH 調(diào)為2.0 和7.0，分別稱取AGOS 和AGP 加入調(diào)好pH 的25 mL蛋黃稀釋液中，在37 ℃水浴振蕩2 h 后，4000 r/min離心20 min，取上清液，采用鄰苯二甲醛法于550 nm處測(cè)定吸光值。

膽固醇結(jié)合能力計(jì)算公式如下：

式中：M：恒重樣品質(zhì)量，g；M1：離心后上清液中膽固醇含量，mg；M2：吸附前蛋黃乳液膽固醇含量，mg。

1.2.6.2 膽酸鈉結(jié)合能力的測(cè)定 參照Qian 等[27]的方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取0.2 g 和0.3 g 膽酸鈉溶于100 mL 濃度為0.15 mol/L 的NaCl 溶液中，調(diào)節(jié)溶液pH 為7.0，分別加入0.2 g AGOS 和AGP 樣品，于37 ℃震蕩反應(yīng)2 h，于4200 r/min 離心20 min，于620 nm 下測(cè)定吸光值。

膽酸鈉吸附能力計(jì)算公式如下：

式中：M：恒重樣品質(zhì)量，g；M1：吸附后上清液中膽酸鈉含量，mg；M2：吸附前膽酸鈉含量，mg。

1.2.6.3 脂肪酶抑制能力的測(cè)定 參照牛夢(mèng)憲等[28]的方法稍作修改，取40 μL 100 mg/mL 脂肪酶溶液，與100 μL 不同濃度樣品溶液混合均勻，加入3.0 mL磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L；pH7.0），于30 ℃反應(yīng)3 min，加入20 μL 乙酸對(duì)硝基苯酯-二甲基亞砜溶液，反應(yīng)10 min 后于405 nm 處測(cè)定吸光值。

脂肪酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：C：脂肪酶抑制率，%；A1：對(duì)照組測(cè)試值；A2：樣品組測(cè)試值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析和多重比較法檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行，使用GraphPad Prism 8.0.2 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋參多糖酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)西洋參多糖酶解的影響 由圖1所示，根據(jù)薄層色譜原理，寡糖聚合度越小，其遷移速度越快，位移越大。二糖的聚合度為2，因此將單糖和二糖部分劃分為A 區(qū)，而聚合度大于2 的部分劃分為B 區(qū)。AGP 中單糖和二糖區(qū)域（下文簡(jiǎn)稱為A 區(qū)）顯示出斑點(diǎn)，聚合度大于2 區(qū)域（下文簡(jiǎn)稱為B 區(qū)）并未有明顯斑點(diǎn)顯色。由圖2 所示，隨著溫度的升高，A 區(qū)顏色逐漸加深，B 區(qū)顏色逐漸變深后變淺，可能是由于隨著溫度的升高，西洋參多糖分子和纖維素酶分子間的運(yùn)動(dòng)速度增大[29]，互相之間的接觸也增多，因此隨著降解速率的增加，寡糖的生成量也隨之增加。但是當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，纖維素酶分子由于吸收了過多的熱量，導(dǎo)致自身次級(jí)鍵不穩(wěn)定從而發(fā)生斷裂，其空間結(jié)構(gòu)被破壞，最終使纖維素酶的活性減弱甚至喪失[30]。顯色情況表明，B 區(qū)顏色隨著溫度的升高逐漸加深后變淡，說(shuō)明纖維素酶活力的喪失導(dǎo)致酶解能力減弱，寡糖生成量也隨之減少。當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，分離效果最好且斑點(diǎn)顏色最明顯，因此45 ℃為較優(yōu)值，如表1 所示，此時(shí)平均聚合度為2.65。

表1 不同反應(yīng)溫度下酶解液的平均聚合度Table 1 DP of the enzymatic digest at different reaction temperatures

圖1 西洋參多糖的薄層色譜結(jié)果Fig.1 TLC results of AGP

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)西洋參多糖酶解的影響薄層色譜結(jié)果Fig.2 TLC results of the effect of reaction temperature on enzymatic hydrolysis of AGP

