張孟雨，李 堯，彭嘉屹，陳禹豪，曾鳳婷，鐘青萍

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種公認安全（generally recognized as safe，GRAS）微生物[1]，在自然界分布廣泛。大多數(shù)乳酸菌能夠耐受胃腸液環(huán)境，具有抗菌作用，還能產(chǎn)生胞外多糖（exopolysaccharide， EPS） 、γ-氨基丁酸（ 4-aminobutanoic acid，GABA）等活性物質，是重要的益生菌[2]。乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖具有安全性高、生物活性好等性質[3]，分為同多糖（homopolysaccharides，HoPS）和雜多糖（heteropolysaccharides，HePS）兩種[4]，主要是由葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖等糖單元按不同比例組成，本質上是一種高分子量水溶性的長鏈天然聚合物[5]。乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖因其持水、抗菌和其他益生性能等在食品工業(yè)、制藥、化妝品及環(huán)境工業(yè)中應用廣泛[6]，不僅可以作為食品生產(chǎn)加工中的增粘劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等，還可以用作生物絮凝劑、生物吸收劑、離子交換樹脂和重金屬去除劑等，具有廣泛的應用前景[7]。

航空誘變技術是指將菌株通過衛(wèi)星、飛船等返回式航天器帶入宇宙空間中，使其在各種太空誘變因子的作用下遺傳性狀發(fā)生改變的技術，從而提高微生物突變率以期獲得性狀優(yōu)良的菌株[8-9]。近年來，航天誘變技術在微生物育種方面發(fā)展迅速，Wang 等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)航天誘變的白假絲酵母生長速率、生物被膜形成能力和抗氧化能力均有所提高；Bai 等[11]對經(jīng)航天誘變的沃式葡萄桿菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其生物被膜形成能力增強。航空航天技術獲得的突變微生物具有較好的研究價值和應用前景[12]，但目前航天誘變乳酸菌的研究較少，如王瑩等[13]從航天誘變的嗜熱鏈球菌中篩選出兩株產(chǎn)酸速率快，黏度和胞外多糖含量均有所提高的菌株；隋馨瑤[14]將副干酪乳桿菌進行航天誘變，經(jīng)篩選得到一株高產(chǎn)酸的副干酪乳桿菌A-4-2，說明航天誘變對乳酸菌的性能可能產(chǎn)生積極作用。微生物空間育種正在成為微生物科學的一個新興和有前途的領域，并有利于推動發(fā)酵技術的發(fā)展[15]。

本研究將乳酸片球菌L21 進行航天誘變處理，對誘變菌株進行EPS 產(chǎn)量及遺傳穩(wěn)定性分析，比較原始菌株及突變菌株對酸、膽鹽及人工模擬胃、腸液的耐受性，篩選出一株性能穩(wěn)定并高產(chǎn)EPS 的乳酸片球菌株，探明其EPS 的抗生物被膜、抗氧化、抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的能力，以期獲得具有優(yōu)良益生特性的突變菌株，為航天育種乳酸菌及其所產(chǎn)胞外多糖的綜合利用提供理論依據(jù)，以及為航天誘變微生物的研究和應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸片球菌L21 菌株 由本實驗室分離鑒定和保藏；金黃色葡萄球菌ATCC 25923、單增生李斯特菌ATCC 19155、大腸埃希氏菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 9027 均為實驗室保藏菌株；胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 廣東環(huán)凱生物技術有限公司；葡萄糖、吐溫、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三胺、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、甘油 廣州化學試劑廠；Tris 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 試劑、ABTS試劑 美國Sigma 公司；胰蛋白酶（1:250）、胃蛋白酶（1:3000）、牛膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶（1 U/mL）、α-葡萄糖苷酶（1 U/mL） 上海吉至生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

Scientz-12N 冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；AvantiJ-E 落地式高速大容量離心機美國貝克曼庫爾特有有限公司；SpectraMax i3x 連續(xù)波長多功能微孔板檢測平臺 美國Molecular Devices 公司；5417R 超高速離心機 德國Eppendorf 公司；VersaMax 光柵型酶標儀 美國Melecular Devices 公司；Evolution 300 紫外可見分光光度計 美國ThermoFIsher Scientific 公司；LC-20AD 高效液相色譜儀 日本島津公司；TP600PCR 儀 日本TaKaRa公司；R1001-VN 旋轉蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿有限公司；Agilent1260 凝膠滲透色譜 美國Agilent 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及試劑配制 MRS 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，磷酸氫二鉀（K2HPO4·7H2O）2.0 g/L，乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）5.0 g/L，檸檬酸三胺 2.0 g/L，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.2 g/L，硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.05 g/L。pH 為6.0，121 ℃滅菌20 min。配固體培養(yǎng)基需加入15～20 g 瓊脂。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L。pH 為7.0，121 ℃滅菌20 min。

