劉偉麒，鄧媛元，魏振承，張 雁，唐小俊，劉 光，周鵬飛, ，張名位,

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

米糠（Rice bran，RB）是稻米精煉加工生成的副產(chǎn)物，是一種豐富的可再生資源。我國米糠資源總量一直位列世界之首，年產(chǎn)量至少可達1400 萬噸。米糠富含碳水化合物、膳食纖維、維生素、蛋白質(zhì)、γ-谷維素等生物活性成分，占稻米總營養(yǎng)的64%，且均為人體必須營養(yǎng)素[1-2]。

米糠蛋白（Rice bran protein，RBP）在米糠營養(yǎng)物質(zhì)中占10%～15%[3]，其必需氨基酸組成完美契合世界衛(wèi)生組織建議的最佳模式，且具備豐富的賴氨酸[4]。目前，深度開發(fā)RBP 產(chǎn)品是米糠高值化利用研究的熱點之一。然而，RBP 在米糠中存在狀態(tài)非常復(fù)雜，RBP 中的二硫鍵使蛋白質(zhì)發(fā)生高度聚合，導(dǎo)致RBP提取率低[5]。目前提取RBP 的方法主要有堿法制備RBP[6-8]、酶法制備RBP[9]以及物理法制備RBP[10-12]。堿法制備RBP，較高的pH 會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞、產(chǎn)生不良風(fēng)味、色澤發(fā)生較大變化等不良作用[13]；物理法能夠有效減少對米糠蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，但物理方式提取率較低[14]；酶法制備RBP 則是通過蛋白酶裂解米糠細胞壁，使部分蛋白質(zhì)暴露，降低了堿溶時間，減少有毒物質(zhì)的生成和蛋白褐變，但酶制劑因價格昂貴限制運用于實際生產(chǎn)[15]。因此，尋找一種高效便捷、綠色環(huán)保的提取方法制備RBP 對促進其工業(yè)化進程具有重要意義。

天然低共熔溶劑（Natural deep eutectic solvents，NADES）是一種新型溶劑[16]，其組成成分是由生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物如有機酸類、氨基酸類、醇類、膽堿衍生物、糖類等充當氫鍵供體 （HBD）或氫鍵受體（HBA），按照一定比例混合制備且在室溫下呈均勻穩(wěn)定的液體[17]。與傳統(tǒng)試劑相比，NADES 具有廉價易得，無毒無害，可生物降解等優(yōu)勢[18]，在天然物質(zhì)的分離及提取[19-20]、油脂精煉[21-22]等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。研究表明NADES 在植物蛋白質(zhì)、動物蛋白質(zhì)、酶及氨基酸的提取等方面有顯著效果，如Lin 等[23]采用氯化膽堿-尿素NADES 體系提取沙棘籽粕中的蛋白質(zhì)相較于傳統(tǒng)堿提法其氨基酸含量更高，且具有更好的體外消化率；Ester 等[24]通過高壓放電并結(jié)合NADES 提取石榴籽中的蛋白質(zhì)和多酚，發(fā)現(xiàn)NADES可以提高蛋白質(zhì)和多酚的提取效率；Pang 等[25]通過采用由氯化膽堿-聚乙二醇來組成的NADES 并結(jié)合鈉鹽建立水性雙相系統(tǒng)用于提取牛血清白蛋白以及木瓜蛋白酶，發(fā)現(xiàn)兩者蛋白提取率分別為95.16%和90.95%；同時有研究發(fā)現(xiàn)采用不同組分的NADES提取蛋白并不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，再次證實了NADES 水性兩相體系提取蛋白的有效性[26]。基于有關(guān)天然低共熔溶劑在提取植物蛋白質(zhì)中具有較好優(yōu)勢的啟發(fā)，選擇環(huán)境友好、安全的綠色新型溶劑用于米糠蛋白的提取可實現(xiàn)米糠資源的高值化利用，而且NADES 具有一定的酸堿性，能有效破壞米糠組織結(jié)構(gòu)，提升米糠蛋白提取效率，同時提取過程溫和，不生成其他組分[27]。

