張倩如，吳啟賜, ，薛 鈺，林志超，黃家福，呂昊坤，彭 偉，潘裕添，林進(jìn)妹

（1.閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)福建省高校工程研究中心，福建漳州 363000；2.閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，福建漳州 363000）

D-氨基葡萄糖鹽酸鹽（D-glucosamine hydrochloride，GAH）是甲殼素或殼聚糖的重要衍生物[1-3]，是人體及動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)組織中糖蛋白的天然成分，分布于人體所有組織，由葡萄糖氨基化內(nèi)源性生物合成[4]。GAH 具有消炎、解毒、抗菌、防腐等作用，亦可作為治療骨關(guān)節(jié)疼痛的藥物[5-9]，在醫(yī)學(xué)、化妝品、食品等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景。GAH 的制備方法包括酸水解法、酶解法及微生物發(fā)酵法[10]。其中酸解法操作簡(jiǎn)單，成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但其生產(chǎn)易受原料的季節(jié)和產(chǎn)地的限制；酶解法綠色環(huán)保，但生產(chǎn)工藝復(fù)雜，酶制劑作用時(shí)間普遍較長(zhǎng)，生產(chǎn)成本較高，較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化；微生物發(fā)酵法條件溫和，原材料不受資源限制，但微生物工程代謝改造困難，代謝副產(chǎn)物多，從而抑制產(chǎn)物積累。針對(duì)當(dāng)前應(yīng)用最廣的酸解法，廢棄蝦蟹殼中甲殼素是制備GAH 的主要原料[10]，也有一些其他來(lái)源，如蟬蛻[11]、桑蠶蛹[12]、檸檬酸發(fā)酵廢渣[13]、糙皮側(cè)耳固體發(fā)酵料[14]等，但這些原料因?yàn)閬?lái)源或產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題而限制其規(guī)?；a(chǎn)。蝦蟹殼酸解制備的GAH 產(chǎn)品質(zhì)量較差，通常伴有魚(yú)腥味，重金屬、砷和灰分含量也容易超標(biāo)，生產(chǎn)高純度GAH 的成本很高。因此，尋找新原料新工藝生產(chǎn)高品質(zhì)的GAH 產(chǎn)品具有重要意義。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）是目前中國(guó)繼雙孢蘑菇之后栽培規(guī)模最大的食用菌之一，產(chǎn)品主要用于鮮售，而鮮售的商品菇僅占子實(shí)體總重量的70%左右，尚有30%的杏鮑菇子實(shí)體剩余物被丟棄或低價(jià)出售[15]。這些杏鮑菇子實(shí)體剩余物含有大量菌絲體和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同樣具有可深度開(kāi)發(fā)的價(jià)值[10]。在食用菌精深加工研究中，人們尤其關(guān)注占據(jù)細(xì)胞干重20%以上的細(xì)胞壁物質(zhì)[16-17]，包括研究其物質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)，以及其是否具備特殊可應(yīng)用于人類健康或疾病治療的生物學(xué)功能，因此杏鮑菇菌絲體細(xì)胞壁中的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)“甲殼素-β-葡聚糖（Chitin-β-Glucan）”也成為GAH 制備的重要研究對(duì)象之一，目前已引起產(chǎn)業(yè)的高度關(guān)注。

本文針對(duì)杏鮑菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過(guò)程中的廢棄菌渣（主要為子實(shí)體剩余物）去向問(wèn)題，研究了來(lái)源于杏鮑菇廢棄菌渣的GAH 制備工藝、產(chǎn)品質(zhì)量及其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響，旨在為GAH 生產(chǎn)提供新原料和新制備工藝，同時(shí)也為提高杏鮑菇產(chǎn)業(yè)剩余物的綜合利用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇廢棄菌渣 杏鮑菇鮮品產(chǎn)自福建漳州（2022 年7 月采收），由福建科人生物科技有限公司采購(gòu)，切除70%的子實(shí)體用于鮮銷或制備罐頭，剩余的子實(shí)體部分即為廢棄菌渣；D-氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國(guó)Sigma 公司；活性炭廣東汕頭市西隴化工廠；乙酰丙酮和對(duì)二甲氨基苯甲醛 分析純，上海瑞碩化工有限公司；野生型TU 品系斑馬魚(yú) 清華大學(xué)孟安明課題組；地高辛標(biāo)記的tgfβ1a、tgfβ2探針采用體外合成的方法，所采用的相關(guān)試劑購(gòu)自Roche 公司；其余試劑均為市售分析純。