人工模擬胃液：125 mmol/L NaCl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3、3 g/L 胃蛋白酶，pH 調至3.0，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。

人工模擬腸液：1 g/L 胰蛋白酶、3 g/L 牛膽鹽，pH 調至7.5，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。

0.1 mol/L PBS 溶液（pH6.86）：A 液（0.2 mol/L Na2HPO4）：稱取71.6 g Na2HPO4·12H2O 溶于1 L 水中；B 液（0.2 mol/L NaH2PO4）：稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O 溶于1 L 水中。取49 mL A 液和51 mL B 液混合配成pH7.4 的緩沖液，然后取500 mL 加超純水稀釋至1000 mL。

ABTS+工作液：7.4 mmol/L ABTS 與2.6 mmo/L K2S2O8等體積混合，避光靜置12 h，用pH7.4 的PBS 溶液稀釋至其OD734nm為0.7±0.2 后使用。

α-淀粉酶溶液（1 U/mL）：α-淀粉酶溶液與PBS 緩沖鹽溶液混合，配制成1 U/mL 的α-淀粉酶溶液，-20 ℃條件下避光儲存，40 ℃水浴鍋中預熱30 min 后使用。

α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）：α-葡萄糖苷酶溶液與PBS 緩沖鹽溶液混合，配制成1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，-20 ℃條件下避光儲存，40 ℃水浴鍋中預熱30 min 后使用。

1%淀粉溶液：將1 g 淀粉置于100 g 沸水中充分溶解并常溫儲存。

1.2.2 菌株誘變條件及活化 基礎數(shù)據(jù)（由中國航天科技集團有限公司提供）：在軌飛行67 h；大橢圓軌道，高度范圍324～7970 km，穿越范愛倫輻射帶；傾角42.5°；艙內壓力常壓下；在軌艙壁測溫點實測溫度：最低點 0.8 ℃，最高 37 ℃；艙內搭載物位置溫度范圍：20±5 ℃；對于艙內和設備內部的應用的元器件和材料，試驗船遭受的總劑量處于幾krad 至幾十krad 量級（與所處位置屏蔽厚度相關，具體量值隨屏蔽厚度增加衰降很快），但均高于當前載人飛船的水平。

從搭載菌株的返地固體培養(yǎng)物中取2 g 接入10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.2.3 菌株純化及保存 將活化培養(yǎng)的菌液梯度稀釋，取合適稀釋梯度菌液在MRS 固體培養(yǎng)基上涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑選菌落較大、拉絲較長的單菌落在MRS 固體培養(yǎng)基連續(xù)劃線純化2 代，挑選單菌落于MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20%甘油保菌，-80 ℃冰箱存放。

1.2.4 航天誘變乳酸菌EPS 的提取 參考盧承蓉等[16]的方法并略作修改。按3%接種量將菌株接種于MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3 次后，在4 ℃，10000 r/min 條件下離心10 min，將濃度為800 g/L 的三氯乙酸溶液加入上清液中，使體系中三氯乙酸終濃度為4 g/L，在4 ℃冰箱中靜置6～8 h，離心15 min（10000 r/min，4 ℃），取上清液加入其3 倍體積的95%乙醇，在4 ℃冰箱中靜置12～15 h 后，在4 ℃，10000 r/min 條件下離心15 min，取多糖沉淀，加入去離子水溶解，轉移至截留分子量為8000～14000 Da 的透析袋中，3 h 后換第一次水，之后每隔8 h 換一次水，持續(xù)2 d，收集透析液內液體，經(jīng)真空冷凍干燥后即得到EPS 提取物，以此EPS 提取物進行后續(xù)實驗。

