呂 想，高甜甜，劉 偉 ，張菊華,

（1.湖南大學(xué)生物學(xué)院隆平分院，湖南長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125；3.果蔬貯藏加工及質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410125）

我國(guó)是柑橘類(lèi)水果種植面積和產(chǎn)量第一的大國(guó)，臍橙是在我國(guó)柑橘產(chǎn)量中占據(jù)較大比重的一種。臍橙富含維生素、氨基酸、類(lèi)胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)成分，有著較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。近年來(lái)臍橙的深度開(kāi)發(fā)得到越來(lái)越多學(xué)者的重視[2]。已有的臍橙開(kāi)發(fā)方向以鮮食和橙汁加工為主，存在利用率和附加值低的問(wèn)題[3]。臍橙酒是以臍橙為原料，保留臍橙的功能成分并增加風(fēng)味，采用商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵而成，發(fā)酵過(guò)程可控、產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定。以臍橙果汁為原料釀造的臍橙果酒，因其低醇、口感清爽及醇厚柔和而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[4]。果酒的研究主要有發(fā)酵工藝研究、香氣成分檢測(cè)等方面，但目前臍橙酒加工使用單一的商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵，存在風(fēng)味寡淡、香氣特征不明顯等問(wèn)題。

非釀酒酵母屬主要包括有孢圓酵母屬（Torulaspora）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、假絲酵母屬（Candida）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichial）等[5]。非釀酒酵母的有益特性引起了研究者們的廣泛關(guān)注，盡管非釀酒酵母發(fā)酵能力低，但卻能對(duì)最終產(chǎn)品的香氣成分起到很大的貢獻(xiàn)[6]。非釀酒酵母具有降低乙醇濃度，影響果酒營(yíng)養(yǎng)成分，改善果酒穩(wěn)定性及澄清度，改變果酒風(fēng)味特征和香氣的作用[7-10]。

當(dāng)前研究熱點(diǎn)是使用非釀酒酵母來(lái)塑造葡萄酒及各類(lèi)果酒的感官特征，非釀酒酵母屬菌株通過(guò)產(chǎn)生所需的代謝物或與釀酒酵母相互作用來(lái)增加酒品的香氣。由于非釀酒酵母對(duì)乙醇的耐受性較差，通常用于與釀酒酵母混合發(fā)酵，增加酒體香氣，同時(shí)實(shí)現(xiàn)完全酒精發(fā)酵[11-12]。劉曉柱等[13]將篩自刺梨酒的葡萄汁有孢漢遜酵母參與混菌發(fā)酵，能夠增加發(fā)酵果酒中揮發(fā)性酸性物質(zhì)，新增了單菌發(fā)酵沒(méi)有的脂肪風(fēng)味。曾朝珍等[14]發(fā)現(xiàn)在異常漢遜酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵時(shí)，能產(chǎn)生比單菌發(fā)酵更多的醇類(lèi)、酯類(lèi)香氣成分的種類(lèi)和含量。戴爾有孢圓酵母對(duì)SO2、乙醇都有一定的耐受性，可以增加乳酸和高級(jí)醇的含量[15]。因此選取商業(yè)戴爾有孢圓酵母戴爾有孢圓酵母PL09與前期實(shí)驗(yàn)室自篩的兩株有孢漢遜酵母屬酵母有孢漢遜酵母DY5、JW14[16]進(jìn)行混菌發(fā)酵研究。

GC-IMS 是一種結(jié)合了氣相色譜法和離子遷移率譜的檢測(cè)技術(shù)[17]。該技術(shù)克服了離子遷移率譜分辨率差的缺點(diǎn)，通過(guò)氣相色譜預(yù)分離后的離子遷移率譜，利用電場(chǎng)中離子遷移率的差異來(lái)分析樣品的組成，具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、操作方便、成本低、分離效率高等特點(diǎn)[18]。近年來(lái)，GC-IMS 聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種食品樣品中揮發(fā)性成分的評(píng)價(jià)[19]。

為了探究不同非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對(duì)臍橙酒品質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)考察混菌發(fā)酵對(duì)臍橙酒的理化指標(biāo)的影響，使用GC-IMS、指紋圖譜結(jié)合主成分分析研究混菌發(fā)酵對(duì)臍橙酒揮發(fā)性香氣成分的影響，并結(jié)合感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，篩選最優(yōu)的混菌發(fā)酵方式，應(yīng)用于高品質(zhì)臍橙酒加工。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

