陳艷萍，賀菊萍，劉 意，楊萬根,,

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界 427000；2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221018；3.吉首大學(xué)食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南吉首 416000）

杜仲樹是我國的特有樹種，其葉在2018 年被列為我國的新食品原料。目前，我國的杜仲樹栽植面積已達(dá)35 萬hm2，在國內(nèi)27 個(gè)?。▍^(qū)、市）均有栽植，杜仲葉資源非常豐富[1]；但我國對(duì)杜仲葉開發(fā)研究的時(shí)間還不長，目前主要產(chǎn)品是杜仲葉茶、動(dòng)物飼料添加劑等初級(jí)加工產(chǎn)品，亟需對(duì)其開展深入研究，開發(fā)高附加值產(chǎn)品。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖往往具有抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4]、抗凝血[5]、調(diào)節(jié)腸道菌群[6]等生物活性，而多糖也是杜仲葉的主要成分之一，因此開發(fā)杜仲葉多糖的研究正變得日益廣泛。

杜仲葉多糖開發(fā)面對(duì)的問題之一是如何快速提取。常用的植物多糖提取技術(shù)有熱水提取、超聲波、微波、酶輔助提取等。熱水提取以水為提取溶劑，耗時(shí)長、效率低。超聲波輔助提取是利用頻率大于20 kHz 的超聲波產(chǎn)生強(qiáng)大壓力、剪切力破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速多糖向水中擴(kuò)散，提高提取效果。微波輔助提取是高頻電磁波使植物細(xì)胞內(nèi)外的溫度快速上升，植物細(xì)胞內(nèi)壓力超過細(xì)胞壁承受能力，細(xì)胞壁遭到破壞，其內(nèi)的有效成分流出[7]。超聲波提取有強(qiáng)烈的物理破碎和混合傳質(zhì)作用，但為提取溶液體系快速加熱的能力弱，而微波提取則相反，因此超聲波、微波輔助提取之間的互補(bǔ)性很強(qiáng)。近年出現(xiàn)了將兩種技術(shù)結(jié)合的超聲波-微波輔助提取技術(shù)，該技術(shù)呈現(xiàn)出高效、綠色等諸多優(yōu)勢(shì)，如HU 等[8]將此技術(shù)應(yīng)用于提取虎果仁油，提取率達(dá)到85.23%，JIANG 等[9]采用該技術(shù)從玉米麩皮中提取阿拉伯木聚糖，提取率達(dá)27.7%。目前還沒有發(fā)現(xiàn)超聲波-微波輔助提取技術(shù)在杜仲葉多糖提取中的應(yīng)用研究。

因此，本文以杜仲葉多糖為研究對(duì)象，開展超聲波-微波輔助提取杜仲葉多糖工藝條件優(yōu)化研究，并對(duì)所得精制多糖的單糖組成、分子量、體外抗凝血活性進(jìn)行分析，旨在為我國豐富的杜仲葉資源的高值化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 采摘于吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室杜仲基地；血漿 由湘西州人民醫(yī)院提供；石油醚（沸程30～60 ℃）、苯酚、濃硫酸、醋酸鈉、三氟乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀 Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、肝素鈉 北京索萊寶科技有限公司；APTT、PT、TT 試劑盒 武漢中太生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-果糖、D-核糖、氨基半乳糖鹽酸鹽、L-古洛糖醛酸、D-甘露糖醛酸 博睿糖生物公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