1.2.5 葡萄糖標準曲線的繪制和乳酸菌EPS 含量測定 采用王彥平等[17]的方法并略作修改。在試管中加系列濃度葡萄糖稀釋液200 μL，加入現(xiàn)配的濃度為6%的苯酚溶液200 μL，搖勻，加入1 mL 濃硫酸后混勻，靜置20 min 后于冰水中冷卻，吸取200 μL至96 孔酶標板孔中，在連續(xù)波長多功能微孔板檢測平臺中測定490 nm 處的吸光度。以葡萄糖質量濃度（mg/L）為橫坐標，OD490nm為縱坐標，繪制標準曲線。將乳酸菌EPS 樣品按同樣條件進行反應，測其OD490nm，代入標準曲線得EPS 產(chǎn)量，并計算其提高率：

式中，Am為突變菌株EPS 產(chǎn)量；Aw為原始菌株EPS 產(chǎn)量。

1.2.6 高產(chǎn)EPS 突變菌株遺傳穩(wěn)定性測試 選EPS產(chǎn)量提高的突變菌株連續(xù)培養(yǎng)10 代，每隔兩代測定其EPS 產(chǎn)量，分析其產(chǎn)EPS 的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 航天誘變菌株的性能分析

1.2.7.1 菌體自聚性 參考彭嘉屹等[18]的方法并略作修改，乳酸菌菌株活化兩代，4 ℃，10000 r/min 離心5 min，棄去上清液，用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH6.86）反復兩次洗滌菌體，離心取沉淀，PBS 緩沖液重懸并調整菌液濃度為108CFU/mL，取4 mL 混勻后菌液于室溫下靜置10 h，每隔2 h 吸取水相液體200 μL，測其OD595nm值，并計算自凝聚率：

式中，A0為0 h 時的OD595nm；At分別為2、4、6、8、10 h 時的OD595nm。

1.2.7.2 菌體表面疏水性 乳酸菌菌株活化兩代后，菌液前處理見1.2.7.1，調整菌液濃度為108CFU/mL。取6 mL 菌液分別依次與2 mL 二甲苯（中性溶劑）、三氯甲烷（酸性溶劑）和乙酸乙酯（堿性溶劑）渦旋振蕩混合5 min，室溫放置30 min，吸取水相液體200 μL，測其OD595nm值，并計算表面疏水率[18]：

式中，A0為0 h 時的OD595nm；At為不同溶劑處理30 min 后的水相OD595nm。

1.2.7.3 菌株對酸的耐受性 參考焦時陽等[19]的方法并略作修改，乳酸菌菌株活化兩代后，4 ℃，10000 r/min 離心5 min，棄去上清，用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH6.86）重懸后取500 μL 分別接種到pH 為2.0、3.0、4.0 的9.5 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h 后進行濃度梯度稀釋，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h 后測定活菌數(shù)。

1.2.7.4 菌株對膽鹽的耐受性 乳酸菌菌株活化兩代，4 ℃、10000 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH6.86）重懸后吸取500 μL 分別接種到含2.0、3.0、4.0 g/L 牛膽鹽的5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后進行濃度梯度稀釋，于37 ℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)48 h 后測定活菌數(shù)[19]。

1.2.7.5 菌株對人工模擬胃液的耐受性 參考向宬屹[20]的方法并加以修改，乳酸菌菌株活化兩代，取1 mL 菌液于4 ℃，10000 r/min 條件下離心5 min，棄上清，用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH6.86）洗滌菌體兩次，接種于9 mL 人工模擬胃液中，以PBS 緩沖液作為對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h 后進行濃度梯度稀釋，于37 ℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)48 h 后測定活菌數(shù)。

1.2.7.6 菌株對人工模擬腸液的耐受性 另取1 mL經(jīng)人工模擬胃液處理的菌液于9 mL 人工模擬腸液中處理8 h，每隔2 h 取樣測定其活菌數(shù)[20]。

1.2.8 航天育種乳酸菌EPS 的抗致病菌生物被膜活性的測定 致病菌的活化：以2%的接種量將金黃色葡萄球菌、單增生李斯特菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌分別接種在LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min 活化兩代備用。