崀豐臍橙 產(chǎn)自邵陽(yáng)市新寧縣；2 株野生有孢漢遜酵母：JW14、DY5 實(shí)驗(yàn)室前期自篩；商業(yè)非釀酒酵母 戴爾有孢圓酵母PL09，丹麥科漢森公司；果酒酵母DV10 法國(guó)LALLEMAND 公司；YPD 液體培養(yǎng)基、YPD 固體培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物公司；福林-酚試劑 美國(guó)Sigma 公司。

血球計(jì)數(shù)板 上海市求精生化試劑儀器有限公司；0-40、40-70、70-100 酒精計(jì) 河北省武強(qiáng)縣華鷗儀器儀表廠；FlavourSpec 風(fēng)味分析儀 山東海能科學(xué)公司；K6302 手動(dòng)錐形榨汁機(jī) 余姚市菲兒浦電器有限公司；ColorQuestXE 型全自動(dòng)色度分析儀美國(guó)HunterLab 公司；Acquity 超高效液相色譜儀美國(guó)Waters 公司；7890A-5975C 型GC-MS 聯(lián)用儀美國(guó)Agilent 公司；PHS-3C 型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份公司；SW-CJ-1B 型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LX-B100 L 型高壓蒸汽滅菌鍋合肥華泰公司；HWS 型恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；UV-1800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；PAL-BX/ACID 手持式糖度儀 日本愛(ài)拓公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 在無(wú)菌條件下，取-80 ℃磁珠保存的有孢漢遜酵母JW14、有孢漢遜酵母DY5 酵母，解凍后在YPD 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)?；罨? 次后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，挑選菌落特征明顯、長(zhǎng)勢(shì)合適的酵母菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，6000 r/min 離心10 min，加無(wú)菌水混合后離心洗滌2 次，收集菌體，4 ℃冷藏備用。商業(yè)酵母果酒酵母DV10、戴爾有孢圓酵母PL09 參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行活化。

1.2.2 臍橙酒發(fā)酵工藝 臍橙清洗后切半榨汁，5000 r/min 離心10 min 后取上清液，添加適量白砂糖至預(yù)設(shè)酒度10%Vol，以H2SO3的形式添加30 mg/kg SO2，分裝入250 mL 發(fā)酵容器滅菌。采取順序發(fā)酵，在分別接入6×107CFU/mL 非釀酒酵母戴爾有孢圓酵母PL09、有孢漢遜酵母DY5 和有孢漢遜酵母JW14 48 h 后，接入1×107CFU/mL 果酒酵母DV10。使用1×107CFU/mL 接種的單釀酒酵母發(fā)酵作為對(duì)照。發(fā)酵溫度為20 ℃，在20 ℃條件下恒溫發(fā)酵，采用CO2失重法監(jiān)測(cè)發(fā)酵狀態(tài)主發(fā)酵結(jié)束后，將酒樣品在4 ℃、3000 r/min 條件下離心10 min 后，取上清液于-30 ℃待測(cè)。

1.2.3 理化指標(biāo)檢測(cè) 澄清度：采用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)680 nm 下的透光率[20]；可溶性固形物含量：采用手持式糖度儀測(cè)定；酒精度：采用酒精計(jì)參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》[21]測(cè)定；色度：采用色差儀測(cè)定[22]；總酸：采用GB/T 12456-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》[23]測(cè)定，以檸檬酸計(jì)；總糖：3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[24-25]；總酚：福林-肖卡法[26-27]測(cè)定。

1.2.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分分析 氣相色譜條件（GC）：0～2 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min；2～20 min：漂移氣150 mL/min，載氣由2 mL/min 提升至100 mL/min；20～50 min：漂移氣l50 mL/min，載氣100 mL/min。

氣相離子遷移譜（IMS）檢測(cè)條件：分析時(shí)間50 min；色譜柱MXT-WAX（30 m，1 μm，0.53 mm）；柱溫：60 ℃；載氣/漂移氣：N2；IMS 溫度：45 ℃；采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為100 μL；孵育時(shí)間：15 min；孵育溫度：60 ℃；進(jìn)樣針溫度：85 ℃；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min。

1.2.5 感官評(píng)價(jià) 臍橙酒由10 名專(zhuān)業(yè)人員組成感官評(píng)定小組進(jìn)行品評(píng)。將樣品（20 mL）倒入酒杯中，并按隨機(jī)順序呈現(xiàn)。在測(cè)試期間提供飲用水沖洗口感。對(duì)色澤（20 分），果香（20 分），酒香（20 分），滋味（20 分）和典型性（20 分）參考文獻(xiàn)[28]制定的感官評(píng)價(jià)表1 進(jìn)行評(píng)定。