2.1.2 底物濃度對(duì)西洋參多糖酶解的影響 由圖3所示，隨著底物濃度的增加A 區(qū)顏色逐漸加深，分析其原因?yàn)榭杀幻咐玫牡孜锊粩嘣龆?，因此更多的糖苷鍵被不斷破壞，暴露出具有還原性的羥基[31]，單糖和二糖的生成量也不斷增加。此時(shí)，隨著底物濃度的增加，B 區(qū)斑點(diǎn)數(shù)量經(jīng)歷了先增加后減少的過程，這是由于這些聚合度相對(duì)較大的寡糖隨著底物濃度的增加逐漸積累，隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行又降解為更小分子的糖而使含量減少[32]。因此為了得到聚合度分布相對(duì)均勻的寡糖，選擇20 mg/mL 為較優(yōu)值，如表2 所示，此時(shí)平均聚合度為2.73。

表2 不同底物濃度下酶解液的平均聚合度Table 2 DP of the enzymatic digest at different substrate concentration

圖3 底物濃度對(duì)西洋參多糖酶解的影響薄層色譜結(jié)果Fig.3 TLC results of the effect of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of AGP

2.1.3 加酶量對(duì)西洋參多糖酶解的影響 由圖4 可知，隨著加酶量的不斷增加，A 區(qū)和B 區(qū)顏色逐漸變深，當(dāng)加酶量大于100 U/mg 時(shí)，B 區(qū)逐漸分離不均且斑點(diǎn)數(shù)量減少。隨著加酶量的增加，酶解效率升高[33]。但當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度，部分寡糖也會(huì)被降解生成單糖和二糖。因此為了避免寡糖被過度水解和經(jīng)濟(jì)成本的問題，選擇加酶量100 U/mg 為較優(yōu)值，如表3 所示，此時(shí)平均聚合度為3.31。

表3 不同加酶量下酶解液的平均聚合度Table 3 DP of the enzymatic digest at different cellulase dosage

圖4 加酶量對(duì)西洋參多糖酶解的影響薄層色譜結(jié)果Fig.4 TLC results of the effect of cellulase dosage on enzymatic hydrolysis of AGP

2.1.4 時(shí)間對(duì)西洋參多糖酶解的影響 由圖5 所示，顯色情況表明，隨著時(shí)間的不斷增加，A 區(qū)顏色逐漸變深，B 區(qū)顏色逐漸變深后變淺。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于90 min 時(shí)，B 區(qū)顏色逐漸變淺，且分離效果更加不明顯，可能的原因是寡糖發(fā)生降解，產(chǎn)生了更多的單糖和二糖[34]。因此為了避免寡糖被過度水解，選擇90 min 為較優(yōu)值，如表4 所示，此時(shí)平均聚合度為2.76。

表4 不同時(shí)間下酶解液的平均聚合度Table 4 DP of the enzymatic digest at different enzymolysis time

圖5 時(shí)間對(duì)西洋參多糖酶解的影響薄層色譜結(jié)果Fig.5 TLC results of the effect of enzymolysis time on enzymatic hydrolysis of AGP

2.2 西洋參低聚糖和西洋參多糖抗氧化活性的測(cè)定

如圖6A～圖6C 所示，在0.025～2.000 mg/mL濃度范圍內(nèi)，所有樣品的ABTS+、DPPH 和OH 自由基清除活性均呈劑量依賴性增加[35]。AGOS 的自由基清除率普遍高于AGP，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，AGOS 的的ABTS+、DPPH 和OH 自由基清除率分別為74.63%、79.98%、99.94%，而AGP 的ABTS+、DPPH 和OH 自由基清除率分別為35.07%、68.98%、55.18%。可能是因?yàn)榈途厶蔷哂懈嗟挠坞x羥基和更好的水溶性，有更多的機(jī)會(huì)與自由基相互作用[36]。因此，AGOS 可有效提高了自由基清除能力。

圖6 西洋參低聚糖和西洋參多糖抗氧化活性的測(cè)定Fig.6 Antioxidant activity results of AGOS and AGP

如圖6D～圖6E 所示，在0.025～2.000 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，AGOS 具有一定的O2-自由基清除能力和Fe2+螯合能力[37]，并且其O2-自由基清除能力與VC接近，O2-是一種兩性離子自由基，可以與游離羥基發(fā)生反應(yīng)而被消除[38]，F(xiàn)e2+螯合能力與其中的官能團(tuán)類型有關(guān)[39]，而酶解使低聚糖暴露出更多的游離羥基基團(tuán)，因此AGOS 的O2-清除能力和Fe2+螯合能力要強(qiáng)于AGP。