根據(jù)Wang 等[21]的方法稍作修改。用新鮮的LB培養(yǎng)基活化致病菌菌株并梯度稀釋至106CFU/mL，取100 μL 細菌培養(yǎng)物加入到96 孔板中，從1、2、4、8 mg/mL 的EPS 溶液中各取100 μL 加入到96 孔板中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，以無菌水作為對照。24 h 后取濃度為0.9%的無菌生理鹽水200 μL 沖洗兩次除去培養(yǎng)基成分和浮游菌，將96 孔板放置于65 ℃恒溫干燥箱中干燥固定，然后每孔加入200 μL濃度為0.1%結晶紫溶液對附著細胞進行染色5 min，用無菌水沖洗三次，在恒溫干燥箱中徹底干燥，最后用200 μL 濃度為33%（v/v）的冰醋酸將與貼壁細胞結合的染料重新溶解10 min，并在595 nm 處測量每個孔的OD 值。按以下公式計算EPS 對致病菌生物被膜的抑制率：

式中，A0為無菌水作為對照的OD595nm值；At為不同濃度EPS 處理的OD595nm值。

1.2.9 乳酸菌EPS 的抗氧化活性的測定 用超純水溶解EPS，分別配制不同濃度的EPS 溶液備用（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL），以相同濃度的抗壞血酸（ascorbic acid，Vc）作為陽性對照。參照文獻方法分別測定其對DPPH 自由基、羥自由基（·OH）、ABTS+自由基、超氧陰離子（O2-·）的清除能力和總還原力[22-25]。

1.2.10 EPS 對α-淀粉酶的抑制活性 用PBS 溶液將EPS 配制成一系列不同濃度的溶液（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL）、α-淀粉酶溶液（1 U/mL）和1%（m/v）淀粉溶液。取不同濃度EPS 溶液與α-淀粉酶各100 μL 混合均勻，37 ℃加熱5 min，加入100 μL淀粉溶液，37 ℃反應20 min，加入2 mL DNS 溶液終止反應，置于100 ℃沸水中5 min 顯色，冷卻后加2 mL 蒸餾水，測其OD540nm。以和樣品相同濃度的阿卡波糖作為陽性對照。按下列公式計算EPS 對α-淀粉酶的抑制活性[26]：

式中A1：100 μL 淀粉酶+100 μL 淀粉溶液+2 mL DNS 試劑；A2：100 μL 淀粉溶液+2 mL DNS 試劑；A3：100 μL 淀粉酶+100 μL EPS 溶液+100 μL 淀粉溶液+2 mL DNS 試劑；A4：100 μL EPS 溶液+100 μL淀粉溶液+2 mL DNS 試劑。

1.2.11 EPS 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性 用PBS 緩沖液將EPS 配制成一系列不同濃度的溶液（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL）、pNPG 溶液（10 mmol/L）和α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL），使用蒸餾水配制1 mol/L Na2CO3溶液。A1：90 μL PBS 溶液+20 μLα-葡萄糖苷酶溶液；A2：110 μL PBS 溶液；A3：80 μL PBS 溶液+20 μLα-葡萄糖苷酶溶液+10 μL EPS 溶液；A4：100 μL PBS 溶液+10 μL EPS 溶液。在96 孔板中分別加入200 μL 上述各溶液，37 ℃預熱30 min 后加入pNPG 50 μL，置于37 ℃恒溫箱，反應60 min 后，加入100 μL Na2CO3溶液終止反應，測其OD405nm。以和樣品相同濃度的阿卡波糖作為陽性對照。按以下公式計算EPS 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[26]：

式中，A1為空白組吸光度；A2為空白對照組吸光度；A3為樣品組吸光度；A4為樣品對照組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復三次，實驗結果以均值±標準差（Means±SD）表示。表格利用Excel 軟件繪制，其余圖表使用Graphpad prism 8.0 繪制，數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 誘變菌株產(chǎn)EPS 含量測定

以無水葡萄糖制作標準曲線，得標準曲線方程y=0.00069x+0.0845，R2=0.9992。分別測定了100 株誘變菌株的EPS 產(chǎn)量，部分菌株的產(chǎn)量見表1，其中誘變菌株L21-50、L21-1、L21-42、L21-37、L21-49、L21-47、L21-41、L21-44 的EPS 產(chǎn)量較原始菌株提高較明顯。

表1 L21 的部分誘變菌株的EPS 產(chǎn)量（±SD，n=4）Table 1 EPS productions of some mutant strains of L21(±SD, n=4)

表1 L21 的部分誘變菌株的EPS 產(chǎn)量（±SD，n=4）Table 1 EPS productions of some mutant strains of L21(±SD, n=4)

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2.2 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

如圖1 所示，在產(chǎn)量較高的誘變菌株中，L21-49在傳代過程中EPS 產(chǎn)量穩(wěn)定且無顯著性差異（P＞0.05），故選取L21-49 誘變菌株進行后續(xù)實驗。