表1 臍橙酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The sensory evaluation criteria for navel orange wine

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用分析軟件VOCaly 查看分析譜圖和數(shù)據(jù)的定性，應(yīng)用NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，應(yīng)用Reporter 插件直接對(duì)比樣品間的譜圖差異，應(yīng)用Gallery Plot 插件進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比，應(yīng)用Dynamic PCA 插件進(jìn)行動(dòng)態(tài)主成分分析，SPSS 26.0 對(duì)樣品（n=3）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵臍橙酒理化指標(biāo)分析

由表2 可知，相較于單釀酒酵母發(fā)酵組，非釀酒酵母和釀酒酵母共發(fā)酵組有較高的總酸含量和較好的澄清度。各發(fā)酵組的總酸含量差異顯著（P＜0.05），其中有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 總酸含量最高為9.51 g/L，果酒酵母DV10 總酸含量最低為7.29 g/L。總酚含量差異顯著（P＜0.05），其中有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 總酚含量最高為289.17 mg/L，戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10總酚含量最低為270.17 mg/L。澄清度差異較大，混合發(fā)酵澄清度普遍高于單菌發(fā)酵，其中有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 澄清度顯著高于其他發(fā)酵組（P＜0.05）。pH也存在顯著差異（P＜0.05），其中戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 的pH 值最高為4.19，有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 的pH 值最低為3.99。各發(fā)酵組都具有較低的殘?zhí)橇?，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。此外，除戴爾有孢圓酵母PL09（10.43%vol）參與的混菌發(fā)酵外，其余混菌發(fā)酵中的酒精度與純釀酒酵母發(fā)酵（10.17%vol）的差異不顯著，這可能與戴爾有孢圓酵母比有孢漢遜酵母酵母的產(chǎn)乙醇能力更強(qiáng)有關(guān)[29]。

表2 不同菌種發(fā)酵臍橙酒的理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indexes of navel orange wine fermented by different strains

2.2 臍橙酒揮發(fā)性香氣成分分析

2.2.1 揮發(fā)性化合物氣相離子遷移譜圖分析 使用氣相色譜-離子遷移譜對(duì)不同發(fā)酵組中揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析，得到氣相-離子遷移三維譜圖，如圖1 所示。x 軸表示離子遷移時(shí)間，y 軸表示氣相色譜保持時(shí)間，z 軸表示樣品中各揮發(fā)性組分的峰值強(qiáng)度，從左到右依次為果酒酵母DV10、有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10、有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10、戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10。從圖上可以看出，混菌發(fā)酵與單釀酒酵母發(fā)酵樣品的化合物種類(lèi)存在明顯差異，信號(hào)強(qiáng)度也存在差異，揮發(fā)性化合物峰值強(qiáng)度更大。

圖1 四種臍橙酒樣本的氣相色譜離子遷移譜3D 圖Fig.1 3D Diagram of gas chromatography ion mobility spectrum of four navel orange fruit wine samples

為了更好地區(qū)分不同菌種混合發(fā)酵臍橙酒中存在的揮發(fā)性成分，采用GC-IMS 方法獲取全局IMS信息。GC-IMS 分析得到的二維俯視圖如圖2 所示。x 軸和y 軸分別代表離子相對(duì)漂移時(shí)間和氣相色譜的保留時(shí)間，全圖背景為藍(lán)色，橫坐標(biāo)1.0 處的紅色垂線為RIP 峰，即歸一化處理后的離子反應(yīng)峰。RIP 峰兩側(cè)的每一點(diǎn)都代表一種風(fēng)味物質(zhì)，不同的顏色表示信號(hào)強(qiáng)度，顏色越深表示強(qiáng)度越大，高濃度揮發(fā)物用紅色表示，低濃度揮發(fā)物用白色表示。一種化合物可能產(chǎn)生多個(gè)信號(hào)或點(diǎn)（單體或二聚體），這取決于其濃度、半衰期和性質(zhì)[30]。某些單一化合物由于濃度不同可能產(chǎn)生多種信號(hào)，是由于所分析的離子與中性分子（如二聚體或三聚體）之間形成加合物，在通過(guò)漂移區(qū)時(shí)將觀察到單一化合物的多個(gè)信號(hào)。

