趙電波 ，馬燕青，王少丹，王雯雯

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001）

植物精油（essential oil，EOs）是從植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等部分提取的含有揮發(fā)性芳香物質(zhì)的濃縮親脂液體[1]。常見(jiàn)的植物精油包括肉桂精油、迷迭香精油、牛至精油、丁香精油和孜然精油等[2-3]。近年來(lái)，EOs 在食品抗菌保鮮中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注[4]，但其存在揮發(fā)性強(qiáng)、水溶性差等缺點(diǎn)，制約了其在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用[5]。研究證實(shí)，納米乳化技術(shù)能夠有效提高EOs 的水溶性及穩(wěn)定性[6]。目前，關(guān)于EOs 納米乳的研究多集中于制備優(yōu)化和抑菌活性評(píng)價(jià)等方面[7-8]，但其代謝組水平上的抗菌機(jī)制研究尚不充分。

代謝組學(xué)是對(duì)某一生物、組織或細(xì)胞中的所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性與定量分析的一門(mén)科學(xué)。代謝組學(xué)以指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，高通量檢測(cè)為手段，通過(guò)研究生物體內(nèi)代謝物的種類(lèi)與數(shù)量及其變化規(guī)律來(lái)闡述機(jī)體在正常生命狀態(tài)及環(huán)境變化后的代謝過(guò)程，從而揭示生物體內(nèi)的生命現(xiàn)象及其內(nèi)在規(guī)律[9]。近年來(lái)，代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用于不同抗菌劑作用機(jī)制等方面的研究[10-12]。例如，Li 等[11]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)終濃度為150 mg/L 的丁香酚納米乳處理48 h 后，意大利青霉菌（Penicillium italicum）有34 種代謝物下調(diào)；研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚納米乳干擾了P. italicum的三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)合成等途徑。經(jīng)終濃度為1.5 μL/mL 的芳樟醇處理2 h 后，腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）出現(xiàn)170 種差異代謝物，其中上調(diào)81 種，下調(diào)89 種；代謝通路分析表明，芳樟醇干擾了S. putrefaciens的三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑、氨基酸代謝、泛酸和輔酶A 合成等代謝途徑[12]。

肉桂精油提取自肉桂皮、肉桂葉等，來(lái)源廣泛、安全環(huán)保、具有良好的抗菌和抗氧化特性[13]。前期研究表明，肉桂精油納米乳（cinnamon essential oil nanoemulsion，CON）對(duì)肉源假單胞菌腐 CM2（Pseudomonas deceptionensisCM2）具有較強(qiáng)的抑菌效果，但相關(guān)作用機(jī)制尚不明確[14]。因此，本研究采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱聯(lián)用技術(shù)（ ultrahigh-performance liquid chromatograph Q extractive mass spectrometry， UHPLC-QE-MS） 對(duì)CON 處理組P. deceptionensisCM2 胞內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析確定差異代謝產(chǎn)物種類(lèi)，通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物質(zhì)進(jìn)行通路富集分析，系統(tǒng)揭示CON 抑制P. deceptionensisCM2 的作用機(jī)制，以期為CON 在食品安全控制領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

P. deceptionensisCM2 菌株 由本實(shí)驗(yàn)室分離自腐敗雞肉；殼聚糖、果膠、肉桂精油 上海源葉生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB） 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Tween 80、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和冰乙酸北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸、乙腈 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；L-2-氯苯丙氨酸上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

5424R 型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；LD2M-60KCS 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；VC750 型超聲波破碎儀 美國(guó)Sonic 公司；UltraturraxT25 型高速分散器 德國(guó)IKA 公司；THZ-103B 型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Tecan Spark 20 M 型多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan 公司；QE plus 型高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；ACQUITY UPLC I-Class plus 型色譜柱 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備 用無(wú)菌接種環(huán)挑取活力旺盛的P. deceptionensisCM2 單菌落接種于NB 培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min 搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。取25 mL 培養(yǎng)物于50 mL 離心管，離心（4 ℃，8000×g，10 min）收集菌體。用無(wú)菌NaCl 溶液（0.85%，w/v）洗滌菌體2 次，離心同上。將所得菌體重懸于濃度為0.01 mol/L 的無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）并混勻，調(diào)整菌懸液的OD600值于1.2～1.3 之間，制成活菌數(shù)約為8 lg CFU/mL 的菌懸液備用。