Senco R1002B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；Centrifuge 5810R 高速冷凍離心機(jī) Eppenddorf；LG-0.2 型真空冷凍干燥機(jī) 沈陽(yáng)航天新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司；EV322 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；UV-2102PCS 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Unico 公司；WXG-4 圓盤(pán)旋光儀 上海浦東光學(xué)儀器廠；360 型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet 儀器公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀和XCT 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀HPLC-MS 美國(guó)Agilent公司；JM-L65 膠體磨 溫州強(qiáng)忠機(jī)械科技有限公司；板框過(guò)濾器 廊坊市頂天輕工機(jī)械有限公司；BS124S 電子分析天平 德國(guó)賽多利斯；SMZ18 體視顯微鏡 日本Nikon 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 原料預(yù)處理過(guò)程如下：杏鮑菇廢棄菌渣切碎后用膠體磨粉碎，在100 ℃下水煮2 h，冷卻后經(jīng)板框過(guò)濾；濾液用于提取杏鮑菇多糖，殘?jiān)?%的NaOH 回流煮沸2 h（液固比為4 mL/g）以除去蛋白質(zhì)，冷卻壓濾，殘?jiān)粗林行?；再?%的HAc 煮沸2 h（液固比為4 mL/g），冷卻壓濾，殘?jiān)粗林行?，干燥粉碎，即得預(yù)處理殘?jiān)?/p>

1.2.2 酸水解制備GAH 工藝 準(zhǔn)確稱取0.5 g 預(yù)處理殘?jiān)?，加入一定濃度的鹽酸溶液，控制液固比、溫度和時(shí)間進(jìn)行冷凝回流提取，冷卻抽濾得濾液，并加入適量純水洗滌濾渣，合并濾液與洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至三分之一體積，以去除大部分鹽酸，再定容至100 mL 測(cè)定GAH 含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 鹽酸濃度對(duì)GAH 得率的影響 設(shè)置水解時(shí)間3 h，水解溫度95 ℃，液固比4 mL/g，考察鹽酸濃度（質(zhì)量百分濃度分別為12%、18%、24%、30%和36%）對(duì)GAH 得率的影響。

1.2.3.2 水解時(shí)間對(duì)GAH 得率的影響 設(shè)置鹽酸濃度36%，水解溫度95 ℃，液固比4 mL/g，考察水解時(shí)間（分別為2、3、4、5 和6 h）對(duì)GAH 得率的影響。

1.2.3.3 水解溫度對(duì)GAH 得率的影響 設(shè)置鹽酸濃度36%，水解時(shí)間3 h，液固比4 mL/g，考察水解溫度（分別為60、70、80、90 和100 ℃）對(duì)GAH 得率的影響。

1.2.3.4 液固比對(duì)GAH 得率的影響 設(shè)置鹽酸濃度36%，水解時(shí)間3 h，水解溫度95 ℃，考察液固比（分別為3、4、5、6 和7 mL/g）對(duì)GAH 得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)參數(shù)，以GAH 得率（Y）為考察指標(biāo)，鹽酸濃度（A），水解時(shí)間（B）、水解溫度（C）及液固比（D）為自變量，應(yīng)用Box-Behnken Design 進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化GAH制備工藝的因素水平Table 1 Factors and levels of GAH preparation process by Box-Behnken design-response surface method

1.2.5 GAH 純化

1.2.5.1 活性炭脫色 準(zhǔn)確稱取20 g 預(yù)處理原料，按1.2.2 方法的最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行水解。水解液中加入2%活性炭，在80 ℃脫色2 h，冷卻抽濾，除去活性炭，得到澄清GAH 脫色液。

