莊乾飛，劉丹丹，陳澤雨，尚祖飛，劉曉燕,2,3，馬立志,2,3,

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽 550005；3.貴州省果品加工、貯藏與安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州貴陽 550005）

刺梨（Rose roxburghiiTratt）是薔薇屬植物繅絲花的果實，主要分布在我國的貴州、四川和云南等地，其中以貴州的刺梨資源最為豐富[1]。刺梨黃酮類化合物中包括木犀草素、兒茶素、異槲皮素、槲皮素、楊梅素、蘆丁、山奈素等多種有效成分，具有抗氧化[2]、輻射防護[3]、防治糖尿病[4-5]、預防動脈粥樣硬化[6]、抗癌[7]與抗凋亡[8-10]等生物活性。近年來，以無機鹽和短鏈醇為基礎的新型雙水相體系（Aqueous two-phase system，ATPS）[11-14]具有成本低、界面張力低、分辨率好、產率高、放大簡單等優(yōu)點，被認為是一種很有前景的提取技術，它具有提取和部分純化目標物的功能，還可以在獲得高得率的同時保持分子的生物活性。ATPS 應用于生物活性成分的提取技術已十分成熟，如酶[15]、蛋白質[16]、多糖[17-19]和黃酮等，但還未應用于刺梨黃酮的提取。

黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）是一種由兩個完全對稱亞單位組成的蛋白酶，是調控尿酸生成的關鍵酶。血液中尿酸含量增加會導致高尿酸血癥（Hyperurcicemia，HUA）[20]。多項研究表明黃酮類化合物諸如山奈素、落新婦苷及其異構體[21]、木犀草素、芹菜素、兒茶素等可以與黃嘌呤氧化酶的活性中心結合從而抑制其活性，這一發(fā)現提示黃酮類化合物或許可以作為HUA 的有效發(fā)生抑制劑。目前，HUA的治療主要集中在抑制尿酸生成和促進尿酸排泄上，代表藥物分別為別嘌醇和苯溴馬隆[22]。然而，這些藥物在臨床應用中有著嚴重的副作用，如肝腎毒性和Stevens-Johnson 綜合征等[23]，因此尋找更加安全的植物提取物治療HUA 迫在眉睫。

當前有關刺梨黃酮雙水相萃取的工藝優(yōu)化和其抑制XOD 活性方面的研究資料較少。植物提取物治療HUA 的研究主要集中在XOD 抑制劑的篩選[24-25]和影響尿酸轉運蛋白的表達上[26-27]。因此，本試驗以刺梨為原料，旨在構建超聲波輔助乙醇（C2H5OH）-硫酸銨（（NH4）2SO4）雙水相萃取刺梨黃酮的技術體系以及確定最佳提取工藝，為深入開發(fā)植物資源和工業(yè)生產中高效提取刺梨黃酮提供科學依據，并通過對刺梨黃酮提取物抑制黃嘌呤氧化酶效果的研究，為發(fā)現一種天然黃嘌呤氧化酶抑制劑及刺梨功能活性的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨鮮果 購自貴州恒力源生物科技有限公司；XOD（50 U/mg）、黃嘌呤（98%）、蘆?。?5%）、別嘌醇（98%） BR，均購自上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、EDTA-2Na、硫酸銨、乙醇 均為分析純；水為純水。

SCIENTZ-18N 冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；CS-2000Y 超帥多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿有限公司；FA2004N 電子天平 上海菁海儀器有限公司；KQ-400KDE 型高功率數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；THERMO 酶標儀 百樂科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將刺梨鮮果切片后冷凍干燥，粉碎過100 目篩后放入保鮮袋，于2 ℃冰箱中保存。

1.2.2 C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相相圖繪制 采用濁度滴定法[28]繪制C2H5OH-（NH4）2SO4雙水相相圖中雙節(jié)線。向40% （NH4）2SO4溶液中滴加無水乙醇至溶液渾濁，記錄加入C2H5OH 溶液的質量，后加入蒸餾水至溶液澄清，記錄加入蒸餾水的質量。反復操作并記錄，操作完成之后計算出記錄的C2H5OH-（NH4）2SO4質量濃度，繪制相圖。

1.2.3 刺梨黃酮標準曲線的繪制 采用亞硝酸鈉（NaNO2）-硝酸鋁（Al（NO3）3）比色法[29]。配制1 mg/mL 的蘆丁標準溶液，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 標準液，用70%乙醇定容至1 mL，取50 μL 至96 孔板后加入30 μL 5%NaNO2，靜置6 min，再加入30 μL 10%Al（NO3）3，靜置6 min，加入100 μL 4%NaOH，反應30 min 后于510 nm 處測吸光值，繪制標準曲線得到回歸方程A=1.3994x-0.0002，R2=0.9991。

