蔡偉琪，鐘武杰，周嘉健，蹇華麗

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

醬油的生產(chǎn)工藝主要分為高鹽稀態(tài)發(fā)酵和低鹽固態(tài)發(fā)酵，前者發(fā)酵周期長(zhǎng)，耐鹽微生物能充分發(fā)揮作用[1-2]，產(chǎn)生大量有機(jī)酸類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)，使成品香氣更加濃郁、色澤更加鮮艷[3-5]。這與醇類(lèi)物質(zhì)在其中發(fā)揮的作用密不可分[6]，一方面，這類(lèi)物質(zhì)在醬油風(fēng)味成分中占有很大的比重，能為醬油帶來(lái)協(xié)調(diào)、柔和的口感；另一方面，又對(duì)酯類(lèi)物質(zhì)形成具有重要作用[7-8]。

在對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油香氣成分的研究中發(fā)現(xiàn)，具有玫瑰型香氣的β-苯乙醇常常作為其中一種特征風(fēng)味物質(zhì)被檢出，且具有較高的香氣活性值（odor activity value，OAV）[9-12]，此外，Wang 等[13]通過(guò)芳香萃取物稀釋分析（Aroma extract dilution analysis，AEDA）驗(yàn)證了β-苯乙醇是高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油11 種關(guān)鍵香氣化合物之一，說(shuō)明β-苯乙醇對(duì)醬油的香氣組成有重要貢獻(xiàn)，可為醬油提供花香[14]。彭東等[15]將篩選出的耐鹽生香酵母應(yīng)用到醬油釀造中發(fā)現(xiàn)，β-苯乙醇為主要特征香氣物質(zhì)之一。Yao 等[16]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種魯氏接合酵母能提升β-苯乙醇等醇類(lèi)物質(zhì)的含量。此外，阮志強(qiáng)等[17]通過(guò)研究發(fā)酵過(guò)程優(yōu)勢(shì)真菌與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，接合酵母屬與β-苯乙醇等多種醇類(lèi)及酯類(lèi)物質(zhì)呈顯著正相關(guān)。

盡管目前已有許多針對(duì)醬油釀造中的耐鹽產(chǎn)香微生物進(jìn)行分離篩選的研究[18-19]，但少有以產(chǎn)β-苯乙醇菌株的篩選為目的，并找到與實(shí)際生產(chǎn)相適應(yīng)的工藝，從而提升醬油風(fēng)味的報(bào)道。本研究從高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中篩選出一株產(chǎn)β-苯乙醇的耐鹽酵母，在對(duì)其產(chǎn)β-苯乙醇發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將富含β-苯乙醇的風(fēng)味液與鹽水進(jìn)行調(diào)配，并應(yīng)用到高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的釀造中，旨在進(jìn)一步提升醬油品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵50 d 醬醪樣品 取自李錦記（新會(huì)）食品有限公司；面粉、黃豆、食鹽 均為市售；醬油曲精（滬釀3.042 米曲霉） 購(gòu)于濟(jì)寧祥園生物科技有限公司；β-苯乙醇 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷 色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；果糖、D-半乳糖、L-苯丙氨酸、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC） 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、氯化鈉、氯化銨、麥芽糖及其他生化試劑 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；尿素、硫酸鎂、磷酸氫二鉀 分析純，廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 北京酷來(lái)搏科技有限公司；酵母浸膏、麥芽汁培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA 抽提試劑盒（真菌） Omega USA；PCR 引物 擎科生物；TTC 雙層培養(yǎng)基：上層：葡萄糖5 g、瓊脂粉15 g、TTC 試劑0.5 g，蒸餾水1000 mL；下層：葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、酵母膏1.5 g、MgSO4·7H2O 4 g、K2HPO41 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH5.6～5.8，121 ℃滅菌15 min；YPD 培養(yǎng)基：酵母膏 10 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉 20 g，115 ℃ 滅菌 20 min；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：L-苯丙氨酸 4 g、葡萄糖 30 g、蛋白胨 6 g、硫酸鎂 0.5 g、磷酸氫二鉀 5 g、NaCl 100 g、蒸餾水 1000 mL，121 ℃滅菌 20 min。