圖2 四種臍橙酒樣本的氣相色譜離子遷移譜二維俯視圖Fig.2 GC-IMS 2D topographic of volatile compounds in four navel orange fruit wine samples

樣品中的有機(jī)揮發(fā)性化合物（VOCs）以信號(hào)的形式顯示，揮發(fā)物信號(hào)大多出現(xiàn)在漂移時(shí)間為1.0～2.0 ms 和保留時(shí)間100～2000 s 的區(qū)域，GC-IMS 有效分離了揮發(fā)性化合物的信號(hào)峰，共鑒定出59 種揮發(fā)性化合物。以單一釀酒酵母發(fā)酵臍橙酒為對(duì)照，混菌發(fā)酵組的紅色區(qū)域變大、顏色變深，說(shuō)明相對(duì)于單一釀酒酵母發(fā)酵，混菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的香氣物質(zhì)，也能不同程度使揮發(fā)性化合物含量增加，改善風(fēng)味。三個(gè)不同發(fā)酵組之間信號(hào)強(qiáng)度也有差異，表明參與發(fā)酵的非釀酒酵母品種對(duì)發(fā)酵酒香氣影響較大。

圖3是差異對(duì)比圖，用于比較單一釀酒酵母發(fā)酵臍橙酒和非釀酒酵母混菌發(fā)酵臍橙酒樣品之間的揮發(fā)性成分差異[31]。選擇單一釀酒酵母發(fā)酵的臍橙酒作為參考，其余樣品的光譜扣除參考。其中紅點(diǎn)表示揮發(fā)性成分的含量高于參考值，而藍(lán)點(diǎn)表示揮發(fā)性成分的含量低于參考值。由差異對(duì)比圖可知，一些揮發(fā)性成分的含量因添加非釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵增加，而另一些則降低，這說(shuō)明，臍橙酒的揮發(fā)性指紋在不同非釀酒酵母輔助發(fā)酵的情況下發(fā)生了變化，非釀酒酵母對(duì)臍橙酒的不同揮發(fā)性成分產(chǎn)生了不同程度的影響。正是這些揮發(fā)性成分的動(dòng)態(tài)變化，形成了臍橙酒的風(fēng)味特征。

圖3 四種臍橙酒樣本的氣相色譜離子遷移譜差異圖Fig.3 GC-IMS difference diagram of four navel orange fruit wine samples

2.2.2 揮發(fā)性化合物定性分析 利用GC-IMS 中漂移時(shí)間和保留指數(shù)進(jìn)行定性分析，結(jié)果如表3 所示，從譜庫(kù)中共鑒定出59 種揮發(fā)性化合物（不含二聚體和三聚體為49 種），通過(guò)名稱(chēng)、保留指數(shù)、保留時(shí)間和遷移時(shí)間對(duì)化合物進(jìn)行描述?；衔锩Q(chēng)后的M 表示其為物質(zhì)的單體，D 表示其為二聚體，T 表示其為三聚體。結(jié)果顯示，臍橙酒中揮發(fā)性化合物有11 種醇類(lèi)、7 種醛類(lèi)、1 種萜烯類(lèi)、25 種酯類(lèi)、10 種酮類(lèi)、1 種醚類(lèi)和4 種酸類(lèi)。含有單體和二聚體的物質(zhì)有4 種，分別是：乙酸丙酯、2-甲基-1-丙醇、1-戊烯-3-醇和丙醛。含有單體、二聚體和三聚體的物質(zhì)有8 種，分別是：丙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、3-羥基-2-丁酮和丙酸。

表3 不同酵母混合發(fā)酵臍橙酒揮發(fā)性成分定性結(jié)果Table 3 Qualitative results of volatile components in navel orange wine fermented by different yeasts

酯是基于GC-IMS 檢測(cè)測(cè)出臍橙酒中的第一大類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共25 種，其中有5 種二聚體和4 種三聚體。酯類(lèi)是水果香氣的主要來(lái)源，果酒中酯類(lèi)物質(zhì)的組成及其含量可以調(diào)整產(chǎn)品的香氣類(lèi)型與風(fēng)格。測(cè)得的乙酸己酯會(huì)帶來(lái)水果香味和花香味，氣味甜美，能對(duì)酒的香氣貢獻(xiàn)強(qiáng)烈的果香。其他成分中，辛酸乙酯可以提供果味，癸酸乙酯能提供新鮮的果香香氣和類(lèi)白蘭地的酒香香氣，乙酸異戊酯具有強(qiáng)烈的類(lèi)香蕉味的水果香氣[32]。