XH-300PE 超聲波高壓微波協(xié)同組合工作站北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；XN06-Ⅱ半自動(dòng)凝血分析儀 武漢景川診斷技術(shù)股份有限公司；Evolution 201 紫外可見光光度計(jì)、ICS5000 離子色譜儀（IC）、D-37520 離心機(jī) ThermoFisher 公司；UGC-24M 干式氮吹儀 力辰科技公司；LC-10A 高效液相色譜儀Shimadzu 公司；TENSOR 27 傅里葉紅外光譜儀Bruker 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲葉預(yù)處理 杜仲葉于60 ℃干燥至恒重，粉碎后，過60 目篩。用5 倍體積的石油醚于80 ℃水浴除去杜仲膠和脂類，再用5 倍體積的80%乙醇于80 ℃水浴除去單糖、雙糖、寡糖等物質(zhì)[10]，過濾，濾渣晾干后裝入塑封袋，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 杜仲葉多糖提取工藝 稱取3.0 g 處理后的杜仲葉粉，以一定的料液比加入蒸餾水，置于超聲波微波協(xié)同組合工作站中在常壓下以一定的超聲波功率、微波功率和提取溫度提取一定的時(shí)間。提取結(jié)束后，4000 r/min 離心10 min，上清液即為多糖提取液，重復(fù)提取三次，將提取液合并。多糖提取液于55 ℃減壓濃縮，在濃縮溶液中慢慢加入乙醇，4 ℃靜置12 h 后，4000 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗2 次，再將沉淀分散在少量蒸餾水中并凍干，得到杜仲葉粗多糖。

1.2.3 杜仲葉多糖含量測(cè)定及提取得率計(jì)算 采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)多糖含量。以蒸餾水為空白對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其回歸方程A=14.595C+0.00727，R2=0.999。將1.2.2 提取三次合并的多糖提取液定容于250 mL 容量瓶中，精密吸取1.0 mL，加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，測(cè)吸光度A，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖的質(zhì)量濃度C。按下式計(jì)算杜仲葉多糖得率Y（%）。

式中：C：待測(cè)液中的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V：待測(cè)樣品液的體積，mL；n：樣品液的稀釋倍數(shù)；m：杜仲葉粉的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)常規(guī)量設(shè)為：超聲波功率110 W，提取溫度50 ℃，微波功率250 W，料液比1:20（g:mL），提取時(shí)間20 min。依次考察超聲波功率（50、70、90、110、130、150 W）、提取溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）、微波功率（100、150、200、250、300、350 W）、料液比（1:10、1:15、1:20 、1:25、1:30、1:35（g:mL））、提取時(shí)間（15、20、25、30、35、40 min）對(duì)多糖得率的影響。

1.2.5 Plackett-Burman 試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出關(guān)鍵因素，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of the Plackett-Burman experiment

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)，對(duì)篩選出的3 個(gè)關(guān)鍵因素采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of the Box-Behnken experiment

1.2.7 粗多糖的精制方法 Sevage 法[12]去蛋白：粗多糖溶液與Sevage 試劑（三氯甲烷:正丁醇=4:1，v/v）混合，去除游離蛋白，重復(fù)操作5 次，收集脫蛋白水相。

脫色：用1%活性炭進(jìn)行脫色。60 ℃條件下于搖床上120 r/min 振蕩30 min，過濾。

透析：用截留分子量3500 Da 的透析袋蒸餾水透析72 h，中間換水多次。

醇沉：將透析后的多糖溶液用95%乙醇調(diào)節(jié)至80%，4 ℃條件下靜置12 h，4000 r/min 離心10 min，用無水乙醇洗滌沉淀2 遍，凍干。

離子層析：稱取約100 mg 透析后多糖溶解在少量蒸餾水中，4000 r/min 離心10 min，取上清液加入DEAE-52 纖維素離子交換色譜柱（2.6×40 cm）中，先后用蒸餾水、1 mol/L NaCl 溶液洗脫，洗脫液流速5 mL/min。收集NaCl 溶液的洗脫液，經(jīng)截留分子量3500 Da 透析除去鹽離子，再60 ℃減壓濃縮至原體積1/10，凍干后得到杜仲葉精制多糖。

1.2.8 精制多糖的分子量分布分析 采用高效凝膠滲透色譜法[13]測(cè)定杜仲葉精制多糖分子量。色譜條件：色譜柱：BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱（8×300 mm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L NaCl 溶液；流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：RI-10A 示差檢測(cè)器。樣品配制成5 mg/mL 溶液，12000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL 進(jìn)樣瓶中測(cè)樣。