1.2.5.2 粗結(jié)晶 將GAH 脫色液進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，待濃縮瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)大量晶體時(shí)停止?jié)饪s，將濃縮液與晶體轉(zhuǎn)移至燒杯，加入過(guò)量95%乙醇并冷卻至4 ℃，過(guò)濾的濾渣為GAH 粗結(jié)晶。

1.2.5.3 重結(jié)晶 將GAH 粗結(jié)晶溶解于少量熱水中，趁熱過(guò)濾，并加入無(wú)水乙醇，持續(xù)攪拌1 h，冷卻至4 ℃，過(guò)濾得GAH 晶體，凍干得白色結(jié)晶粉末，即為GAH 純化樣品。

1.2.6 GAH 得率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18]中的Elson-Morgan 法進(jìn)行GAH 含量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0129x+0.1002；R2=0.9935，并按照下列公式計(jì)算GAH 得率。

式中：m 為樣品中GAH 質(zhì)量，g；m0為預(yù)處理殘?jiān)|(zhì)量，g。

1.2.7 HPLC-MS 分析 HPLC 色譜條件：精確配制5.0 mg/mL 的GAH 標(biāo)準(zhǔn)品和純化樣品，HPLC 檢測(cè)方法參照美國(guó)藥典方法略做修改[19]，即采用Stable Bond C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液（調(diào)pH3.0）（40/60）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)195 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

MS 條件：采用電噴霧負(fù)離子模式（ESI-），毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣為N2，脫溶劑溫度為350 ℃，脫溶劑氣流速為750 L/h，碰撞氣為高純Ar，離子檢測(cè)模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為90～620。

1.2.8 FT-IR 分析 采用KBr 壓片法對(duì)樣品進(jìn)行傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）分析[20]，將10 mg 該樣品置于瑪瑙缽中，以1/100 的比例加入干燥的KBr 粉末，研磨均勻，經(jīng)壓片機(jī)2 t 壓力壓成透明薄片，在波數(shù)4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行16 次紅外光譜掃描，觀察譜峰情況。

1.2.9 GAH 產(chǎn)品的理化指標(biāo)分析 GAH 純化樣品的理化指標(biāo)分析參照美國(guó)藥典43-國(guó)家處方集38（USP43-NF38）中Glucosamine hydrochloride 的雜質(zhì)限量檢測(cè)方法執(zhí)行[19]。其中Cl-和SO42-含量測(cè)定參照USP43-NF38 通則（221）執(zhí)行；pH 測(cè)定參照通則（791）；比旋光度測(cè)定參照通則（781S）；灰分測(cè)定參照通則（281）；As 含量測(cè)定參照通則（211）。

1.2.10 GAH 純化樣品對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響收集受精后0.75 h 以內(nèi)（單細(xì)胞時(shí)期）的胚胎，按60 枚/組分為六組，分別用濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%（w/v）的GAH 純化樣品溶液持續(xù)處理72 h。每12 h 更換一次培養(yǎng)液，同時(shí)挑出死亡胚胎或畸形嚴(yán)重導(dǎo)致發(fā)育停滯的胚胎。收集72 h時(shí)期的幼魚(yú)，觀察其整體發(fā)育情況，重點(diǎn)觀察胚胎的心臟是否有畸形水腫或充血，以及黑色素、黃色素的堆積情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的不同表型進(jìn)行分類，如正常型即野生型，較輕微的異常表型I 型，明顯的異常表型II 型，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)這三種表型的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出百分比圖堆積圖。