1.2.2 CON 制備 參考He 等[15]的方法制備CON。稱(chēng)取0.6 g 殼聚糖粉末溶于100 mL 乙酸溶液（0.5%，v/v），室溫下磁力攪拌（450 r/min，2 h）得到殼聚糖溶液（0.6%，w/v）。稱(chēng)取1.0 g 的果膠粉末溶于100 mL蒸餾水，室溫下磁力攪拌2 h 得到果膠溶液（1%，w/v）。將殼聚糖和果膠溶液1:1（v/v）混合，作為乳液基質(zhì)，然后將肉桂精油加入基質(zhì)溶液中，再加入吐溫80 作為乳化劑，吐溫80 與精油的比例為1:4（v/v），磁力攪拌20 min 至分散均勻。然后用高速均質(zhì)機(jī)在10000 r/min 條件下均質(zhì)2 min，形成粗乳液。通過(guò)功率為450 W 的超聲波設(shè)備處理7.5 min，進(jìn)一步均質(zhì)乳化即得CON，于4 ℃冷藏備用。

1.2.3 MIC 和MBC 測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定CON的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）[16]。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的前三排每孔各加入100 μL NB 培養(yǎng)基，然后在每排第一孔中加入100 μL CON（稀釋至肉桂精油濃度為8 μL/mL），用移液器吹打混勻后吸取100 μL 混合溶液置于第二孔中，照此添加至第六孔，吸取第六孔中100 μL 混合溶液棄去，然后在每孔中加入100 μL 濃度約為8 lg CFU/mL 的菌懸液，此時(shí)每孔CON 中的肉桂精油濃度從左至右依次為2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 和0.063 μL/mL。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)多功能微孔板讀數(shù)儀觀察供試菌的生長(zhǎng)情況，以完全沒(méi)有微生物生長(zhǎng)的最低的肉桂精油濃度作為MIC。在測(cè)得MIC 的基礎(chǔ)上，吸取100 μL 上述無(wú)微生物生長(zhǎng)孔中的液體培養(yǎng)基涂布于平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，以平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低的肉桂精油濃度作為MBC。

1.2.4 CON 處理P. deceptionensisCM2 菌懸液經(jīng)終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，于4 ℃、10000×g 離心5 min，對(duì)照組用無(wú)菌水處理，收集細(xì)菌沉淀。菌體經(jīng)PBS（4 ℃預(yù)冷）洗滌3 次后，采用液氮進(jìn)行凍存處理。

1.2.5 胞內(nèi)代謝物的提取和制備 參考周繼福等[17]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。用1 mL 甲醇溶液（-20 ℃預(yù)冷，80%，v/v）將樣本轉(zhuǎn)移到玻璃樣品瓶中，加入200 μL 氯仿并混勻，采用冰浴超聲破碎3 min（功率為500 W）并全部轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管，加入20 μL濃度為0.06 mg/mL 的L-2-氯苯丙氨酸溶液作為內(nèi)標(biāo)；經(jīng)冰浴超聲提取20 min 并于-40 ℃靜置30 min后，于4 ℃、13000 r/min 離心10 min；吸取800 μL上清液裝入LC-MS 進(jìn)樣瓶中揮干，加入300 μL 甲醇溶液（20%，v/v）復(fù)溶并于-20 ℃下靜置2 h，離心同上，吸取150 μL 上清液，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾后，保存至-80 ℃冰箱備用。將對(duì)照組和1×MIC 處理組樣品提取液進(jìn)行等體積混合作為質(zhì)控樣本（quality control，QC）。

1.2.6 液相色譜-質(zhì)譜分析 采用ACQUITY UPLC I-Class plus 超高效液相串聯(lián)QE plus 高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；流動(dòng)相A 為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為乙腈（含0.1%甲酸）；流速為0.35 mL/min；進(jìn)樣體積為2 μL。梯度洗脫程序?yàn)閇18]：0～2.0 min，95% A；2.0～4.0 min，95%～70% A； 4.0～8.0 min， 70%～50% A； 8.0～10.0 min，50%～20% A；10.0～14.0 min，20%～0% A；14.0～15.0 min，100% B；15.0～16.0 min，95% A。

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）的QE Plus 質(zhì)譜儀分別在正負(fù)離子電離模式下采集數(shù)據(jù)[19]。正離子和負(fù)離子模式下的噴霧電壓分別為3800 和-3000 V；毛細(xì)管溫度為320 ℃，輔助氣加熱器溫度為350 ℃；正負(fù)離子的鞘氣流速分別為40 和35 arb，輔助氣流速分別為10和8 arb；S-lens RF 電壓為50 V；質(zhì)譜掃描范圍為100～1200 m/z，一級(jí)掃描分辨率為70000 FWHM，二級(jí)掃描分辨率為17500 FWHM；歸一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）和分步碰撞能量（stepped NCE）為10、20 和40 eV。