本文通過設(shè)計不同組分NADES 及采用不同提取工藝對米糠蛋白提取，篩選出提取率優(yōu)勢明顯的NADES 溶劑并建立其提取工藝，最后以料液比、反應(yīng)溫度、含水量以及提取時間開展單因素實驗及響應(yīng)面優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝參數(shù)，進一步獲得高提取率的米糠蛋白，并對NADES 提取米糠蛋白進行表征，為天然低共熔溶劑在開發(fā)米糠資源利用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 廣東海納農(nóng)業(yè)有限公司；氯化膽堿、L-脯氨酸、甜菜堿、無水蘋果酸、DL-乳酸、乙醇酸、乙二醇、甘油、木糖醇、尿素、乙酰胺 均購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MILLI-Q 超純水處理系統(tǒng) Millipore 公司；SQP 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；N-1300V-WB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司；CytationTM5 酶標儀 美國Bio Tek 公司；SH10A水分計 上海菁海儀器儀表有限公司；FiveEasy Plus? FE28 pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；AquaLab 4 TEV 水分活度儀 山東立博迪科學(xué)儀器股份有限公司；AR 1500EX 流變儀 美國TA 儀器；SB-800 DTD 超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Allegra 64R 臺式高速大容量離心機 貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 天然低共熔溶劑的制備 通過稱取一定質(zhì)量的氫鍵受體和氫鍵供體，按特定摩爾比例混合，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以80 ℃的條件旋蒸至形成穩(wěn)定透明液體。10 種溶劑具體組成如下表1 所示。

表1 天然低共熔溶劑的制備Table 1 Preparation of NADES

1.2.2 米糠蛋白的提取 對照組模式體系為精確稱取4 g 米糠，與30 g 蒸餾水混合均勻，用1 mol/L NaOH 調(diào)至pH 至10.0。實驗組模式體系為精確稱取4 g 米糠，加入30 g NADES 于50 ℃水浴恒溫提取2 h，10000 r/min 離心5 min，收集上清液作為待測液，以上提取過程作為模式體系。同時本研究采用超聲和水浴攪拌兩種處理方式考察對米糠蛋白提取的影響，6 種處理方法具體過程如下：方法1-水浴提取2 h；方法2-超聲提取2 h（50 ℃、180 W）；方法3-先水浴提取30 min，再超聲提取30 min，循環(huán)操作2 次；方法4-先超聲提取30 min，再水浴提取30 min，循環(huán)操作2 次；方法5-先水浴提取60 min，再超聲提取60 min；方法6-先超聲提取60 min，再水浴提取60 min。每組實驗平行操作3 次。

1.2.3 提取米糠蛋白單因素實驗與響應(yīng)面優(yōu)化

1.2.3.1 提取米糠蛋白單因素實驗 根據(jù)上述條件設(shè)計綜合考量，選取最適的NADES 對米糠蛋白進行提取。同時對樣品處理的條件為提取溫度50 ℃、提取時間2 h、含水量為4%，以此考察米糠/NADES 料液比（4:30、5:30、6:30、7:30、8:30、9:30 g/g）對RBP 提取率的影響；對樣品處理的條件為提取溫度50 ℃、提取時間2 h、料液比為9:30，以此考察NADES體系含水量（1%、2%、3%、4%、5%）對RBP 提取率的影響；對樣品處理的條件為提取溫度50 ℃、含水量4%、料液比為9:30 g/g，以此考察提取時間（1、2、3、4、5 h）對RBP 提取率的影響；對樣品處理的條件為提取時間2 h、含水量4%、料液比為9:30 g/g，以此考察提取溫度（40、50、60、70、80 h）對RBP 提取率的影響。其中，探究每組實驗平行操作3 次。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取米糠蛋白提取條件由單因素實驗1.2.3.1 的結(jié)果，選取提取時間（A）、提取溫度（B）和PG 含水量（C）為3 個顯著性因素，各因素綜合考慮米糠蛋白提取率最高因素，且實驗室前期發(fā)現(xiàn)，以各單因素最高點并延后兩個梯度點，在該條件下同時可以提取米糠酯酶，酯酶活性較高[28]，故選取提取時間為4%、含水量為4%以及提取溫度為70 ℃通過Box-Behnken Design（BBD）實驗進一步確定最優(yōu)提取工藝，具體設(shè)計如表2，每組實驗平行操作3 次。

表2 BBD 的因素及水平Table 2 Variables and levels of Box-Behnken Design

1.2.4 米糠蛋白質(zhì)提取率的測定 RBP 濃度的測定采用Bradford[29]法。

標準曲線的繪制：采用考馬斯亮藍G-250 染料試劑盒中方法進行梯度稀釋，檢測時分別在96 孔板加入5 μL BSA 和200 μL 考馬斯亮藍G-250 溶液，混勻，2 min 后在595 nm 下測定吸光值。每組三次平行實驗。以蛋白濃度和對應(yīng)的吸光值繪制標準曲線[29]，結(jié)果公式為y=0.0431x+0.039，決定系數(shù)為R2=0.999：蛋白濃度的測定：NADES 富集相中的RBP，按照上述方法測定蛋白質(zhì)的濃度。不同條件下改變樣品稀釋倍數(shù)確保測定結(jié)果的準確性。每一樣品組均設(shè)立相應(yīng)的空白組，同時設(shè)立對照組，減少NADES對吸光度測定的干擾。