1.2.11 原位雜交試驗(yàn) 收集受精后0.75 h 以內(nèi)（單細(xì)胞時(shí)期）的胚胎，分別用濃度為0、0.05%、0.1%和0.3%（w/v）的GAH 純化樣品溶液處理胚胎24 h，每一組的胚胎數(shù)不少于12 枚。待胚胎發(fā)育至24 h，采用蛋白酶脫膜，再用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，次日將固定的胚胎用甲醇進(jìn)行梯度脫水，直至換成100%的甲醇。本研究通過(guò)原位雜交檢測(cè)tgfβ1a和tgfβ2的時(shí)空表達(dá)，整胚原位雜交方案是在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改[21-22]，在雜交溫度、雜交時(shí)間進(jìn)行了微調(diào)，如雜交溫度改為60 ℃，雜交時(shí)間延長(zhǎng)至16 h。染色之后的胚胎泡在甘油中4 ℃保存待拍照。原位雜交的胚胎用帶有數(shù)碼攝頭的尼康SMZ18 體式顯微鏡拍照，圖像使用Photoshop 軟件處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)做3 次平行，所有數(shù)據(jù)均用平均值表示。采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用One-Way ANOVA 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。利用Design-Expert 13 軟件做響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鹽酸濃度對(duì)GAH 得率的影響 如圖1A 所示，鹽酸濃度對(duì)杏鮑菇殘?jiān)乃庥绊懞艽?。隨著鹽酸濃度的增加，GAH 得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在鹽酸濃度為30%時(shí)，GAH 得率最高為19.40%。適宜濃度的鹽酸有利于杏鮑菇甲殼素酰胺鍵的破壞，進(jìn)而釋放出GAH。當(dāng)鹽酸濃度較低時(shí)，酰胺鍵難以被打開(kāi)，導(dǎo)致水解不完全[12]，隨著鹽酸濃度的增加，水解效果越加明顯。然而，當(dāng)鹽酸濃度過(guò)高時(shí)，水解溶液的粘壁炭化現(xiàn)象也更加顯著，影響了水解效率，因此GAH 得率反而沒(méi)有提升。

圖1 不同提取因素對(duì)GAH 得率的影響Fig.1 Effects of different extraction factors on the yields of GAH

2.1.2 水解時(shí)間對(duì)GAH 得率的影響 如圖1B 所示，水解時(shí)間對(duì)于GAH 得率有一定的影響。在一定的溫度下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，杏鮑菇殘?jiān)恢鸩剿?，GAH 含量逐漸增加，在反應(yīng)4 h 時(shí)GAH 得率達(dá)到最大值為22.37%。隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，得率開(kāi)始逐步下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得GAH又發(fā)生復(fù)合與再分解反應(yīng)[23]。因此，4 h 為水解的最佳時(shí)間。

2.1.3 水解溫度對(duì)GAH 得率的影響 如圖1C 所示，溫度對(duì)GAH 得率有顯著影響。隨著溫度的升高，GAH 得率明顯提高，在溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，GAH 得率最高為23.11%，進(jìn)一步提高溫度，GAH 得率反而下降。溫度是影響水解反應(yīng)的重要因素，反應(yīng)溫度越高，越有利于水解反應(yīng)的發(fā)生。但是試驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，溫度過(guò)高，水解得到的樣品溶液顏色加深，可能是氧化和焦化等副反應(yīng)導(dǎo)致副產(chǎn)物增多[24]。另一方面，溫度越高，鹽酸的揮發(fā)性越強(qiáng)，也可能導(dǎo)致GAH 得率下降。

2.1.4 液固比對(duì)GAH 得率的影響 如圖1D 所示，液固比對(duì)水解反應(yīng)影響較小，隨著液固比的增大，GAH 得率變化范圍較小。當(dāng)液固比為5 mL/g 時(shí)GAH 得率最高達(dá)21.71%。鹽酸作為水解催化劑[12]，用量過(guò)少，則水解反應(yīng)不充分，且水解速率慢，產(chǎn)率低；但鹽酸用量過(guò)高，既增加成本和能耗，產(chǎn)率也沒(méi)明顯提高。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

2.2.1 模型的建立和顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 13 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到鹽酸濃度（A）、水解時(shí)間（B）、水解溫度（C）及液固比（D）與GAH 得率（Y）之間的回歸方程為：

回歸模型的方差分析及顯著性分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis and significance test of the regression model