1.2.9 精制多糖的單糖組成分析 精密稱量5.0 mg樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L 三氟乙酸2 mL，120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至玻璃管中用氮?dú)獯蹈?，加? mL 去離子水渦旋混勻，吸取100 μL 加入900 μL 去離子水，12000 r/min 離心5 min。取上清進(jìn)IC 分析。

色譜條件：色譜柱Dionex CarbopacTMPA20（3×150 mm） ；流動(dòng)相：A：H2O；B：15 mmol/L NaOH；C：15 mmol/L NaOH & 100 mmol/L NaOAc；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器[13]。

1.2.10 精制多糖的光譜分析 取適量杜仲葉精制多糖溶液于石英比色皿中，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，掃描波長200～400 nm，掃描頻率為2 nm/s。

稱量1.0 mg 杜仲葉精制多糖樣品和100.0 mg溴化鉀于瑪瑙研缽中，研磨混勻成細(xì)粉后，壓制成透明薄片，用傅里葉紅外光譜儀掃描，掃描范圍4000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，累積掃描64 次。

1.2.11 精制多糖的體外抗凝血活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]測(cè)定。將杜仲葉精制多糖溶于生理鹽水，分別配成2、4、8 mg/mL，再將待測(cè)多糖與血漿以1:4 體積比混合均勻。分別以生理鹽水、肝素鈉溶液（2 μg/mL）做陰性和陽性對(duì)照，然后測(cè)定活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）三個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)其抗凝血活性。

a. APTT 的測(cè)定：取100 μL 預(yù)熱的37 ℃待測(cè)混合血漿，加入100 μL 的APTT，預(yù)熱 3 min，再加100 μL 預(yù)熱的氯化鈣溶液（0.025 mol/L）并混合均勻，儀器計(jì)時(shí)。

b. PT 的測(cè)定：取100 μL 預(yù)熱的37 ℃待測(cè)混合血漿，加入200 μL 預(yù)熱的PT，混合均勻，儀器計(jì)時(shí)。

c. TT 的測(cè)定：取100 μL 預(yù)熱的37 ℃待測(cè)混合血漿，加入100 μL 預(yù)熱的TT，混合均勾，儀器計(jì)時(shí)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)三次操作，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。Design-Expert 8.0.6 軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行ANOVA 分析，Origin 2019b 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對(duì)杜仲葉多糖得率的影響 圖1顯示，隨著超聲波功率由50 W 增大到70 W，杜仲葉多糖得率呈增長趨勢(shì)，這是因?yàn)槌暡栈?yīng)產(chǎn)生的微射流和沖擊波有利于植物材料中多糖的溶解和擴(kuò)散[15]；但繼續(xù)增大超聲波功率，多糖降解，多糖得率比之前降低；但是超聲波功率繼續(xù)增大到130 W 時(shí)，由于超聲波的空化作用更大，植物材料結(jié)構(gòu)受到更大的影響，多糖更易從植物組織里溶出，這時(shí)多糖得率達(dá)到最大值3.45%±0.12%。然而，繼續(xù)增大超聲波功率，多糖得率下降，這是因?yàn)檫^高的超聲波功率會(huì)產(chǎn)生大量的微小氣泡，使空化效應(yīng)下降[16]。超聲波功率130 與110、150 W 之間的多糖得率差異顯著（P＜0.05），因此后續(xù)試驗(yàn)中超聲波功率取值范圍為110～150 W。