圖1 突變菌株產(chǎn)EPS 的穩(wěn)定性Fig.1 Stabilities of EPS productions of the mutant strains

2.3 高產(chǎn)胞外多糖航天誘變菌株的性能分析

2.3.1 菌體自凝聚性、表面疏水性 乳酸菌能否成為優(yōu)勢菌在腸道中定植并充分發(fā)揮益生功能關鍵取決于其黏附性[27]。自凝聚力能使菌株定植于宿主腸道，確保益生菌在腸道中達到高細胞密度，有助于粘附，使得乳酸菌黏附在腸道細胞實現(xiàn)定植和免疫調節(jié)。圖2A 可知，乳酸菌的自凝聚率會隨著時間的推移逐步提高，6 h 時兩菌株的自聚率顯著提高（P＜0.05）；在10 h 時，L21-49 自聚率最高，為29.36%，L21自聚率為24.04%。結果表明，航天誘變提高了乳酸菌的自凝聚力，更有利于菌株在人體腸道中黏附。此結果與張俊[28]的研究結果一致，他將從甘南傳統(tǒng)牦牛奶中分離篩選出來的副干酪乳桿菌M5 經(jīng)重離子束誘變后，所得的突變菌株與原始菌株相比，自凝聚力提高了20.1%，疏水性則無明顯差異。

圖2 乳酸菌菌體自聚性（A）和表面疏水性（B）Fig.2 Self coagulation (A) and surface hydrophobicity (B) of the LAB strains

細胞表面疏水性可以改善微生物和人類上皮細胞之間的相互作用[29]。疏水率＞50%時為高疏水性菌株；20%＜疏水率＜50%時為中疏水菌株；疏水率＜20%為低疏水性菌株[30]。從圖2B 可以看出，L21為低疏水性菌株，但L21-49 的疏水性有所提高，對于中性溶劑二甲苯仍為低疏水性菌株，對于酸性溶劑三氯甲烷和堿性溶劑乙酸乙酯，則成為了中疏水性菌株。說明航天育種提高了原始菌株的疏水性。但文鵬程等[31]研究航天誘變副干酪乳桿菌A-4-2 時發(fā)現(xiàn)，突變菌株與野生菌株相比，表面疏水性顯著降低（P＜0.05），考慮到有可能是因為菌株的差異以及復雜的太空環(huán)境導致的菌株突變方向有所不同所致。

2.3.2 乳酸菌耐受性 要想在腸道中發(fā)揮益生特性，益生菌必須經(jīng)過胃腸環(huán)境，因此首先需要具有酸和膽汁耐受性才能在腸道中存活。如圖3A 所示，pH 為4 時，L21 及突變菌株的活菌數(shù)在108CFU/mL，隨pH 下降，活菌數(shù)減少，在pH 為2、3 時，均保持在107CFU/mL。原始菌株與變異株無明顯差異，均具有較強耐酸性。

圖3 乳酸菌耐受性Fig.3 Tolerances of the LAB strains

乳酸菌對于膽鹽的耐受壓力主要是來自于膽囊在十二指腸處分泌的膽汁。如圖3B 所示，L21 在膽鹽濃度為2.00、3.00、4.00 g/L 時，活菌數(shù)逐漸下降，而其突變株的活菌數(shù)均保持在107CFU/mL。可見誘變菌株的膽鹽耐受性提升了。有研究表明，乳酸菌在高濃度膽鹽刺激下，會更多地產(chǎn)生胞外多糖從而形成保護，使乳酸菌對膽鹽更加具有耐受性[32]。

考慮到人體消化道的連續(xù)性，乳酸菌必須經(jīng)過連續(xù)的胃液與腸液的考驗。如圖3C 和圖3D 所示，2 株菌在經(jīng)過人工模擬胃液處理2 h 后活菌數(shù)均保持在108～109CFU/mL。取經(jīng)過胃液處理的菌液再經(jīng)2 h 腸液處理后，L21 及其突變株的活菌數(shù)從108CFU/mL 下降到106CFU/mL，隨著時間的延長，活菌數(shù)均維持在106CFU/mL。