F值越大和P值越小越能代表相關(guān)系數(shù)的顯著性[25-26]。由表3 可知，該回歸模型的F值102.94，P值＜0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明差異不顯著；變異系數(shù)C.V.為2.36%（＜10%），表明實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度高。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9904，說(shuō)明該模型擬合度高，可預(yù)測(cè)實(shí)際試驗(yàn)中99.04%的結(jié)果。校正決定系數(shù)R2Adj=0.9808 和預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2Pred=0.9477 比較高且數(shù)值相近，即差值低于0.2，表明回歸模型能充分解釋本工藝過(guò)程[26-27]。精密度（Adeq Precision=38.7477）是有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4 視為合理。因此，可以用此模型來(lái)解釋和預(yù)測(cè)杏鮑菇下腳料酸解制備工藝的各影響因素對(duì)GAH 得率的影響。

根據(jù)P值可以看出模型中一次項(xiàng)中A 和C 對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.0001），B 對(duì)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），D 對(duì)響應(yīng)值影響不顯著（P＞0.05）。交互項(xiàng)中BC 對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.001），AC 對(duì)響應(yīng)值影響較顯著（P＜0.01），其余四組交互項(xiàng)對(duì)GAH 的得率無(wú)顯著影響。二次項(xiàng)中A2、B2、C2和D2對(duì)響應(yīng)值影響均極顯著（P＜0.0001）。因此，影響GAH 得率的因素依次為鹽酸濃度（A）＞水解溫度（C）＞水解時(shí)間（B）＞液固比（D）。

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面曲面的坡度和等高線圖的性狀可反映該因素交互作用對(duì)GAH 得率影響的強(qiáng)弱程度[28-29]。鹽酸濃度、水解時(shí)間、水解溫度及液固比對(duì)GAH 得率的影響如圖2 所示。

圖2 各因素對(duì)GAH 得率的交互作用響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagrams of the interaction of different factors to the GAH yields

由圖2B 可知，鹽酸濃度和水解溫度交互項(xiàng)響應(yīng)面坡度較陡，對(duì)應(yīng)的等高線比較密集，且呈橢圓形，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)GAH 得率有顯著影響，并且當(dāng)鹽酸濃度較低時(shí)，GAH 得率隨著溫度的升高先上升后下降；當(dāng)鹽酸濃度較高時(shí)，GAH 得率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。此外，水解溫度和水解時(shí)間的交互作用（圖2D）也呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)，對(duì)GAH 得率影響顯著。

鹽酸濃度和水解時(shí)間/液固比交互響應(yīng)面坡度較平緩（圖2A 和圖2C），雖然等高線呈橢圓形，但是在鹽酸濃度一定時(shí)，隨著水解時(shí)間/液固比的增加GAH 得率變化不大，說(shuō)明其交互作用對(duì)GAH 得率無(wú)顯著影響。液固比和水解時(shí)間交互響應(yīng)面坡度更加平緩（圖2E），而且等高線呈圓形，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)GAH 得率無(wú)顯著影響。水解溫度和液固比交互響應(yīng)面坡度平緩（圖2F），等高線也呈橢圓形，但是比較稀疏，而且在水解溫度一定時(shí)，隨著液固比的增加GAH 得率變化不大，說(shuō)明液固比對(duì)GAH 得率的影響相對(duì)較小。

2.2.3 最佳工藝的確定及驗(yàn)證 根據(jù)回歸模型可得酸水解制備GAH 的最佳工藝條件為：鹽酸濃度31.17%、時(shí)間4.05 h、溫度82.07 ℃、液固比5 mL/g，在此條件下GAH 得率最高，理論值為23.78%。為驗(yàn)證上述回歸模型的準(zhǔn)確性，本文根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)情況對(duì)理論最佳工藝條件進(jìn)行調(diào)整：鹽酸濃度31%、時(shí)間4 h、溫度82 ℃、液固比5 mL/g。經(jīng)3 次重復(fù)試驗(yàn)后，得到的GAH 得率為23.61%，與理論值差異不顯著。由此證明試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠碛行?，并且GAH 得率顯著高于文獻(xiàn)報(bào)道的5.23%[23]。