圖1 超聲波功率對(duì)杜仲葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.2 提取溫度對(duì)杜仲葉多糖得率的影響 圖2 顯示，當(dāng)提取溫度從40 ℃升高到50 ℃時(shí)，杜仲葉多糖得率逐漸增大，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值3.54%±0.05%，但進(jìn)一步升高溫度至55 ℃，杜仲葉多糖得率反而下降。這可能是由于溫度在一定范圍內(nèi)的升高有利于多糖從細(xì)胞中溶出，但隨著系統(tǒng)溫度的升高，超聲空化氣泡的溫度和壓力也會(huì)降低，過高的系統(tǒng)溫度會(huì)降低空化效應(yīng)，從而導(dǎo)致多糖得率下降[17]。而溫度升至60 ℃時(shí)，使空化氣泡壓力有所上升，多糖得率呈小幅增大，繼續(xù)升至65 ℃后，空化氣泡變得細(xì)密，空化效應(yīng)下降，多糖得率下降。提取溫度50 ℃與45、55 ℃之間的多糖得率差異顯著（P＜0.05），因此后續(xù)試驗(yàn)中提取溫度取值范圍為45～55 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)杜仲葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.3 微波功率對(duì)杜仲葉多糖得率的影響 圖3 顯示，微波功率由100 W 增大至150 W 時(shí)，多糖得率有小幅下降，但微波功率升至200 W 時(shí)，多糖得率大幅上升，達(dá)到最大值3.76%±0.04%。多糖得率的增加是由于微波使植物細(xì)胞內(nèi)受熱膨脹并導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，多糖溶出增加，但是微波功率過高，多糖被降解，導(dǎo)致多糖得率下降[18]。在微波功率200 W 與150、250 W 之間，多糖得率差異顯著（P＜0.05），因此后續(xù)試驗(yàn)中微波功率取值范圍為150～250 W。

圖3 微波功率對(duì)杜仲葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.4 料液比對(duì)杜仲葉多糖得率的影響 圖4 顯示，在料液比為1:10、1:15（g:mL）時(shí)，多糖得率較低；但當(dāng)料液比增大到達(dá)到1:20（g:mL）時(shí)，多糖得率有大幅增加，在料液比1:30（g:mL）時(shí)有最大值3.94%±0.02%。這是因?yàn)槿軇┍壤^低時(shí)，雜質(zhì)的析出量增多，抑制了杜仲葉多糖的析出；繼續(xù)增大溶劑比例，雜質(zhì)基本溶出，此時(shí)多糖溶出不受抑制，得率增大[19]。因此后續(xù)試驗(yàn)中料液比取值范圍為1:25～1:35（g:mL）。

圖4 料液比對(duì)杜仲葉多糖得率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)杜仲葉多糖得率的影響 圖5 顯示，提取時(shí)間從15 min 增加至20 min 時(shí)，杜仲葉多糖的得率上升并達(dá)到最大值3.94%±0.1%，之后繼續(xù)增加提取時(shí)間，杜仲葉多糖得率下降。這是由于多糖的溶出需要一定時(shí)間，但提取時(shí)間過長，超聲會(huì)破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)引起多糖降解，導(dǎo)致多糖得率下降[20]。在提取時(shí)間20 min 與15、30 min 之間，多糖得率差異顯著（P＜0.05），在20 與25 min 之間，多糖得率差異不顯著（P＞0.05），考慮后續(xù)試驗(yàn)中提取時(shí)間取值范圍為15～25 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)杜仲葉多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and results of the Plackett-Burman experiment

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 4 Effect evaluation of the factors of Plackett-Burman experiment

由表4 可知，提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)杜仲葉多糖得率的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中料液比為達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。超聲波功率和微波功率為非顯著影響因素，故選擇提取時(shí)間、提取溫度和料液比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，而超聲波功率、微波功率則分別固定為130 和200 W。

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the Box-Behnken experiment

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到顯著影響杜仲葉多糖得率（Y）因素的多元二次回歸方程：Y=4.02+0.11A+3.750×10-3B-0.36C-0.282AB+0.045A C+0.82BC-0.90A2-0.74B2-0.82C2。表6 為回歸模型的方差分析結(jié)果。結(jié)果顯示，在該模型中一次項(xiàng)A 具有顯著影響（P＜0.05），一次項(xiàng)C 和二次項(xiàng)A2、B2、C2以及交互項(xiàng)AB、BC 具有極顯著影響（P＜0.01）。此外，該回歸模型P＜0.01，說明該模型可靠。R2=0.9944，說明模型擬合程度良好，模型的校正相關(guān)系數(shù)（R2Adj=0.9871）說明自變量之間的相關(guān)性良好。