蛋白提取率的計算：參照GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法測定米糠中蛋白質(zhì)的含量。NADES 提取RBP 的提取率按照公式（1）算：

1.2.5 天然低共熔溶劑提取米糠蛋白的表征

1.2.5.1 紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR）測定

水處理組精確確稱取4 g 米糠，與30 g 蒸餾水混合均勻，用1 mol/L NaOH 調(diào)至pH 至10.0，經(jīng)反應(yīng)后將樣品以8000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min 后取上清液；PG 處理組采用4 g 米糠與30 g PG 試劑在由響應(yīng)面實驗確定的最佳工藝條件進行反應(yīng)后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min 后取上清液；PG 試劑組為1.2.1 方法制備的PG 溶劑。

將三組樣品進行傅里葉紅外光譜檢測，觀察在提取蛋白質(zhì)過程中蛋白質(zhì)與NADES 之間是否存在相互作用。參考Zhou 等[30]的方法，探究NADES 的傅里葉紅外光譜掃描500～4000 cm-1范圍內(nèi)的吸收圖譜。

1.2.5.2 掃描電鏡（Scanning electronic microscopy，SEM）檢測 對未處理米糠、對照組提取后殘渣及NADES溶劑處理后殘渣進行了表面形貌分析。樣品處理如下：未處理的米糠和對照組提取后殘渣用正己烷脫脂，風(fēng)干水分得待測樣品。NADES 溶劑提取后的殘渣取適量，用超純水清洗殘留溶劑，至清洗液pH 至7.0，再風(fēng)干水分，即得提取后殘渣待測樣。將風(fēng)干后的樣品用導(dǎo)電膠固定在載物臺上，鍍金后采用JSMIT100 InTouchScopeTM 掃描電子顯微鏡研究樣品的結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均進行三次平行實驗，響應(yīng)面實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理采用Design expert 軟件，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。所有數(shù)據(jù)通過SPSS 26 進行單因素方差的Duncan 事后檢驗，圖中小寫字母標識相同溶劑不同方法之間的顯著性差異（P＜0.05），大寫字母標識同種方法不同溶劑之間顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法和天然低共熔溶劑的篩選

本實驗比較了NADES 體系中超聲和水浴攪拌及兩種方式結(jié)合的方法對RBP 提取率的影響，由圖1可知，部分NADES 采用水浴法提取其RBP 提取率均高于其他方法，其中CGa、CU、CG、PG 體系通過水浴攪拌法RBP 提取率分別達到48.62%、35.06%、48.24%以及73.55%，并且PG 體系在除了超聲方法處理組外其余方法組表現(xiàn)較好的提取效果，故選取PG 體系，水浴攪拌法對后續(xù)樣品組進行處理。

圖1 有機酸類（a）、胺類（b）、多元醇類（c）、氨基酸類（d）NADES 提取的RBP 提取率Fig.1 Extraction efficiency of RBP in organic acid (a), amine(b), polyols (c), amino acid (d)-based NADES

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對米糠蛋白提取的影響 由圖2 可知隨著米糠添加量不斷增加，RBP 的提取率在料液比為8:30 g/g 時顯著升高（P＜0.05），繼續(xù)增加米糠量，RBP 提取率整體無明顯變化，當料液比為9:30 g/g時，RBP 提取率最高，提取率為73.55%。隨著料液比增加，能最大程度實現(xiàn)溶劑與米糠物料發(fā)生反應(yīng)，致使RBP 提取率增高，此后隨著物料增加PG-RB體系攪拌愈發(fā)困難，這導(dǎo)致米糠物料與溶劑之間接觸不充分，影響處理過程物料間傳質(zhì)，故最終選擇料液比為9:30 g/g 進行下一步實驗。

圖2 料液比（米糠/NADES）對RBP 提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratios (rice bran/NADES) on the extraction efficiency of RBP