由結果可知，突變菌株與原始菌株相比，耐酸及耐人工模擬胃腸液性能并未受到影響，耐膽鹽性能有所提升。文鵬程等[31]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)航天誘變的副干酪乳桿菌與原始菌株相比，耐酸能力有所提高，耐膽鹽和產(chǎn)胞外多糖能力與野生菌株均無顯著差異（P＞0.05）。盧承蓉等[16]對高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌進行紫外誘變，發(fā)現(xiàn)誘變菌株的耐酸性、耐膽鹽、耐人工模擬胃腸液性能均稍優(yōu)于原始菌株。這說明菌株突變存在不定向性和隨機性，但就本文來說，航空誘變未影響菌株耐酸和耐人工模擬胃腸液等性能，還提高了菌株耐膽鹽能力。

2.4 乳酸菌EPS 的抗致病菌生物被膜活性

分析2 株菌的EPS 對2 種革蘭氏陽性致病菌（金黃色葡萄菌和單增生李斯特菌）和2 種革蘭氏陰性致病菌（大腸桿菌和銅綠假單胞菌）的生物被膜的抑制作用，結果如圖4 所示。L21 和L21-49 的EPS對4 種菌的生物被膜抑制率皆隨著EPS 濃度的升高而升高，誘變菌株與原始菌株抑制率無顯著差異?？偟膩碚f，乳酸菌菌株L21 與L21-49 的EPS 對單增李斯特菌生物被膜的抑制率高于其他致病菌。這與Bai 等[32]的研究結果部分一致，EPS 對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生物被膜的抑制能力呈劑量依賴增加，乳酸菌所產(chǎn)EPS 在2 mg/mL 時，對單增李斯特菌和腸鏈球菌生物被膜形成能力具有較強抑制作用,抑制率分別為55.28%和55.18%。Lakra 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，魏斯氏乳酸菌所產(chǎn)EPS 對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、腸沙門氏菌和傷寒沙門氏菌具有明顯的抗生物被膜活性。

圖4 乳酸菌EPS 抗生物被膜活性Fig.4 Anti-biofilm activities of the LAB EPS

2.5 乳酸菌EPS 的抗氧化活性

高氧水平會導致體內活性氧（ROS）的形成，包括超氧陰離子（）、過氧化氫（H2O2）和高活性羥基自由基（·OH）[34]。ROS 積累后會引起氧化應激，從而導致蛋白質、DNA 和脂質受損，甚至導致細胞死亡[35]。在本研究中，分析了乳酸菌EPS 對DPPH、OH、ABTS+和自由基清除能力以及總還原能力，以VC作為陽性對照（圖5）。

圖5 乳酸菌EPS 的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of the LAB EPS

DPPH 自由基在有機溶劑中相對穩(wěn)定，因此常常作為評價抗氧化劑對于體外抗氧化活性評價的模型。隨著EPS 濃度的升高，其對DPPH 自由基的清除率有著明顯的濃度依賴性。在EPS 濃度為0.5～8.0 mg/mL 時，L21 和L21-49 的EPS 對DPPH 清除率分別為16.99%～85.15%和23.20%～91.75%。趙丹等[36]報道假腸膜明串珠菌HDL-3 胞外多糖（5.0 mg/mL）對DPPH 自由基的清除率為36.58%±1.04%。方偉等[37]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌CECT 5716的EPS 的濃度為8.0 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率為（84.17±1.30）%。本研究結果優(yōu)于趙丹等[36]，與方偉等[37]相似。航天誘變前后乳酸菌EPS 均展現(xiàn)了較好的DPPH 自由基清除能力，當濃度為8.0 mg/mL時，L21-49 清除DPPH 活性稍高一些，但總體上誘變菌株與原始菌株清除率之間沒有顯著差異。

·OH 在體內新陳代謝中活性最強毒性最大，會與體內細胞造成很嚴重的氧化損傷，因此·OH 也被用于評價抗氧化活性。EPS 對·OH 的清除率有著一定的濃度依賴性。在EPS 濃度為0.5～8.0 mg/mL 時，L21 和L21-49 的EPS 對·OH 清除率分別為20.20%～30.82%和18.74%～38.44%。EPS 最高濃度時L21-49 清除·OH 活性較優(yōu)于L21，誘變菌株與原始菌株清除率之間沒有顯著差異。