如圖6F 所示，在0.025～2.000 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，AGOS 的總還原力具有濃度依賴性，還原能力與還原糖的存在有關(guān)，因?yàn)槠渚哂泄淠芰40]，而AGOS中的還原糖含量要高于AGP，所以AGOS 具有更好的總還原力。

2.3 西洋參低聚糖和西洋參多糖降血糖能力的測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制淀粉、糖原等水解成葡萄糖，延緩淀粉、糖原等在小腸中的吸收，α-淀粉酶抑制率的增加，能夠有效延緩葡萄糖的釋放，降低餐后血糖水平。如圖7A～圖7B 所示，AGOS 和AGP的α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率隨著濃度的升高而不斷增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。AGOS 比AGP 對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，AGOS的α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分別為35.76%和62.45%，AGP 的α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分別為29.92%和57.00%，原因是酶解可以促進(jìn)多糖糖苷鍵斷裂，暴露出更多羥基基團(tuán)，與消化酶中的氨基酸殘基相結(jié)合，起到抑制酶活性的作用[41]。而AGOS 羥基基團(tuán)的暴露增大了其與氨基酸殘基相互作用的機(jī)會(huì)，因此AGOS 具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力。

圖7 西洋參低聚糖和西洋參多糖降血糖能力的測(cè)定Fig.7 Hypoglycemic results of AGOS and AGP

2.4 西洋參低聚糖和西洋參多糖降血脂能力的測(cè)定

膽固醇結(jié)合能力是評(píng)價(jià)降膽固醇能力的重要指標(biāo)，膽汁酸為膽固醇代謝提供了一條重要的排泄途徑，如圖8A 為AGOS 和AGP 在模擬胃腸道環(huán)境下對(duì)膽固醇的結(jié)合能力，在胃和小腸的環(huán)境下，AGOS的膽固醇結(jié)合能力要顯著高于AGP（P＜0.05）。圖8B為AGOS 和AGP 在不同的膽酸鈉濃度下對(duì)其展現(xiàn)出不同的結(jié)合能力，AGOS 的膽酸鈉結(jié)合能力高于AGP。這是由于酶解使AGP 的微觀結(jié)構(gòu)和分子大小發(fā)生了變化，AGOS 具有較大的表面積和多孔結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合更多的膽酸鈉和膽固醇[42]，達(dá)到降脂的目的。因此AGOS 具有更好的膽固醇結(jié)合能力。

圖8 西洋參低聚糖和西洋參多糖降血脂能力的測(cè)定Fig.8 Hypolipidemic results of AGOS and AGP

如圖8C 所示，AGOS 和AGP 對(duì)脂肪酶的抑制率隨著濃度的升高逐漸增大，呈現(xiàn)濃度依賴性。脂肪酶可以將脂肪水解成游離脂肪酸和單酰甘油酯，通過抑制脂肪酶的活性，可以減少機(jī)體對(duì)脂肪的吸收，從而達(dá)到降脂的目的[43]。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，AGOS 的脂肪酶抑制率為98.55%，高于AGP，是因?yàn)榈头肿恿康腁GOS 更容易被人體吸收，從而抑制了脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累[44]。

3 結(jié)論

本研究采用酶解法水解AGP，通過超濾分離得到AGOS。纖維素酶酶解AGP 最佳條件為：反應(yīng)溫度45 ℃、底物濃度20 mg/mL、加酶量100 U/mg、酶解時(shí)間90 min，此條件下AGP 酶解產(chǎn)物的平均聚合度為2.74。AGOS 具有更強(qiáng)的抗氧化活性，其ABTS+自由基清除能力比AGP 高39.56%、DPPH 自由基清除能力比AGP 高11.00%、OH 自由基清除能力比AGP 高44.76%；AGOS 具有更強(qiáng)的酶抑制能力，其α-葡萄糖苷酶抑制率比AGP 高5.84%、α-淀粉酶抑制率比AGP 高5.45%、脂肪酶抑制率比AGP 高10.46%。本研究結(jié)果說(shuō)明了AGOS 具有更強(qiáng)的抗氧化活性、體外降血糖能力和體外降血脂能力，證實(shí)了AGOS 作為功能性食品的潛在應(yīng)用價(jià)值，為西洋參殘?jiān)械途厶琴Y源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。