TSQ 8000 Evo 三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（色譜柱TG-WAXMS（60 m×0.25 mm，0.25 μm）） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；TGL-16gR 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上海安亭有限公司；UV-1240 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；ABI GeneAmp? 9700 PCR 儀Applied Biosystems；FR-980A 凝膠成像儀 上海復(fù)日科技儀器有限公司；DYCP-31DN DNA 電泳儀北京六一生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株的篩選 取發(fā)酵50 d 醬醪樣品，富集培養(yǎng)48 h[20]，稀釋后涂布TTC 下層平板，28 ℃培養(yǎng)72 h，倒入TTC 上層培養(yǎng)基，28 ℃避光培養(yǎng)2～3 h 后，挑選深色菌落作為初篩菌株，進(jìn)一步分離純化并接入麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h，用二氯甲烷提取發(fā)酵液中β-苯乙醇并通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀定量檢測(cè)其含量，最終得到高產(chǎn)β-苯乙醇的菌株，命名為J13。

1.2.2 菌株鑒定及生物學(xué)特性分析

1.2.2.1 細(xì)胞形態(tài)特征的顯微鏡觀察 將J13 接種于酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）上，28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察并記錄菌落顏色、形狀、質(zhì)地情況等菌落特征。在干凈載玻片上滴1 滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取少量菌體并涂布均勻中，蓋上蓋玻片，40 倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

1.2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn) 參考《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[21]，對(duì)J13 進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。其中，糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化試驗(yàn)用培養(yǎng)基參照王靖雯等[18]的方法，接種量均為2×107個(gè)/mL，30 ℃條件下培養(yǎng)3～7 d，以不含碳源、氮源作為陰性對(duì)照。脲酶、產(chǎn)類(lèi)淀粉化合物、重氮基藍(lán)B（DBB）、高濃度葡萄糖生長(zhǎng)試驗(yàn)用培養(yǎng)基均采用YPD 培養(yǎng)基，具體實(shí)驗(yàn)方法參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[21]，尿素培養(yǎng)基、DBB 染色劑的配制方法參照《現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[22]。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 以J13 的全基因組為模板，以ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 14.7 μL，10×Taq buffer 2.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.1 μL，dNTP Mix 1.6 μL，Primer1 0.8 μL，Primer2 0.8 μL，模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸35 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠對(duì)10 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)測(cè)序結(jié)果，用MEGA 11 的鄰位連接法（Neighbor-Joining method）[23]對(duì)選擇的序列進(jìn)行1000 次步長(zhǎng)計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2.4 生物學(xué)特性分析 將Z. rouxii13 接入麥芽汁培養(yǎng)基中，在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、初始pH6、30 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)72 h。分別改變培養(yǎng)基NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、5%、10%、15%、20%、25%）、初始pH（3、4、5、6、7、8）、培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40 ℃），以菌體干重為指標(biāo)，考察Z. rouxii13 的耐鹽性、pH 耐受性、生長(zhǎng)溫度范圍。

1.2.3 酵母菌株產(chǎn)β-苯乙醇發(fā)酵工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

以碳源種類(lèi)及濃度、氮源種類(lèi)及濃度、接種量（v/v）、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、初始pH、溫度作為實(shí)驗(yàn)因素，按下述培養(yǎng)條件分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[24-26]。挑取Z. rouxii13 斜面培養(yǎng)物接入麥芽汁培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min 培養(yǎng)48 h，得到種子液。發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH6、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、L-苯丙氨酸4 g/L、葡萄糖30 g/L、蛋白胨6 g/L、30 ℃、180 r/min、5%接種量、培養(yǎng)96 h。

1.2.3.1 碳源種類(lèi)及濃度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 分別以等量的麥芽糖、果糖、葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖代替轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)篩選最佳碳源種類(lèi)。確定最佳碳氮源后，分別研究不同碳源濃度（10、30、50、70、90 g/L）對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響，篩選出最佳碳源濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 分別以等量的蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、氯化銨、尿素代替轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的氮源，其他成分不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)篩選最佳氮源種類(lèi)。確定最佳氮源后，研究不同氮源濃度（2、4、6、8、10 g/L）對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響，篩選出最佳氮源濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 接種量對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 改變接種量（3%、5%、7%、9%、11%（v/v）），其余條件不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)，研究不同接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響。

1.2.3.4 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 改變NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、5%、10%、15%、20%）其余條件不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)，研究不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響。

1.2.3.5 初始pH 對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 改變初始pH（4、5、6、7、8），其余條件不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)，研究不同初始pH 對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響。

1.2.3.6 溫度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 改變培養(yǎng)溫度（18、23、28、33、38 ℃），其余條件不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)，研究不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響。

1.2.3.7 L-苯丙氨酸濃度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 改變L-苯丙氨酸濃度（0、4、8、10、12 g/L），其余條件不變，以菌體干重及β-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo)，研究不同L-苯丙氨酸濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響。