表6 回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of response surface quadratic model

由模型分析得出，杜仲葉多糖的超聲波-微波輔助提取最優(yōu)工藝條件為提取溫度49.06 ℃、料液比1:28.44（g:mL）、提取時(shí)間20.41 min。此條件下預(yù)測(cè)的杜仲葉多糖得率為4.08%。為了在實(shí)際中具有可操作性，將最優(yōu)工藝參數(shù)確定為提取溫度49 ℃、料液比1:30（g:mL）、提取時(shí)間20 min。為了驗(yàn)證模型的可靠性，在此最佳條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)出多糖得率為4.02%±0.03%，該值與預(yù)測(cè)值十分接近。表明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)可以合理優(yōu)化杜仲葉多糖的超聲波-微波輔助提取工藝條件。

宮本紅[21]采用熱水提取杜仲葉多糖，最優(yōu)提取工藝條件為：料液比1:20，提取溫度100 ℃，浸提時(shí)間120 min，在此條件下粗多糖的提取率有3.7%。劉曉河等[22]研究了酶對(duì)杜仲多糖提取率的影響，發(fā)現(xiàn)酶的添加對(duì)多糖的提取有顯著作用，其中果膠酶效果最為顯著。陳雪花[10]采用的超聲波協(xié)同酶法提取杜仲葉多糖，最佳提取工藝條件為復(fù)合酶添加量3.7%、pH4.0、超聲波功率100 W、提取溫度45 ℃、料液比1:20（g:mL）和提取時(shí)間15 min，多糖得率達(dá)4.79%±0.02%。雖然本研究的多糖得率與超聲波協(xié)同酶法的得率相比較低，但本文所采用的超聲波-微波輔助提取方法因減少了用酶成本和滅酶的能耗成本，經(jīng)濟(jì)上更具優(yōu)勢(shì)。

圖6為兩因素間交互作用響應(yīng)面圖?？梢灾庇^地觀察到杜仲葉多糖得率較高分布區(qū)域范圍以及兩者之間的交互作用。交互作用對(duì)杜仲葉多糖得率的影響大小順序?yàn)椋築C＞AB＞AC。

圖6 兩因素間交互作用響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots of interaction between two factors

2.4 杜仲葉多糖的DEAE-52 纖維素離子交換層析柱純化

以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制杜仲葉多糖經(jīng)離子交換層析純化的洗脫曲線，如圖7 所示。收集5 號(hào)管至11 號(hào)管的洗脫液，透析凍干后多糖得率為26.16%，精制多糖的糖含量為50%（以葡萄糖計(jì)）。不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品在相同濃度下的吸收值相差較大，而葡萄糖是單糖中顯色較強(qiáng)的一種[23]。杜仲葉多糖為雜多糖，此研究中用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，因杜仲葉多糖中的其他單糖顯色不如葡萄糖而使多糖的糖含量測(cè)定結(jié)果偏低。

圖7 杜仲葉多糖的的DEAE-52 洗脫曲線Fig.7 DEAE-52 elution curve of Polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.5 分子量測(cè)定結(jié)果

圖8顯示，杜仲葉精制多糖的主要洗脫峰單一且較對(duì)稱，說明多糖純度較高，其重均分子質(zhì)量Mw為1653 kDa，數(shù)均分子質(zhì)量Mn為1431 kDa，峰值分子質(zhì)量Mp為1647 kDa，分子量分布系數(shù)Mw/Mn為1.16。FENG 等[24]從杜仲莖皮部提取的杜仲多糖平均分子量為1146 kDa，ZHU 等[25]從杜仲莖皮部提取的杜仲多糖平均分子量為1000～2000 kDa。結(jié)果說明杜仲葉與皮中多糖的分子量相近。陳雪花[10]采用超聲波輔助酶法提取的杜仲葉多糖時(shí)，其分子量僅為180 kDa，其值偏小，是與該提取方法中使用纖維素酶有關(guān)。