2.3 HPLC-MS 分析

2.3.1 HPLC 分析 由圖3 可知，GAH 純化樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間（分別為1.192 min 和1.185 min）基本相同，而且峰形對(duì)稱，無(wú)其他雜質(zhì)峰。并且，在濃度相同情況下，GAH 純化樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的主峰峰面積占比分別為97.83%和95.96%，意味著GAH 純化樣品的純度是標(biāo)準(zhǔn)品的101.9%。

圖3 GAH 純化樣品HPLC 圖Fig.3 HPLC chromatogram of GAH-purified sample

2.3.2 MS 分析 圖4 為GAH 標(biāo)準(zhǔn)品和純化樣品的MS 譜圖，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，二者有極高的相似度，均在低質(zhì)譜區(qū)出現(xiàn)了豐度最大的碎片離子（質(zhì)荷比m/z為214.1），可能是GAH 失去一個(gè)H+的[M-H+]碎片離子，因此，推測(cè)該化合物的分子量為215.1，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30]。

圖4 GAH 純化樣品MS 圖Fig.4 Mass spectrogram of GAH-purified sample

2.4 FT-IR 分析

據(jù)文獻(xiàn)[24,30]報(bào)道顯示，3292 cm-1是N-H 鍵的伸縮振動(dòng)，2943 cm-1是C-H 鍵的伸縮振動(dòng)，1616 cm-1是N-H 鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)、1065 cm-1是C-N 鍵的伸縮振動(dòng)，912 cm-1N-H 鍵的面外彎曲振動(dòng)。GAH純化樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖如圖5 所示，二者均在3292、2943、1616、1065 和912 cm-1附近存在特征吸收峰，說(shuō)明本工藝制備的GAH 純化樣品與標(biāo)準(zhǔn)品紅外圖譜基本吻合。

圖5 GAH 純化樣品紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of GAH-purified sample

2.5 GAH 產(chǎn)品主要指標(biāo)分析

GAH 純化樣品各種理化指標(biāo)如表4 所示，pH為4.1，比旋光度為+72.0°，符合美國(guó)藥典USP43-NF38 的要求。并且，重金屬砷僅為0.21 μg/g，明顯低于藥典的限量標(biāo)準(zhǔn)。此外，Cl-含量為16.42%，SO42-含量低于0.002%；灰分和干燥失重分別為0.04%和0.89%。因此，GAH 純化樣品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合甚至優(yōu)于USP43-NF38 的規(guī)定，尤其在砷含量方面具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。

表4 GAH 純化樣品主要理化指標(biāo)Table 4 Main physical and chemical indexes of GAH-purified sample

2.6 GAH 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響

斑馬魚(yú)由于基因背景與哺乳動(dòng)物相似、胚胎體表透明便于觀察、繁殖量大、發(fā)育快速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于疾病模型構(gòu)建和高通量藥物篩選研究，近年來(lái)斑馬魚(yú)胚胎常被用于環(huán)境毒理測(cè)試中，是優(yōu)良的模式動(dòng)物。利用這個(gè)模式動(dòng)物，我們前期的研究表明，雙孢蘑菇來(lái)源的GAH 對(duì)斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育及損傷修復(fù)有良好的治療效果，效果甚至優(yōu)于臨床常見(jiàn)的抗骨質(zhì)疏松藥物阿侖膦酸鈉[31-32]。因此，本文同樣利用斑馬魚(yú)動(dòng)物模型來(lái)初步探索杏鮑菇來(lái)源GAH 的毒性及生物活性。首先采用1.2.10 的給藥方法進(jìn)行處理，檢測(cè)了不同GAH 濃度對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明，不同濃度下的GAH 能導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育出現(xiàn)不同程度的異常，不僅如此，GAH 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎黑色素和黃色素的發(fā)育都有明顯的抑制作用。依據(jù)表型的嚴(yán)重程度將其分為三類，其中正常表型為野生型；較輕微的異常表型I 型表現(xiàn)為心包腫大，背部及卵黃處的色素堆積有輕微減少；嚴(yán)重的異常表型II 型表型為心包腫大、輕微出血，體表色素堆積明顯減少（圖6A）。隨著GAH 濃度升高，收集的斑馬魚(yú)數(shù)量逐漸減少，可能是因?yàn)楦邼舛葧?huì)導(dǎo)致胚胎死亡，通過(guò)對(duì)每一組中不同表型的胚胎數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，中高濃度下（0.3～0.5%）的GAH 引發(fā)的胚胎發(fā)育異常比例都超過(guò)50%以上（圖6B）。