2.2.2 天然低共熔溶劑的含水量對米糠蛋白提取的影響 由于NADES 粘度較高，在操作過程中存在局限性，因此有必要降低PG（526.4 mPa·s）的粘度。添加少量水分能有效降低NADES 的粘度[31]。作者團隊探究了不同含水量對NADES 粘度的影響，結(jié)果如圖3 所示。當在50 ℃時，PG 溶劑粘度為526.4 mPa·s，含水量為5%時，其粘度降低到202.4 mPa·s。研究發(fā)現(xiàn)，NADES 體系少量的水有利于維持其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，體系過多水分則會破壞溶劑本身氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其分子間相互作用減少，從而使NADES 粘度降低[32]。本文希望通過添加少量的水使得NADES 粘度降低，與米糠物料充分發(fā)生反應(yīng)，達到提高RBP 提取率的目的，因此探究了不同含水量（0、1%、2%、3%、4%、5%）對RBP 提取率的影響。結(jié)果如圖4，在極低的含水量（0～3%）的PG 中，蛋白質(zhì)提取率顯著增加（P＜0.05） ，這是因為水分含量的增加降低了PG 的粘度，使得蛋白質(zhì)的擴散速率大大增加[33]。含水量繼續(xù)增加后（4%～5%），蛋白質(zhì)提取速率開始降低，這是由于NADES 粘度降低，氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，PG 與蛋白質(zhì)之間的相互作用減弱。故選擇3%～5%含水量的PG 溶劑進一步優(yōu)化。

圖3 溫度對不同含水量PG 粘度的影響Fig.3 Effect of temperature on the viscosity of PG with different water contents

圖4 含水量對RBP 提取率的影響Fig.4 Effect of water content on the extraction efficiency of RBP

2.2.3 提取時間對米糠蛋白提取的影響 在料液比9:30 g/g，PG 含水量為4%時，考察了處理時間對RBP提取率的影響，結(jié)果如圖5 所示。提取時間在0.5～3 h 之間，RBP 提取率逐漸增加，說明在提取過程中，提取時間過短會導(dǎo)致提取不充分，影響RBP 的提取率，而隨著提取時間延長，NADES 與米糠物料充分反應(yīng)，RBP 提取率顯著增加。當反應(yīng)時間為3 h 時，到達NADES 與該米糠料液比例達到最大反應(yīng)速度，故3 h 后RBP 提取率無明顯變化，選擇3～5 h 提取時間進一步優(yōu)化。

圖5 提取時間對RBP 提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction efficiency of RBP

2.2.4 反應(yīng)溫度對米糠蛋白提取的影響 在料液比9:30 g/g，PG 含水量為4%以及處理時間為3 h 時，研究了40～80 ℃溫度范圍下對RBP 提取率的影響。結(jié)果如圖6 所示，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，RBP 提取率增高，這可能是溫度增加了物料之間的傳質(zhì)有利于米糠蛋白的釋放。溫度到達60 ℃后，RBP 提取率呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能是由于溫度過高，提取的米糠蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白提取率降低。反應(yīng)溫度為60 ℃時，RBP 的提取率最高，故選擇60～80 ℃進一步優(yōu)化。

圖6 不同反應(yīng)溫度對RBP 提取率的影響Fig.6 Effect of different reaction temperatures on the extraction efficiency of RBP

綜合考慮，并參照四個因素顯著性分析結(jié)果，確定料液比為9:30 g/g，選用含水量、溫度以及時間3 個因素進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

本團隊研究發(fā)現(xiàn)采用NADES 可以有效地提取米糠酯酶[28]，且效果較優(yōu)，其單因素最優(yōu)條件為料液比9:30，提取時間4 h，含水量4%，反應(yīng)溫度為70 ℃，該條件均與天然低共熔溶劑提取米糠蛋白單因素實驗最優(yōu)條件無顯著性差異，故將上述反應(yīng)條件作為中心平行的實驗方案。確定提取時間（A）、含水量（B）、提取溫度（C）3 個水平，設(shè)定3 因素3 水平、5 次中心平行的實驗方案，實驗設(shè)計及米糠蛋白的提取率見表3。通過Design-Expert 10 軟件對響應(yīng)值進行二次響應(yīng)面回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與響應(yīng)值Table 3 Response design and results of experiment

經(jīng)擬合回歸后，得到米糠蛋白提取率相對各因素實際值的二次響應(yīng)面回歸方程為：Y=78.39-2.22A+2.69B-3.48C-0.69AB-1.16AC-0.49BC-0.031A2-1.29B2-3.03C2?；貧w方程分析表可知，米糠蛋白提取率的回歸模型P＜0.0001，表明回歸方程具有很高的可靠性，結(jié)果有效。R2和校正系數(shù)R2調(diào)整后分別為0.9994 和0.9987。失擬項P=0.063773＞0.05 說明相對于純誤差不顯著，該模型擬合程度高，實際值與預(yù)測值之間高度一致，實驗結(jié)果誤差對實驗結(jié)果影響較小。根據(jù)回歸方程分析結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)，提取時間和提取溫度及其P值均為＜0.0001，F(xiàn)值分別為617.2028和7437.858，而含水量P值則為0.0126，F(xiàn)值為11.09156，說明對米糠蛋白提取率影響最大的因素是提取溫度，其次是提取時間，最后是含水量。