醇是基于GC-IMS 檢測(cè)測(cè)出的臍橙酒中的第二類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共11 種，其中有3 種二聚體和2 種三聚體。醇類(lèi)組分是果酒中重要的揮發(fā)性物質(zhì)，主要來(lái)自果酒發(fā)酵過(guò)程，可賦予酒特殊的香氣，其中3-甲基-1-丁醇能為果酒提供愉悅的植物香氣。

酮是基于GC-IMS 檢測(cè)測(cè)出臍橙酒中的第三大類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共10 種，其中有1 種二聚體和1 種三聚體。酮類(lèi)呈現(xiàn)出奶油、甜味和果味的香氣[33]。2-丁酮給臍橙酒帶來(lái)一定的青辣風(fēng)味[30]。

醛是基于GC-IMS 檢測(cè)測(cè)出臍橙酒中的第四類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共7 種，其中有1 種二聚體。樣品中有較為豐富的己醛，己醛能夠?yàn)槟毘染茙?lái)甜香和青草香味，3-甲基丁醛可帶來(lái)桃子香味、果香味和堅(jiān)果味[34]。

2.2.3 揮發(fā)性化合物指紋圖譜分析 二維指紋圖譜能全面、直觀的分析四種臍橙酒揮發(fā)性物質(zhì)組成的差異。圖4 中橫行為各不同揮發(fā)性物質(zhì)，縱列為對(duì)應(yīng)揮發(fā)性化合物在不同發(fā)酵酒中的含量差異。圖4中的每一行顯示了一個(gè)臍橙酒樣品的整個(gè)信號(hào)峰，每一列顯示了相同化合物在不同葡萄樣品中的信號(hào)強(qiáng)度，顏色由白色到紅色表示濃度由低到高，代表相對(duì)含量的高低。一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是某些化合物會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)峰信號(hào)，這是由化合物的單體（M）和二聚體（D）形式引起的[34]。

圖4 不同發(fā)酵組中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of volatile compounds in different fermentation groups

以釀酒酵母單菌發(fā)酵對(duì)照樣品譜圖為背景參照，三種添加非釀酒酵母菌株發(fā)酵樣品譜圖中均出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，即與釀酒酵母單菌發(fā)酵對(duì)照樣品相比，三種添加非釀酒酵母菌株發(fā)酵樣品均存在一些揮發(fā)性物質(zhì)減少，在有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10、有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10、戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 樣本譜圖中出現(xiàn)的明顯的紅色斑點(diǎn)說(shuō)明與單菌發(fā)酵對(duì)照樣品相比，這三種添加非釀酒酵母菌株發(fā)酵樣品中新生成了一些揮發(fā)性物質(zhì)，樣品間差異顯著。

從圖4 中可以看出，有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 和有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10發(fā)酵酒中斑點(diǎn)分布較為相似、但存在顏色深淺的變化，表明這兩種發(fā)酵酒的香氣種類(lèi)較為相似，含量有差異。相較于單菌發(fā)酵樣品，非釀酒酵母混菌發(fā)酵樣品生成了新的揮發(fā)性成分，有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 和有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 樣品中有3-羥基-2-丁酮（奶油香味）、辛醇（強(qiáng)烈的油脂氣味和柑橘氣息）、1-戊烯-3-醇（果香、蔬菜香以及辣根的氣味）和4-甲基-2-戊酮（芳香酮?dú)馕叮┻@些獨(dú)特的香氣成分，戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 樣品獨(dú)有3-甲基丁醛（香甜的水果氣味）。戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 的3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、1-戊烯-3-酮、異丁酸乙酯等相對(duì)含量高于另外三種樣本，3-甲基-1-丁醇能賦予酒品蘋(píng)果和柑橘香，異丁酸乙酯也帶有桑葚、蘋(píng)果香氣，因此果香較為突出。但其乙酸異戊酯（略帶香蕉香氣）、乙酸甲酯（蜂蜜香）、正丙醇、環(huán)己酮、二甲基硫醚和丙醛等均低于其他發(fā)酵組，甜香稍顯不足。有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10、有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 的醛酮類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)含量相對(duì)較高，尤其是3-羥基-2-丁酮，4-甲基戊烷-2-酮、丁醛、戊醛、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異丁酯，乙酸丙酯、己酸丙酯等，使酒樣有更明顯的令人愉快的奶油香味、菠蘿香等柔和的果香，以及微帶果香的酒香。1-戊烯-3-醇、2-甲基-1-丙醇、2-戊酮、3-甲基丁醛、己醛、丁酸丙酯等則在有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 中含量較高，但有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 中醋酸含量較高，容易使酒樣過(guò)酸，影響風(fēng)味的協(xié)調(diào)性。