1.2.4 酵母菌株產(chǎn)β-苯乙醇發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇蛋白胨（A）、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、溫度（C）作為正交試驗(yàn)變量，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以β-苯乙醇產(chǎn)量為考察指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

1.2.5 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油制作工藝

1.2.5.1 制曲工藝 參考高獻(xiàn)禮[27]的醬油釀造工藝。黃豆浸泡3 h，在115 ℃下滅菌30 min，取出冷卻。以黃豆:面粉質(zhì)量比=3:1 的比例混合，以萬(wàn)分之四的接種量接入曲精，31 ℃培養(yǎng)，在制曲的第10、18 及26 h 分別翻曲一次，第40 h 時(shí)，曲料表面呈黃綠色，制曲完成。

1.2.5.2 發(fā)酵工藝 參考某企業(yè)生產(chǎn)參數(shù)并稍作修改，采用最優(yōu)發(fā)酵條件培養(yǎng)Z. rouxii13 得到培養(yǎng)液，在6000 r/min，4 ℃，10 min 條件下對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心，去除菌體，得到風(fēng)味液并加入2 倍質(zhì)量比的鹽水，最終配成NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的調(diào)配液，以成曲：調(diào)配液質(zhì)量比=1：2.33 的比例混合，置于3.2 L 發(fā)酵罐中常溫釀造20 d，每天攪拌一次。釀造結(jié)束后用紗布過(guò)濾醬醪，得到醬油用于感官評(píng)定。

1.2.6.1β-苯乙醇的提取及檢測(cè) 參考榮紹豐等[28]的方法，提取并檢測(cè)發(fā)酵液中的β-苯乙醇含量。發(fā)酵液于6000 r/min、4 ℃條件下離心10 min 后取10 mL 上清液，加入等體積二氯甲烷，萃取30 min 后取有機(jī)相，根據(jù)濃度用二氯甲烷適當(dāng)稀釋?zhuān)?.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾并收集濾液。GC 條件：載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比為10:1，色譜柱升溫程序?yàn)椋?0 ℃，保留1 min；以8 ℃/min升溫到180 ℃，保留2 min；再以5 ℃/min 升溫到220 ℃，保留10 min。MS 條件：采用電子電離方式，電離能為70 eV，檢測(cè)器電壓為857 V，掃描范圍為m/z 50～400，掃描速率為2.00 scans/s；進(jìn)樣口和離子源溫度分別為250 ℃和230 ℃。采用SIM 模式，以m/z 91.1 和122.0 兩個(gè)離子為定量離子進(jìn)行分析。采用外標(biāo)法定量檢測(cè)β-苯乙醇濃度。β-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法為：取β-苯乙醇標(biāo)品梯度稀釋到質(zhì)量濃度5.1、10.2、20.4、30.6、40.8 mg/L，采用上述GC和MS 條件檢測(cè)不同質(zhì)量濃度β-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=3E+06x-7E+06（R2=0.9939）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算β-苯乙醇含量。

1.2.6.2 生物量的測(cè)定 取9 mL 發(fā)酵液，6000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌三次，105 ℃烘干，稱重。

1.2.7 醬油風(fēng)味的感官評(píng)定 由17 名具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的食品專(zhuān)業(yè)的人員組成評(píng)定小組，參照文獻(xiàn)[29-30]中能代表醬油香氣輪廓的描述詞，對(duì)醬油的醬香、醇厚、鮮味、酸味、咸味、色澤、整體評(píng)價(jià)7 個(gè)指標(biāo)采用10 分制進(jìn)行評(píng)價(jià)（1 表示無(wú)感覺(jué)，10 表示感覺(jué)強(qiáng)烈）。評(píng)定時(shí)成員之間互不交流，樣品評(píng)定之間用純凈水漱口。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行方差分析，并通過(guò)Duncan’s 進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05），使用Origin 2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株的篩選及鑒定

2.1.1 產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株的篩選 酵母活細(xì)胞中的脫氫酶能將無(wú)色的氧化態(tài)TTC 還原為紅色的三苯基甲瓚（TTF），從而將平板上的菌落染成紅色[31]。因此可通過(guò)呈色的深淺來(lái)判斷菌株產(chǎn)β-苯乙醇能力的高低。通過(guò)呈色反應(yīng)，選出45 株顯色明顯的菌株。進(jìn)一步對(duì)比，選出4 株顏色較深的菌株，分別為J5、J7、J13、J15，對(duì)這4 株菌株進(jìn)行復(fù)篩。通過(guò)GC-MS測(cè)定4 株菌在麥芽汁培養(yǎng)基中的β-苯乙醇產(chǎn)量。結(jié)果表明，J13 的β-苯乙醇產(chǎn)量最高，達(dá)到177.88 mg/L。因此，選擇J13 作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