表4 響應(yīng)值的回歸方程分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for hydrolysis activity

2.3.1 響應(yīng)面分析 根據(jù)二次響應(yīng)面回歸方程構(gòu)建三維響應(yīng)面圖和等高線圖，描繪不同因素對RBP 提取率的影響及交互作用大小如（圖7）所示，提取時間和PG 含水量之間的交互作用對米糠蛋白提取率影響最大，提取溫度和PG 含水量之間的交互作用次之。

圖7 提取溫度、含水量及提取時間對RBP 提取率的交互影響Fig.7 Response surface of interaction of various factors for extraction yield of RBP

2.3.2 驗證實驗 由軟件Design-Expert 10.0.1 結(jié)果顯示最優(yōu)條件為提取時間3.0847 h，反應(yīng)溫度為65.0807 ℃，含水量為4.77451%，該條件下RBP 提取率為82.8438%。結(jié)合實際操作方便，后續(xù)驗證實驗確定最佳提取工藝為：提取時間為3 h，反應(yīng)溫度為65 ℃，含水量為4.7%，在最佳實驗條件下開展三次平行實驗，得到PG 體系米糠蛋白提取率為82.69%±1.02%，實驗結(jié)果與上述預(yù)測值接近，說明該模型準確性良好。

2.4 天然低共熔溶劑提取米糠蛋白表征

采用FT-IR 和SEM 考察了萃取前后米糠及其殘渣結(jié)構(gòu)的變化，以初步探究NADES 提取RBP 的行為。

2.4.1 FT-IR 測定 兩種處理組及PG 的FT-IR 分析光譜見圖8。PG 與PG 處理組相對于水處理組在3000～3700 cm-1處明顯發(fā)現(xiàn)其振吸收范圍變寬，這表明了PG 與PG 處理組形成了氫鍵作用，且作用力更強。將PG 和PG 處理組進行光譜分析，發(fā)現(xiàn)提取前后光譜圖像相似，沒有出現(xiàn)新的峰，這表明提取過程中沒有產(chǎn)生新成分。

圖8 對照組和PG 提取后蛋白質(zhì)富集相的FT-IR 光譜Fig.8 FT-IR spectra of the protein-enriched phases after extraction of control group and PG

2.4.2 SEM 分析 通過采用SEM 分析了米糠經(jīng)過不同方法處理后的表面形貌，結(jié)果如圖9。結(jié)果顯示，水提取后的米糠表面平滑，微觀結(jié)構(gòu)完好，米糠表面形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化；PG 處理組的米糠微觀結(jié)構(gòu)明顯被破壞，米糠內(nèi)溶物（如RBP）釋放，說明PG溶劑對RBP 的提取有顯著作用，這與圖1 得出的結(jié)論一致。

圖9 米糠和米糠殘渣的SEM（50 μm）Fig.9 SEM of rice bran and rice bran residue (50 μm)

由FT-IR 和SEM 數(shù)據(jù)可知，使用PG 溶劑處理米糠，米糠細胞遭到破壞，米糠中RBP 被大量釋放，RBP 提取效率增加，同時在反應(yīng)過程中，PG 溶劑并不會與RBP 發(fā)生反應(yīng)，僅作為溶劑參與RBP 提取反應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究建立了一種NADES 輔助水浴攪拌法提取米糠蛋白的工藝。通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實驗，得到最優(yōu)工藝條件為：反應(yīng)體系為脯氨酸-甘油（摩爾比2:5），米糠與溶劑料液比為9:30 g/g，含水量為4.7%，水浴攪拌3.0 h，反應(yīng)溫度為65 ℃，米糠蛋白提取率為82.69%±1.02%。相較于傳統(tǒng)水提法，采用NADES提取能有效破壞米糠細胞，釋放蛋白，且在反應(yīng)過程中不會產(chǎn)生新組分。結(jié)果表明，NADES 提取法具有簡單、綠色環(huán)保且能高效提取米糠蛋白的優(yōu)勢。本研究結(jié)果對米糠深度加工及新型綠色溶劑在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。