1.2.4 構建雙水相體系 固定體系質量為50 g，根據乙醇-硫酸銨雙水相相圖，選取14%、16%、18%、20%、22%的硫酸銨質量分數和28%、30%、32%、34%、36%的乙醇質量分數，考察硫酸銨質量分數對黃酮得率的影響時，固定乙醇質量分數為28%；考察乙醇質量分數對黃酮得率的影響時選取最佳硫酸銨質量分數，測定硫酸銨質量分數和乙醇質量分數對刺梨黃酮得率的影響。在100 mL 離心管中構建49.00 g 雙水相體系（例：49.00 g 32%C2H5OH-20%（NH4）2SO4雙水相體系，稱取9.80 g 硫酸銨和15.68 g無水乙醇，剩余質量由蒸餾水補充，混合均勻）后加入1.00 g 的刺梨粉末，將離心管置于超聲清洗器中超聲，固定功率400 W，溫度50 ℃，超聲30 min。用布氏漏斗抽濾，濾液置于分液漏斗中靜置20 min 使其分相完全，分離后分別測量上下相體積，計算相比（R）；取上下相溶液測定其黃酮得率（Y），計算刺梨黃酮的分配系數（K）和萃取率（X）[30]。

式中：Vt、Vb 為上、下相體積，mL；Ct、Cb 為上、下相溶液黃酮濃度，mg/mL；n 為稀釋倍數；m 為刺梨粉的質量，g。

1.2.5 單因素實驗 分別考察超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）及料液比（D）對刺梨黃酮得率的影響。

1.2.5.1 超聲功率對刺梨黃酮得率的影響 固定體系質量為50 g，考察不同的功率對黃酮得率的影響，在離心管中加入32% C2H5OH，加入20% （NH4）2SO4，加入1.00 g 刺梨粉，剩余質量由蒸餾水補充，按照1.2.4 方法進行實驗，超聲功率分別設置為240、280、320、360、400 W，其它條件不變。

1.2.5.2 超聲時間對刺梨黃酮得率的影響 考察不同的超聲時間對黃酮得率的影響，固定超聲功率為上述條件最優(yōu)值，對其進行超聲處理，時間分別為 10、20、30、40、50 min，其他條件不變。

1.2.5.3 超聲溫度對刺梨黃酮得率的影響 固定超聲功率和時間為上述實驗的最優(yōu)值，其他條件不變，溫度分別設置為30、40、50、60、70 ℃，考察不同的溫度對黃酮得率的影響。

1.2.5.4 料液比對刺梨黃酮得率的影響 考察不同的料液比對黃酮得率的影響，固定超聲功率、時間和溫度為上述實驗的最優(yōu)值，其它條件不變，料液比分別設置為1:29、1:39、1:49、1:59、1:69（g/g）。

1.2.5.5 響應面試驗 通過單因素實驗結果確定4 個因素的較優(yōu)水平范圍，以黃酮得率為響應值，設計4 因素3 水平的響應面試驗，如表1 所示。

1.2.6 刺梨黃酮提取物抑制黃嘌呤氧化酶活性研究 將優(yōu)化工藝條件下的刺梨黃酮提取液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

在酶促反應過程中，XOD 是通過調節(jié)兩個基本氧化反應控制尿酸產生的關鍵酶，包括催化次黃嘌呤轉化為黃嘌呤和黃嘌呤轉化為尿酸[31]。取刺梨黃酮提取物凍干粉末，用蒸餾水配制8、10、12、14、16、18、20 mg/mL 濃度的提取液，按照表2 中各物質添加量進行試驗，向96 孔板依次加入磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.5、50 mmol/L、含200 μmol/L EDTA-2Na）、刺梨黃酮提取液、黃嘌呤氧化酶（0.1 U/mL）溶液，在37 ℃下孵育5 min 后，加入底物黃嘌呤溶液（0.15 mmol/L），在37 ℃下反應20 min 后，于295 nm 處測定吸光值[32]。

表2 酶活測定體系的組成（μL）Table 2 Composition of the enzyme activity assay system (μL)

式中，AE=A對照組-A空白對照組；AI=A樣品組-A空白組。

1.3 數據處理

所有數據均為3 次重復實驗的平均值，所有實驗數據運用SPSS 25 進行顯著性分析及Origin 2017軟件繪制趨勢曲線圖；響應面實驗采用Design-Expert 11 軟件進行方差分析，半抑制濃度（IC50）通過SPSS 25 軟件計算。