1.2.6.3 質(zhì)控樣品監(jiān)測(cè) 為了評(píng)價(jià)在上機(jī)過(guò)程中分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在待測(cè)樣本進(jìn)樣前、中、后上機(jī)檢測(cè)QC 樣品?？赏ㄟ^(guò)QC 樣本的重復(fù)性以考察整個(gè)分析過(guò)程中儀器穩(wěn)定性，保證結(jié)果的可靠性[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組樣品做4 次生物學(xué)平行試驗(yàn)；使用 SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行變量統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.1 UPLC-MS 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理 將原始UPLCMS/MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI v2.3 軟件（Nonlinear Dynamics, Newcastle，UK）進(jìn)行基線過(guò)濾、積分、保留時(shí)間校正、峰識(shí)別、峰對(duì)齊和歸一化等工作。采用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）及OPLS-DA 置換檢驗(yàn)區(qū)分處理組和對(duì)照組代謝輪廓的總體差異。

1.3.2 差異代謝物鑒定 使用歐易生物云平臺(tái)（https://cloud.oebiotech.com/task/）配合使用人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（The Human Metabolome Database,HMDB）、脂質(zhì)圖譜（Lipidmaps）（v2.3）和EMDB2.0等數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Progenesis QI v2.3 數(shù)據(jù)處理后的峰來(lái)進(jìn)行差異代謝物的鑒定。基于其分析結(jié)果可得到變量權(quán)重值（variable importance in projection，VIP）＞1 的代謝物。最后，通過(guò)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）分析得到不同處理間代謝物的變化倍數(shù)。CON 處理組與對(duì)照組之間的差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)為VIP＞1、t檢驗(yàn)的P＜0.05 且|log2FC|＞0。

1.3.3 代謝通路分析 通過(guò)MetaboAnalyst 4.0 在線數(shù)據(jù)處理軟件（http://www.metaboanalyst.ca）結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/kegg/）等進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CON 抗菌活性分析

采用二倍稀釋法測(cè)得CON 抑制P. deceptionensisCM2 的MIC 為0.125 μL/mL，MBC 為0.250 μL/mL。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選用經(jīng)終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后的P. deceptionensisCM2 進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2.1 PCA 結(jié)果 PCA 是一種非監(jiān)督分析，能夠反應(yīng)數(shù)據(jù)的原始情況，有利于了解數(shù)據(jù)的整體情況并從整體上進(jìn)行把握。對(duì)代謝物進(jìn)行主成分分析，可從總體反映樣本組間和組內(nèi)的變異度，觀察樣本間的總體分布趨勢(shì)，判斷可能存在的離散點(diǎn)[21]。采用PCA 評(píng)價(jià)對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensisCM2 細(xì)胞樣本的變異度，觀察不同處理組樣本之間的整體趨勢(shì)分布，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖1 可知，所有樣本均處于95%置信區(qū)間（圖1 中橢圓形區(qū)域）內(nèi)，各組樣本之間有明顯的分離趨勢(shì)，組內(nèi)樣本較為緊密；PC1 得分為56.4%，PC2 得分為15.6%。模型解釋率（R2X）是判別PCA 模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)，該值代表降維后的數(shù)據(jù)對(duì)原始數(shù)據(jù)的解釋率，該值越接近1 越理想，一般認(rèn)為R2X 大于0.5 說(shuō)明模型效果較好[22]。經(jīng)計(jì)算，對(duì)照組和CON 處理組的R2X 為0.797，表明上述模型擬合效果良好。以上結(jié)果表明，對(duì)照組和肉桂精油納米乳處理組樣本在PCA 得分圖上區(qū)分明顯，組內(nèi)樣本彼此靠近，且PCA 模型穩(wěn)定可靠。

2.2.2 PLS-DA 結(jié)果 PLS-DA 是一種有監(jiān)督的判別統(tǒng)計(jì)方法，該方法運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣本分組之間的關(guān)系模型，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類(lèi)別的預(yù)測(cè)[23]。PLS-DA 加入分組變量，可彌補(bǔ)PCA 方法的不足。采用PLS-DA 模型進(jìn)行對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensisCM2 細(xì)胞樣本進(jìn)行有監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的PLS-DA 得分圖Fig.2 PLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖2 可知，對(duì)照組和CON 處理組的樣本點(diǎn)距離較遠(yuǎn)并有明顯的聚集趨勢(shì)，表明兩組樣品在代謝輪廓上存在明顯差異且樣本全部處于95%置信區(qū)間。PLS-DA 的擬合參數(shù)包括R2X、解釋率R2Y 和預(yù)測(cè)率Q2。計(jì)算結(jié)果表明，PLS-DA 正負(fù)離子模式的R2X 為0.851，R2Y 為1，Q2為0.995。上述3 個(gè)模型參數(shù)指標(biāo)均接近1，表明此模型擬合效果良好，具有很強(qiáng)的解釋和預(yù)測(cè)能力，能有效區(qū)分對(duì)照組和CON 處理組樣品。