ABTS+自由基清除模型也是評價體外抗氧化劑抗氧化活性的重要指標之一。隨著EPS 濃度的升高，對ABTS+自由基的清除率也存在一定的濃度依賴性。在EPS 濃度為0.5～8.0 mg/mL 時，L21 和L21-49 的EPS 對ABTS+自由基清除率分別為25.21%～47.11%和25.32%～54.71%。EPS 濃度為8.00 mg/mL時，誘變菌株與原始菌株EPS 的清除率之間沒有顯著差異。盧承蓉等[16]發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌L15、L15U2-26 產(chǎn)EPS 對ABTS+自由基的清除率分別為12.87%～71.79%、10.73%～76.25%。誘變前后菌株EPS 的清除率也無明顯差異；方偉等[37]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌CECT 5716 的EPS（8.0 mg/mL）對ABTS+自由基的清除率為（35.37±1.24）%。本研究結果優(yōu)于其結果。

抗氧化劑的抗氧化能力是與總還原能力之間存在一定的相關性，因此可以把乳酸菌EPS 的總還原能力作為評價其抗氧化性活性的指標。隨著EPS 濃度的升高，EPS 總還原力也存在濃度依賴性。L21-49 與L21 的EPS 的總還原力相差不大，但相同濃度下，乳酸菌EPS 的總還原能力顯著低于VC，原因可能是EPS 作為大分子，還原末端比較少[39]。

總體來看，航天誘變并未影響菌株EPS 的抗氧化能力，兩菌株EPS 對幾種自由基的清除效果是：DPPH 自由基＞O2-自由基＞ABTS+自由基＞OH 自由基。L21 與L21-49 的EPS 都具有良好的體外抗氧化活性，且兩者抗氧化效果并未出現(xiàn)明顯差異，考慮到航天誘變可能并未改變菌株EPS 結構，而只是提升其產(chǎn)EPS 的能力。

2.6 乳酸菌EPS 對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果

人體食用的碳水化合物類物質通常最先在口腔中被α-淀粉酶分解成寡糖片段，隨后在小腸內被α-葡萄糖苷酶分解，得到的葡萄糖進入血液中使得血糖水平上升[40]。本研究通過乳酸菌EPS 對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果來評價其體外降血糖活性，結果如圖6 所示。2 株乳酸菌EPS 對α-淀粉酶的抑制能力呈一定的濃度依賴性，L21 和L21-49 的EPS 在濃度為8.00 mg/mL 時的抑制率分別為22.97%和23.52%，但與阿卡波糖相比，乳酸菌EPS 的抑制活性較弱。有研究表明在8.0 mg/mL 濃度下，植物乳桿菌HY 和BR2 產(chǎn)EPS 對α-淀粉酶的抑制率分別為26.06%和21.88%[41-42]，也遠低于阿卡波糖降血糖活性。對于α-葡萄糖苷酶抑制率，2 株菌EPS也隨著濃度的升高而增加，在濃度為8.0 mg/mL 時的抑制率分別為50.16%和51.15%，無顯著差異。張宇[43]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌胞外多糖對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，其LPP-2 組分在濃度為1.6 mg/mL時，抑制率最高，為57.36%，與本文結果相似。本研究證明乳酸片球菌L21 及誘變菌株具有一定的體外降血糖潛力，但對于其在體內的降血糖效果還需要進一步研究。

圖6 乳酸菌EPS 的降血糖活性Fig.6 Hypoglycemic activities of the LAB EPS

3 結論

本研究對乳酸片球菌L21 的航天誘變菌株進行EPS 產(chǎn)量及遺傳穩(wěn)定性分析，篩選得到1 株高產(chǎn)EPS 且遺傳穩(wěn)定的突變菌株L21-49，其EPS 產(chǎn)量較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了26.54%。L21-49 具有較強的自聚性、疏水性、耐受酸及人工胃腸液的益生特性，并且在高濃度膽鹽的環(huán)境下依然存活。L21-49 的EPS 對DPPH·、ABTS+·、·OH、O2-·均有一定的清除作用，總還原力較高，具有良好的體外抗氧化能力；對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等致病菌的生物被膜具有抑制作用；具有一定的抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活力。

本文通過航天誘變技術對乳酸菌進行誘變，從中篩選高產(chǎn) EPS 的乳酸片球菌并考察其益生性能，為擴大乳酸菌的綜合利用，以及使其EPS 成為一種多功能活性物質提供參考依據(jù)。后續(xù)還需進一步分析誘變菌株的性能，并探究EPS 的結構以及其與功能活性的關系。