2 結果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖和雙水相體系確定

2.1.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖 由圖1 可知，C2H5OH-（NH4）2SO4在較大濃度范圍內均具有良好的成相能力，與報道一致[33]；雙節(jié)線上的點為臨界點，雙節(jié)線以下的區(qū)域，兩種溶劑均溶于水而不分相，稱為均相區(qū)；而體系總組成配比取在雙節(jié)線上方的區(qū)域，體系就會分為兩相，稱為雙相區(qū)。其中上相為富乙醇相，下相為富鹽相，黃酮類物質極性較小而富集于上相。因此，在實驗時，乙醇和硫酸銨的配比應取在雙節(jié)線上方，并取上相溶液作為待測液進行研究。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system

2.1.2 雙水相體系確定

2.1.2.1 硫酸銨質量分數對刺梨黃酮分相萃取的影響 圖2 表明，（NH4）2SO4質量分數小于20%時，黃酮得率、萃取率和分配系數均隨著質量分數的增加而增加（P＜0.05），當（NH4）2SO4質量分數為20%時，刺梨黃酮得率（116.57 mg/g）、萃取率（63.47%）及分配系數（1.57）均達到最高；當（NH4）2SO4質量分數超過20%后，（NH4）2SO4在雙水相體系會在中析出，會造成硫酸銨和乙醇對水分子的競爭，極性增大[34]，使上相乙醇的體積減小，從而導致刺梨黃酮的溶出受到抑制，使萃取率和分配系數下降。因此C2H5OH-（NH4）2SO4ATPS 中（NH4）2SO4的最佳添加質量分數為20%。

2.1.2.2 乙醇質量分數對刺梨黃酮分相萃取的影響

如圖3 所示，隨著C2H5OH 質量分數增加，刺梨黃酮得率、萃取率和分配系數呈先增大后減小的趨勢（P＜0.05）。乙醇質量分數為32%時，3 個指標均達到最大值，分別為122.79 mg/g、95.98%和11.141，而后隨著C2H5OH 質量分數的增加，3 個指標均出現下降。這可能是黃酮在乙醇中的溶解度更大，隨著C2H5OH 質量分數增加，ATPS 的分相能力增加[35]，而在C2H5OH 質量分數過高時，會導致下相鹽的析出，同時其他物質在上相中的溶出量也大大增加，這會導致黃酮的析出減少[36]。因此確定C2H5OH-（NH4）2SO4ATPS 最佳的乙醇質量分數為32%。

圖3 C2H5OH 質量分數對黃酮得率、萃取率及分配系數的影響Fig.3 Effect of ethanol mass fraction on the yield of flavonoids, extraction rate and partition coefficient

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲功率對黃酮得率的影響 如圖4 所示，刺梨黃酮的得率隨著超聲功率的增加而呈先增加后降低的趨勢，當超聲功率達到320 W 時，得率達到最大值125.48 mg/g，而當超聲功率超過320 W 后，黃酮得率略有減小，無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于超聲波加速了刺梨粉在提取液中運動，從而增加黃酮的溶出，繼續(xù)增大超聲功率時，功率過大導致刺梨細胞過度破碎，刺梨黃酮類成分發(fā)生聚合或分解等反應[37]，造成刺梨黃酮得率下降。因此，當超聲功率為320 W 時，刺梨黃酮得率較好。

圖4 超聲功率對刺梨黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoids

2.2.2 超聲時間對黃酮得率的影響 由圖5 知，刺梨黃酮得率隨著時間的增加，出現先上升（P＜0.05）后下降的趨勢，當超聲時間增加到30 min 時，黃酮得率達到峰值125.34 mg/g，隨后降低。隨著超聲時間延長，細胞裂解完全，黃酮得率增加；超過一定時間,可能會使刺梨中的皂苷類等物質溶出，使黃酮類物質在上相的溶出量減少[37]。因此，確定黃酮超聲提取的最適時間為30 min。

圖5 超聲時間對刺梨黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoids

2.2.3 超聲溫度對黃酮得率的影響 如圖6 所示，刺梨黃酮得率隨著溫度的增加，出現先上升后下降的趨勢（P＜0.05），當超聲溫度達到50 ℃刺梨黃酮得率達到峰值，為125.29 mg/g，繼續(xù)增大超聲溫度，黃酮得率下降?？赡苁钱擜TPS 溫度過高時，黃酮類成分發(fā)生結構變化甚至氧化分解等反應[38]。因此，當超聲提取溫度為50 ℃時，黃酮得率較高。