2.1.2 酵母的形態(tài)特征 通過(guò)菌落形態(tài)觀察（圖1a），J13 在YPD 平板上培養(yǎng)的菌落形態(tài)呈圓形，乳白色，光滑，中間凸起。通過(guò)顯微鏡觀察，J13 細(xì)胞為橢圓形，出芽生殖（圖1b）。

通常情況下，果樹(shù)在實(shí)際的成長(zhǎng)過(guò)程當(dāng)中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)發(fā)育不均衡的現(xiàn)象。因此，在實(shí)際的果樹(shù)培養(yǎng)當(dāng)中，需要定期對(duì)果樹(shù)進(jìn)行修剪，適時(shí)的調(diào)整果樹(shù)的樹(shù)枝、樹(shù)冠等，調(diào)整果樹(shù)的平衡。如果果樹(shù)的花或者芽等過(guò)多的出現(xiàn)在同一枝條上，果樹(shù)管理人員需要對(duì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男藜簦苊鈽?shù)枝上的營(yíng)養(yǎng)被過(guò)多的果實(shí)所吸收，影響果實(shí)的成長(zhǎng)質(zhì)量。管理人員在不同情況下，對(duì)果樹(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男藜襞c調(diào)整，在很大程度上有助于提升果樹(shù)的結(jié)果質(zhì)量。

2.1.3 酵母的生理生化鑒定 如表2 所示，J13 能發(fā)酵葡萄糖、果糖，不能發(fā)酵木糖等其他糖類(lèi)物質(zhì)。能同化葡萄糖、麥芽糖和果糖，不能同化淀粉等其他碳源。能同化蛋白胨，不能同化尿素、硫酸銨和硝酸鈉。其他試驗(yàn)結(jié)果表明，J13 脲酶、DBB 及產(chǎn)類(lèi)淀粉化合物測(cè)試均為陰性，能在高葡萄糖濃度下生長(zhǎng)。將這些結(jié)果與文獻(xiàn)中的生理生化結(jié)果對(duì)比[32]，發(fā)現(xiàn)J13 與魯氏接合酵母的描述基本一致。

表2 J13 生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification of J13

2.1.4 酵母的ITS 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，J13 與多株魯氏接合酵母的ITS 序列相似性高達(dá)100%，隨機(jī)挑選幾個(gè)菌種的ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2 所示。結(jié)果表明，J13 與OL679475.1 序列的親緣關(guān)系最近，位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一分支，可信度高達(dá)100%。初步確定分離菌株為魯氏接合酵母。綜合《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中魯氏結(jié)接合酵母的生理生化特征描述、ITS 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，最終鑒定J13 為Z. rouxii。

圖2 分離菌株ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strain based on its ITS sequence

2.1.5 酵母的生物學(xué)特性 如圖3A 所示，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Z. rouxii13 的生物量影響顯著。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～10%的范圍內(nèi)，Z. rouxii13 的生物量隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)超過(guò)10%時(shí)，生物量隨之下降，在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，Z.rouxii13 仍然能生長(zhǎng)，說(shuō)明其具有一定的耐鹽性，能在高鹽稀態(tài)醬油中生長(zhǎng)。

如圖3B 所示，培養(yǎng)基的初始pH 對(duì)Z. rouxii13的生物量影響顯著。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 為3 時(shí)，其生長(zhǎng)明顯受到抑制，當(dāng)初始pH 為4～7 范圍內(nèi)，其生物量隨著pH 的增加而增加。這與醬油發(fā)酵過(guò)程中的pH 范圍相符[33]，說(shuō)明Z. rouxii13 能在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)。

如圖3C 所示，在20～35 ℃溫度范圍內(nèi)，Z. rouxii13 的生物量先增加后減少，25 ℃時(shí)生物量達(dá)到最高，當(dāng)溫度升高到40 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)明顯受到抑制。