圖8 杜仲葉精制多糖的分子質(zhì)量色譜圖Fig.8 Chromatogram of molecular weight of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.6 單糖組成測(cè)定結(jié)果

圖9顯示，杜仲葉精制多糖中含有果糖、葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等5 種單糖。各單糖摩爾百分含量為：果糖37.3%、葡萄糖35%、N-乙酰-D 氨基葡萄糖14.6%、半乳糖8.6%、阿拉伯糖4.4%，表明果糖與葡萄糖是杜仲葉多糖的主要成分。陳雪花[10]采用超聲波-酶法得到的杜仲葉多糖主要成分是甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，與本研究結(jié)果產(chǎn)生差異，是因?yàn)樘崛」に嚥煌约氨狙芯克鶞y(cè)定多糖是精制多糖而致。

圖9 杜仲葉精制多糖的單糖組成色譜圖Fig.9 Chromatogram of monosaccharide composition of polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.7 光譜分析結(jié)果

圖10為杜仲葉精制多糖溶液在200～400 nm 紫外波長范圍的吸收曲線?？梢钥闯觯?80 nm 和260 nm 處未有明顯的蛋白和核酸吸收峰，說明為較純的多糖。圖11 為杜仲葉精制多糖的紅外光譜圖，具有多糖的特征吸收峰，在3419 cm-1為O-H 伸縮振動(dòng)，2925 cm-1處為CH3、CH2、CH 等的C-H 伸縮振動(dòng)、1126 cm-1處為C-N 伸縮振動(dòng)[26]，1603 cm-1處為糖醛酸COO-伸縮振動(dòng)，1389 cm-1處為甲基的變形吸收峰[27]，1261 cm-1處為C-O 伸縮振動(dòng)，證明了乙?；拇嬖赱28]。1075 cm-1處為吡喃糖的糖環(huán)伸縮振動(dòng)[29]。此外，在760 cm-1處的吸收峰顯示糖單元的β構(gòu)型[28]，而815 cm-1處的吸收峰表示端基碳為β型[10]。綜上表明，本研究得到的杜仲葉多糖為β型酸性多糖。

圖10 杜仲葉精制多糖紫外光譜圖Fig.10 UV spectrum of refined polysaccharides fromEucommia ulmoides leaves

圖11 杜仲葉精制多糖紅外光譜圖Fig.11 IR spectra of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves

2.8 體外抗凝血活性結(jié)果

2.8.1 杜仲葉精制多糖對(duì)APTT 的影響 肝素是一種硫酸化多糖，在臨床上常被用作抗凝劑和抗血栓劑，但有嚴(yán)重的出血和血小板減少等副作用，且肝素來源于動(dòng)物腸組織，存在機(jī)體感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)[14]。因此，從天然產(chǎn)物中提取抗凝劑具有重要意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種植物多糖具有抗凝血活性，如黑木耳多糖[30]，香椿子多糖[14]，紅棗多糖[31]等。雖然杜仲葉多糖已經(jīng)被證實(shí)具有抗氧化[32]、降血糖[33]、抗結(jié)腸癌[10]等活性，但其抗凝血活性還未見研究報(bào)道。

表7顯示，與陰性對(duì)照相比，在杜仲葉多糖濃度2 mg/mL 時(shí)，APTT 即增大，說明有抗凝效果；且隨多糖濃度增大，APTT 延長（P＜0.01）；當(dāng)多糖濃度達(dá)到8 mg/mL 時(shí)，APTT 超過120 s（P＜0.01）。聞志瑩[14]研究香椿子多糖抗凝血活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多糖濃度為4 mg/mL 時(shí)，對(duì)APTT 的延長到36.6 s，而本研究杜仲葉精制多糖濃度為4 mg/mL 時(shí)，APTT 的延長時(shí)間為73.05 s，表明杜仲葉精制多糖對(duì)APTT 有顯著影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杜仲葉多糖是通過參與內(nèi)源性凝血途徑來起到抗凝血作用。