圖6 GAH 純化樣品對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響Fig.6 Effects of GAH-purified sample on embryonic development of zebrafish

TGF-β信號(hào)通路幾乎存在于所有多細(xì)胞動(dòng)物中且在進(jìn)化上高度保守，對(duì)生物體胚胎發(fā)育、成熟及疾病進(jìn)展都具有重要的功能。斑馬魚(yú)中存在4 個(gè)tgfβ配體，即tgfβ1a、tgfβ1b、tgfβ2 和tgfβ3。斑馬魚(yú)胚胎在0.05%、0.1%和0.3%的GAH 純化樣品浸泡24 h 后，通過(guò)整胚原位雜交檢測(cè)tgfβ1a 和tgfβ2 的mRNA 時(shí)空分布（圖6C），結(jié)果表明：與對(duì)照組（Ctr）相比，處理組中60%以上的胚胎tgfβ1a、tgfβ2mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)，尤其是0.3%濃度下，上述基因在端腦、前端神經(jīng)系統(tǒng)、脊索以及尾部的表達(dá)強(qiáng)度明顯增加，初步提示GAH 對(duì)TGF-β信號(hào)通路及調(diào)控的生理過(guò)程可能具有促進(jìn)作用。

綜上，GAH 可能通過(guò)影響Tgf-β信號(hào)通路成員的mRNA 表達(dá)影響斑馬魚(yú)胚胎的早期發(fā)育，揭示以杏鮑菇為原料制備的GAH 具有值得探究的生物活性。

3 結(jié)論

本文研究了以杏鮑菇廢棄菌渣為原料的GAH制備工藝、質(zhì)量指標(biāo)及其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的影響。酸解制備GAH 的最優(yōu)工藝參數(shù)為：鹽酸濃度31%、時(shí)間4 h、溫度82 ℃、液固比5 mL/g，在此條件下GAH 得率為23.61%。HPLC-MS、FT-IR 和相關(guān)理化指標(biāo)分析結(jié)果顯示，GAH 純化樣品純度為標(biāo)準(zhǔn)品的101.9%，分子量為215.1，紅外譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品基本吻合，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合甚至優(yōu)于USP43-NF38 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中砷含量?jī)H0.21 μg/g。斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度GAH 會(huì)引起斑馬魚(yú)胚胎不同程度的發(fā)育異常，中高濃度（0.3%～0.5 %）的GAH 引發(fā)的斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育異常比例超過(guò)50%，且0.3%的GAH 對(duì)TGF-β信號(hào)通路具有明顯的促進(jìn)作用。

本研究充分利用杏鮑菇廢棄菌渣制備GAH，既為GAH 生產(chǎn)提供了一種高效制備方法，也為傳統(tǒng)的GAH 制備開(kāi)辟新的原材料來(lái)源，還為中國(guó)杏鮑菇產(chǎn)業(yè)占據(jù)30%的剩余物開(kāi)拓了其他應(yīng)用途徑。本研究的研究方法對(duì)促進(jìn)杏鮑菇產(chǎn)業(yè)多元化良性發(fā)展具有重要的參考價(jià)值，但在研究中仍存在因使用鹽酸的而帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題，后期研究將集中于鹽酸替代試劑的研究，或通過(guò)構(gòu)建連續(xù)制備工藝以減少鹽酸用量。