2.2 酵母菌株產(chǎn)β-苯乙醇的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 碳源種類(lèi)及濃度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 碳源種類(lèi)對(duì)Z. rouxii13 的生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響如圖4A 所示，其影響從大到小排序依次為：麥芽糖＞果糖＞葡萄糖＞D-半乳糖＞蔗糖，而前三種碳源對(duì)β-苯乙醇產(chǎn)量無(wú)顯著差異，考慮到葡萄糖廉價(jià)易得，因此以葡萄糖作為最優(yōu)碳源。由圖4B 可得，在葡萄糖添加量為10～90 g/L 范圍內(nèi)，Z. rouxii13 的生物量及β-苯乙醇產(chǎn)量均無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。結(jié)合本研究L-苯丙氨酸濃度優(yōu)化結(jié)果，分析可能是由于L-苯丙氨酸的存在使Z. rouxii13 的生長(zhǎng)受到抑制[24]，在這種條件下碳源濃度的改變對(duì)Z. rouxii13 的生物量影響不大。從經(jīng)濟(jì)成本的角度考慮，選擇葡萄糖用量較少的濃度即30 g/L 的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2.2 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 氮源種類(lèi)對(duì)Z. rouxii13 的生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響如圖4C 所示，其影響從大到小排序依次為：蛋白胨＞酵母膏＞氯化銨＞硫酸銨＞尿素，因此以蛋白胨作為最優(yōu)氮源。由圖4D 可得，在蛋白胨添加量為2～10 g/L 范圍內(nèi)，隨著蛋白胨濃度的增加，Z. rouxii13 的生物量及β-苯乙醇產(chǎn)量均先增加后減少，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹? g/L 時(shí)，生物量達(dá)最大值3.7 g/L，β-苯乙醇產(chǎn)量為1002.8 mg/L。在蛋白胨濃度為4～10 g/L 的范圍內(nèi)，β-苯乙醇產(chǎn)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但在蛋白胨濃度分別為10 g/L 和4 g/L時(shí)，生物量分別為3.15 g/L 和1.92 g/L，前者的生物量顯著高于后者（P＜0.05），因此選擇6～10 g/L 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 接種量對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 由圖5A 可得，在接種量為3%～11%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，Z. rouxii13 的生物量先增加后不變，β-苯乙醇產(chǎn)量無(wú)顯著差異（P＞0.05），參考史榮超等[25]對(duì)發(fā)酵過(guò)程中接種量對(duì)β-苯乙醇產(chǎn)量影響的研究，接種量的改變對(duì)最終β-苯乙醇產(chǎn)量的影響并不顯著（P＞0.05），因此選擇5%作為接種量。

圖5 接種量（A）、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、初始pH（C）、發(fā)酵溫度（D）、L-苯丙氨酸濃度（E）對(duì)Z. rouxii 13 生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化合成β-苯乙醇能力高低的影響Fig.5 Effects of inoculation (A), NaCl concentration (B), initial pH (C), fermentation temperature (D) and L-phenylalanine (E)on the growth and transformation synthesis of β-phenylethanol of Z. rouxii 13