表7 杜仲葉精制多糖對(duì)APTT 的影響Table 7 Effect of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves on APTT

2.8.2 杜仲葉精制多糖對(duì)PT 的影響 表8 顯示，與陰性對(duì)照相比，當(dāng)多糖濃度在2～8 mg/mL 范圍內(nèi)，杜仲葉多糖對(duì)PT 有一定的延長作用，表明杜仲葉多糖也可以通過參與外源性凝血途徑起到抗凝血作用。當(dāng)杜仲葉多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)，對(duì)PT 的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），延長到42.30 s。

表8 杜仲葉精制多糖對(duì)PT 的影響Table 8 Effect of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves on PT

2.8.3 杜仲葉精制多糖對(duì)TT 的影響 表9 顯示，與陰性對(duì)照相比，當(dāng)杜仲葉多糖為2 mg/mL 時(shí)，延長時(shí)間為14.4 s，當(dāng)杜仲葉多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)，延長時(shí)間超過了120 s，且影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說明杜仲葉多糖對(duì)TT 有顯著影響作用，進(jìn)而說明杜仲葉多糖也可以通過參與共同途徑來影響凝血過程。聞志瑩[14]研究的香椿子多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，延長時(shí)間僅為12.63 s，說明杜仲葉多糖對(duì)TT 作用的影響比香椿子多糖大。本文發(fā)現(xiàn)杜仲葉多糖的單糖組成主要是果糖、葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。宋苗苗[34]報(bào)道，抗凝血榴蓮皮多糖組成有大量的鼠李糖、半乳糖酸存在，而Martinichen-Herrero 等[35]報(bào)道，具有半乳糖-甘露聚糖結(jié)構(gòu)的地衣多糖有抗凝血和抗血栓活性。因此初步推測(cè)杜仲葉多糖的抗凝血活性可能與半乳糖糖基的存在有關(guān)。

表9 杜仲葉精制多糖對(duì)TT 的影響Table 9 Effect of refined polysaccharides from Eucommia ulmoides leaves on TT

3 結(jié)論

本研究采用超聲波-微波輔助法提取杜仲葉多糖，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和BBD 試驗(yàn)，得到最優(yōu)提取工藝條件為：超聲波功率130 W、微波功率200 W、提取溫度49.06 ℃、料液比1:28.44（g:mL）、提取時(shí)間20.41 min，得率4.08%。在此條件下實(shí)際多糖得率為4.02%±0.03%。經(jīng)DEAE-52 離子層析純化后，精制多糖的重均分子質(zhì)量（Mw）為1653 kDa，單糖組成及摩爾比為：果糖37.3%、葡萄糖35%、N-乙酰-D 氨基葡萄糖14.6%、半乳糖8.6%、阿拉伯糖4.4%，并確定其為β型酸性多糖。與陰性對(duì)照相比，杜仲葉多糖能極顯著延長APTT（P＜0.01），對(duì)PT、TT 有一定的延長作用，且當(dāng)多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)，對(duì)PT、TT 有極顯著影響（P＜0.01），說明其可以通過內(nèi)源性、外源性、共同途徑來影響凝血過程，其中是以內(nèi)源性途徑為主。本研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)水浸提法和單一的超聲波、微波法相比，超聲波-微波輔助提取法能高效提取杜仲葉多糖，與酶法相比，超聲波-微波輔助提取法有利于降低生產(chǎn)成本，并且發(fā)現(xiàn)杜仲葉多糖具有較強(qiáng)的體外抗凝血活性。本研究對(duì)我國豐富的杜仲葉資源開發(fā)具有一定的理論和技術(shù)參考價(jià)值。