2.2.3 OPLS-DA 結(jié)果 相對(duì)于PLS-DA，OPLS-DA模型的解析能力和有效性更高[24]。進(jìn)一步采用OPLS-DA 模型對(duì)各組P. deceptionensisCM2 細(xì)胞樣本差異代謝物進(jìn)行有監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)分析，OPLSDA 得分結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的OPLS-DA 得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖3 可知，對(duì)照組和CON 處理組的樣本點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，并有明顯的聚集趨勢(shì)，說(shuō)明兩組樣品在代謝輪廓上存在差異。一般認(rèn)為，當(dāng)R2和Q2越接近1 時(shí)，模型越穩(wěn)定可靠[25]。經(jīng)計(jì)算，OPLS-DA 中R2X 為0.851，表明上述模型擬合效果良好；R2Y 為1，表明此模型的解釋率高；Q2為0.993，表明此模型的預(yù)測(cè)能力很高。為驗(yàn)證建立的OPLS-DA 模型的預(yù)測(cè)能力和解釋能力，選擇置換檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)OPLS-DA 模型的數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)200 次響應(yīng)排序檢驗(yàn)，以置換檢驗(yàn)的置換保留度為橫坐標(biāo)，R2或Q2值為縱坐標(biāo)，得到的置換檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 代謝物的OPLS-DA 模型置換檢驗(yàn)Fig.4 Permutation test of metabolites from the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells using OPLS-DA model

由圖4 可知，OPLS-DA 模型的R2為0.923，Q2為-0.014，表明OPLS-DA 模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況，沒(méi)有出現(xiàn)“過(guò)擬合”現(xiàn)象。以上結(jié)果說(shuō)明OPLS-DA 模型具備很強(qiáng)的解釋和預(yù)測(cè)能力，可以用來(lái)區(qū)分對(duì)照組和CON 處理組樣品，結(jié)果可用于后續(xù)的差異代謝物分析。

2.3 差異代謝物分析

OPLS-DA 模型中的VIP 反映了每種代謝物在不同組之間相互關(guān)聯(lián)的顯著性，以區(qū)分對(duì)照組和處理組，代謝物VIP 值越高表明對(duì)區(qū)分的貢獻(xiàn)越大[26]。本研究以O(shè)PLS-DA 模型第一主成分的VIP＞1、FC＞1.0 且P＜0.05 為條件對(duì)差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選，并繪制火山圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，在P. deceptionensisCM2 細(xì)胞共檢測(cè)到380 種差異性代謝物，主要包括雜環(huán)化合物、芳香族化合物、脂類(lèi)和類(lèi)脂質(zhì)分子、有機(jī)酸及其衍生物、核苷酸、苯丙類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物等；含量顯著升高的差異性代謝物有309 種，主要包括2-苯乙醇、尿嘧啶、L-天冬酰胺、D-脯氨酸和四磷酸二鳥(niǎo)苷等；含量顯著降低的差異代謝物有71 種，主要包括L-纈氨酸、檸檬酸、N-乙酰鳥(niǎo)氨酸、煙酰胺和氧化型谷胱甘肽等。Chen 等[27]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)終濃度為0.4 mg/mL 的肉桂精油處理6 h 后，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有74 種代謝物存在顯著差異，主要包括碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂類(lèi)等，其中上調(diào)29 種，下調(diào)45 種。

圖5 對(duì)照組和CON 處理組P. deceptionensis CM2 的差異代謝產(chǎn)物火山圖Fig.5 Volcano plot for the differential metabolites between the control and CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

2.4 代謝通路富集分析結(jié)果

為確定P. deceptionensisCM2 經(jīng)CON 處理后發(fā)生變化的相關(guān)代謝通路，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合Metaboanalyst 軟件對(duì)定性的差異化合物進(jìn)行代謝通路富集分析[28]。結(jié)果表明，對(duì)照組和CON 處理組P.deceptionensisCM2 差異表達(dá)代謝物中顯著富集的代謝通路共有49 條，其中前20 條代謝通路見(jiàn)圖6。