圖6 超聲溫度對刺梨黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoid

2.2.4 料液比對黃酮得率的影響 由圖7 顯示，隨著料液比的增大，刺梨黃酮得率出現先上升后下降的趨勢（P＜0.05）。當料液比為1:59（g/g）時，刺梨黃酮得率最大，達到137.19 mg/g，可能是溶劑增多導致提取液與刺梨粉末接觸面積增大，促進黃酮類成分自刺梨粉中溶出。但當液料比繼續(xù)增加到1:69（g/g）時，黃酮得率顯著下降（P＜0.05）。可能是由于上相體積增大導致黃酮濃度下降，同時還會造成其他物質的溶出加劇，也會抑制黃酮的提取[36]。除此之外，料液比過大會造成C2H5OH 和（NH4）2SO4使用量增加，增加生產成本。綜上所述最適料液比為1:59（g/g）。

圖7 料液比對刺梨黃酮得率的影響Fig.7 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of Rose roxburghii Tratt flavonoid

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗結果分析 采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化雙水相萃取刺梨黃酮的結果如表3 所示。

表3 試驗設計及對應的響應值Table 3 Experimental design and corresponding response values

采用Design-Expert11 對刺梨黃酮得率結果進行擬合，得到回歸方程如下：

方差分析結果如表4 所示，回歸模型達到極顯著水平（P＜0.01），實測值與預測值相近，試驗決定系數R2=0.9801、校正決定系數R2adj=0.9601 和變異系數C.V.%=2.13%，表明模型擬合程度較好；超聲功率、超聲時間、超聲溫度及料液比之間相互作用的響應面曲線圖如圖8 所示。通過響應面圖可直觀地看出各因素之間相互影響的顯著性，模型中的AD、BD 對刺梨黃酮得率的影響差異極顯著（P＜0.01），AB、AC、BC、CD 對刺梨黃酮得率的影響差異不顯著（P＞0.05），此模型可以對雙水相提取刺梨黃酮的結果進行分析和預測。4 個因素對刺梨黃酮得率的影響次序為B＞D＞A＞C，即超聲時間＞料液比＞超聲功率＞超聲溫度。

圖8 各因素對響應值影響的曲面圖Fig.8 Surface plot of the influence of various factors on the response value

表4 二次模型方差統(tǒng)計分析Table 4 Anaiysis of the variance (ANOVA) for the second-order polynomial model

2.3.2 最佳工藝條件的預測及驗證實驗 根據Box-Behnken 響應面模型，以最大得率為指標，預測的雙水相提取刺梨黃酮的最佳工藝條件為：超聲功率322.78 W，時間為30.35 min，溫度49.39 ℃，料液比1:58.66 g/g，理論黃酮得率為141.69 mg/g，為了驗證預測值的準確性，兼顧實際應用，將最佳工藝條件調整為：超聲功率320 W，時間為30 min，溫度50 ℃，料液比1:59 g/g，在此工藝條件下進行驗證，平行試驗3 次，測得刺梨黃酮平均得率為（140.57±1.78） mg/g，與預測值較近，表明該模型適用于刺梨黃酮的提取，所得刺梨黃酮純度可達18.72%。

2.4 刺梨黃酮提取物對XOD 的抑制效果分析

研究發(fā)現，活性物如：木犀草素、芹菜素[39]、表沒食子兒茶素[40]、槲皮素[41]等黃酮類物質可以通過與XOD 活性中心結合從而抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少尿酸生成。如圖9 所示，刺梨黃酮提取物對XOD 表現出較好的抑制作用，且隨著刺梨黃酮提取物濃度的增加，抑制率也逐漸升高，表現出較好劑量-效應關系；通過SPSS 分析計算，得到刺梨黃酮提取物對XOD 的IC50為12.72 mg/mL，與0.24 mmol/L（0.0324 mg/mL）別嘌醇抑制率相當，與葛根水提物（11.24 mg/mL）和老鸛草水提物（11.61 mg/mL）[42]、辣木葉的醇提物（10.55 mg/mL）[43]、銀杏葉醇提物（13.67 mg/mL）[44]抑制活性接近。證明刺梨黃酮提取物對于XOD 有較好的抑制效果，可以做為一種天然的XOD 活性抑制劑。

圖9 不同濃度的刺梨黃酮提取物和別嘌醇對黃嘌呤氧化酶活力的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Rose roxburghii Tratt extract and allopurinol on the activity of xanthine oxidase

3 結論

本研究采用超聲輔助雙水相技術提取刺梨黃酮，確定最佳提取工藝為：32% C2H5OH～20%(NH4)2SO4ATPS，超聲功率320 W，時間30 min，溫度50 ℃，料液比1:59 （g/g）。此工藝下刺梨黃酮的得率為140.57 mg/g，其對XOD 的抑制IC50值為12.72 mg/mL。本試驗表明刺梨黃酮提取物能夠較好的抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可以作為一種較好的天然XOD 抑制劑開發(fā)利用。