2.2.4 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 由圖5B 可得，在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～20%范圍內(nèi)，隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，Z. rouxii13 的生物量及β-苯乙醇產(chǎn)量均顯著性下降（P＜0.05）。結(jié)合本研究L-苯丙氨酸濃度優(yōu)化結(jié)果，分析可能是由于在L-苯丙氨酸的存在下，Z. rouxii13 的生長(zhǎng)受到抑制[24]，在這種條件下再去適當(dāng)增加NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，反而會(huì)抑制其生長(zhǎng)。當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，Z. rouxii13 仍能生長(zhǎng)，說(shuō)明其具有一定的耐鹽性，能在高鹽稀態(tài)醬油中生長(zhǎng)。在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～10%的水平范圍內(nèi)，β-苯乙醇產(chǎn)量顯著高于其他水平（P＜0.05），因此選擇這三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.5 初始pH 對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 由圖5C 可得，在初始pH 為4～8 范圍內(nèi)，隨著初始pH 的增加，Z. rouxii13 的生物量及β-苯乙醇產(chǎn)量均先增加后不變。研究表明pH 也會(huì)通過(guò)影響艾氏途徑中的關(guān)鍵酶活性從而影響芳香醇的產(chǎn)量，而這種影響既有正相關(guān)的也有負(fù)相關(guān)的[34]，因此需要采用折中的pH 來(lái)平衡整個(gè)艾氏途徑，故選擇pH6 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.6 溫度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 由圖5D 可得，在發(fā)酵溫度為18～38 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，Z. rouxii13 的生物量及β-苯乙醇產(chǎn)量均先增加后減少，當(dāng)溫度為23 ℃時(shí)，生物量達(dá)最大值4.36 g/L，β-苯乙醇產(chǎn)量為878.38 mg/L。結(jié)果表明，在溫度為18～28 ℃范圍內(nèi)，菌株生物量及β-苯乙醇產(chǎn)量均高于其他水平，因此選擇這三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.7 L-苯丙氨酸濃度對(duì)Z. rouxii13 生長(zhǎng)及β-苯乙醇產(chǎn)量的影響 由圖5E 可得，隨著L-苯丙氨酸濃度的增加，Z. rouxii13 的生物量逐漸減少，β-苯乙醇含量先增加后減少，當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為0 g/L 時(shí)，有利于Z. rouxii13 生長(zhǎng)，但由于缺少前體物質(zhì)L-苯丙氨酸，Z. rouxii13 幾乎不產(chǎn)β-苯乙醇，當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為4 g/L 時(shí)，Z. rouxii13 的生長(zhǎng)已明顯受到抑制，但β-苯乙醇含量顯著增加，說(shuō)明L-苯丙氨酸的存在可以促進(jìn)β-苯乙醇的合成，且抑制Z. rouxii13 生長(zhǎng)。當(dāng)繼續(xù)增加L-苯丙氨酸濃度，Z. rouxii13 的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，因此選擇L-苯丙氨酸濃度為4 g/L 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.8 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3 及表4。由極差分析可知，影響Z.rouxii13 產(chǎn)β-苯乙醇含量的主次因素依次為溫度、蛋白胨、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由方差分析可知，溫度、蛋白胨達(dá)到了顯著水平，分析可知理論最佳優(yōu)化組合是A3B2C3。通過(guò)最佳組合驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明最優(yōu)組合為A3B2C3，即蛋白胨10 g/L、NaCl 5%、溫度28 ℃，此條件下的β-苯乙醇含量為1.40 g/L。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of test results

2.3 風(fēng)味液對(duì)醬油感官品質(zhì)的影響

對(duì)2 個(gè)不同處理的樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，繪制雷達(dá)圖，由圖6 可知，風(fēng)味液組與對(duì)照組的整體評(píng)分分別為7.01 分和6.22 分，顯示出風(fēng)味液組具有更高的可接受度。在醬香、醇厚感和鮮味方面，風(fēng)味液組得分分別為7.05 分、7.02 分、6.47 分，對(duì)照組得分分別為5.62 分、5.52 分、5.77 分。在色澤、酸味和咸味方面，兩組差異不明顯。綜上分析，添加富含β-苯乙醇的風(fēng)味液賦予醬油更加濃郁的醬香及醇厚的口感，且提升了醬油的鮮味。

圖6 風(fēng)味液組與對(duì)照組感官分析雷達(dá)圖Fig.6 Radar chart of sensory analysis of flavoring group and control group

3 結(jié)論

本研究從天然醬醪中篩選出一株產(chǎn)β-苯乙醇的酵母，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)方法鑒定并命名為Z. rouxii13。其耐受20% NaCl，能適應(yīng)寬廣的pH 環(huán)境及溫度范圍，具有優(yōu)良的生物學(xué)特性。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)Z. rouxii13 產(chǎn)β-苯乙醇的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為：L-苯丙氨酸4 g/L、葡萄糖30 g/L、蛋白胨10 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸氫二鉀5 g/L、NaCl 50 g/L、pH6.0，溫度28 ℃，β-苯乙醇含量達(dá)到1.40 g/L。通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，得到富含β-苯乙醇的風(fēng)味液，將其應(yīng)用到高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的釀造工藝中發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，醬油的醬香及醇厚感明顯提升。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明β-苯乙醇對(duì)醬油香氣組成有重要貢獻(xiàn)，這與許多前期研究的結(jié)果一致[13,35]，此外，本研究將富含β-苯乙醇的風(fēng)味液應(yīng)用于醬油釀造中以此提升醬油整體風(fēng)味，這為企業(yè)改善醬油整體香氣提供了一定的思路和方法。由于風(fēng)味液在整體工藝中的添加時(shí)機(jī)及添加量對(duì)醬油的風(fēng)味有至關(guān)重要的影響，本研究將進(jìn)一步開(kāi)展該方面的研究；同時(shí)，直接將高產(chǎn)β-苯乙醇的菌株選擇合適的時(shí)機(jī)及接種量接種至醬醪中，同時(shí)優(yōu)化發(fā)酵條件，使其適應(yīng)并融入多菌種發(fā)酵體系，從而強(qiáng)化醬油釀造工藝也將是另一個(gè)可行的研究方向。