圖6 TOP-20 代謝通路富集圖Fig.6 TOP-20 enrichment of metabolic pathways

由圖6 可知，共有13 條代謝通路條柱高于藍(lán)線，表明與對(duì)照組相比，經(jīng)濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，P. deceptionensisCM2 細(xì)胞有13 條代謝通路具有顯著性差異。與對(duì)照組相比，CON 處理組細(xì)胞發(fā)生變化的代謝通路主要涉及氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸等）代謝、嘌呤代謝、氨基糖代謝、嘧啶代謝等。Li 等[29]也得到了類(lèi)似的結(jié)果，經(jīng)1.5 mL/L 的芳樟醇處理2 h 后，莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）發(fā)生顯著性變化的代通路主要涉及丙酮酸代謝、戊糖與葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A 生物合成等。

如表1 所示，經(jīng)終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，P. deceptionensisCM2 細(xì)胞有13 條代謝通路發(fā)生顯著變化。在表1 中，代謝通路的P值反映了其富集的顯著性。篩選顯著性富集通路；以富集因子（rich factor）為橫坐標(biāo)，差異代謝通路名稱(chēng)為縱坐標(biāo)，繪制氣泡圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。

表1 代謝通路富集結(jié)果Table 1 Enrichment of metabolic pathways

圖7 代謝通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram for metabolic pathwayenrichment analysis

在圖7 中，富集因子反映了代謝通路的富集程度；每個(gè)氣泡代表一個(gè)代謝途徑；氣泡越大，表示富集到該通路上的代謝物數(shù)目越多。由圖7 可知，以富集因子＞0.1 和P＜0.05 為差異代謝通路篩選條件，篩選出4 條差異代謝通路，分別為：a.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝；b.泛酸和輔酶A 生物合成；c.磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；d.氧化磷酸化代謝。上述4 條代謝途徑均與氨基酸代謝和ATP 合成有關(guān)。氨基酸代謝在維持細(xì)胞生命活動(dòng)方面具有重要作用[30]。泛酸是CoA生物合成的關(guān)鍵前體，CoA 是一種重要的輔助因子，參與生物體內(nèi)碳水化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)和能量的代謝，包括TCA 循環(huán)和氧化磷酸化[31]。以上結(jié)果表明CON 處理可能通過(guò)抑制胞內(nèi)氨基酸和能量代謝而導(dǎo)致P. deceptionensisCM2 死亡。

2.5 差異代謝物的代謝通路分析結(jié)果

通過(guò)KEGG pathway mapper 功能對(duì)差異代謝通路進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 CON 處理后P. deceptionensis CM2 細(xì)胞代謝通路變化Fig.8 Changes in the metabolic pathways of CON-treated P. deceptionensis CM2 cells

由圖8 可知，細(xì)胞的碳水化合物代謝途徑包括糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA 循環(huán)），在細(xì)胞能量代謝等生理活動(dòng)中具有重要作用[32]。TCA 循環(huán)是細(xì)胞能量生產(chǎn)的代謝樞紐。由圖8 可知，泛酸、檸檬酸、L-天冬氨酸、L-天門(mén)冬酰胺和L-纈氨酸等關(guān)鍵代謝物顯著下調(diào)，表明CON 處理抑制了P. deceptionensisCM2 的氨基酸和ATP合成，進(jìn)而導(dǎo)致能量生產(chǎn)無(wú)法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3 討論與結(jié)論

與對(duì)照組相比，經(jīng)終濃度為1×MIC 的CON 處理4 h 后，P. deceptionensisCM2 細(xì)胞共出現(xiàn)380 種差異性代謝物，主要包括雜環(huán)化合物、芳香族化合物、脂類(lèi)和類(lèi)脂質(zhì)分子、有機(jī)酸及其衍生物、核苷酸、苯丙類(lèi)和聚酮類(lèi)等；共富集到13 條差異顯著的代謝通路，涉及氨基酸、嘌呤、氨基糖和嘧啶等物質(zhì)代謝，表明CON 失活P. deceptionensisCM2 可能與其抑制內(nèi)氨基酸的合成和能量代謝等生理活動(dòng)有關(guān)。在今后的研究中，應(yīng)綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法進(jìn)一步闡明CON 失活P. deceptionensisCM2 的作用機(jī)制。此外，還應(yīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)CON 處理對(duì)食品表面微生物的殺滅效果及對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)、感官品質(zhì)及貨架期等指標(biāo)的影響，探究脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等食品組分對(duì)CON 殺菌效果的影響及作用機(jī)制。