2.3 揮發(fā)性化合物的主成分分析

PCA 是一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，它使用多個(gè)變量（如揮發(fā)性化合物的信號(hào)強(qiáng)度）進(jìn)行線性變換，以選擇幾個(gè)顯著變量并突出它們?cè)跇颖局g的差異，具有評(píng)估樣本之間的規(guī)律性和差異性的能力[35-36]。為研究不同臍橙酒香氣特征的區(qū)別，本文應(yīng)用主成分分析對(duì)揮發(fā)性化合物含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示。前兩個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率之和為87.2%，其中PC1為52.6%，PC2 為34.6%?；诟靼l(fā)酵組揮發(fā)性化合物含量的差異，PCA 將4 組樣品進(jìn)行了有效分離，可以看出釀酒酵母果酒酵母DV10 單菌發(fā)酵與其他混菌發(fā)酵組位于不同象限，且距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明混菌發(fā)酵與單菌發(fā)酵對(duì)香氣有較大差異，有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 與有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 距離較近，差異較小，但二者與戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 距離較遠(yuǎn)，差異較大，與GC-IMS 的結(jié)果較為相似。出現(xiàn)這種差異的原因可能是有孢漢遜酵母DY5、有孢漢遜酵母JW14 菌株均為有孢漢遜酵母屬，而戴爾有孢圓酵母PL09 為戴爾有孢圓酵母，產(chǎn)生這種差異的原因可能是不同非釀酒酵母菌種對(duì)發(fā)酵酒揮發(fā)性香氣成分影響較大。

圖5 不同發(fā)酵組的主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis of different fermentation groups

2.4 感官評(píng)價(jià)

從圖6 可知，果酒酵母DV10 發(fā)酵樣品的香氣評(píng)分較其他混菌發(fā)酵樣品明顯更低，香氣較為寡淡，與其揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量較低相符?；炀l(fā)酵組香氣較為濃郁，且各菌種之間差異較大。戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 發(fā)酵所得的酒香果香味較為濃郁，但酒香不明顯。這與戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 中能賦予酒品果香的3-甲基-1-丁醇、異丁酸乙酯、4-甲基-1-戊醇、1-戊烯-3-酮等物質(zhì)含量高于另外三種樣本有關(guān)。有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 發(fā)酵的臍橙酒有最濃郁的果香和酒香，醇香怡人，整體香氣評(píng)分排名第一，這與有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 醛酮類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì)含量較高有關(guān)，能賦予酒樣更明顯的微帶果香的酒香。有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 的酒香與有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 較為接近，但香氣強(qiáng)度稍差。同時(shí)，有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10酒樣微酸，風(fēng)味的協(xié)調(diào)性稍差，這與其醋酸含量較高有關(guān)。果酒酵母DV10 發(fā)酵的酒品略帶柑橘的酸澀味，評(píng)分低于其他混菌發(fā)酵組，有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 酒體豐滿醇厚，滋味最佳。各樣品色澤橙黃、外觀怡人。綜合理化指標(biāo)與揮發(fā)性香氣成分評(píng)價(jià)，有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 釀造的臍橙酒澄清透亮、滋味清爽、香氣濃郁、皆具柑橘果香和發(fā)酵酒香，整體感官品質(zhì)較優(yōu)。

圖6 臍橙酒感官品評(píng)結(jié)果Fig.6 Sensory evaluation results of navel orange wine

3 結(jié)論

混菌發(fā)酵對(duì)臍橙酒風(fēng)味產(chǎn)生較大影響，相較于釀酒酵母單菌發(fā)酵，醇類(lèi)物質(zhì)含量較高。不同的非釀酒酵母參與混菌發(fā)酵對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)也有不同影響。戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 樣品中，有較高含量的3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇、1-戊烯-3-酮和異丁酸乙酯等物質(zhì)，賦予酒樣溫和的水果香氣。有孢漢遜酵母屬的有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 和有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10樣品較為相似，有較高含量的3-羥基-2-丁酮，4-甲基戊烷-2-酮、丁醛、戊醛、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異丁酯，乙酸丙酯和己酸丙酯含量，賦予其柔和的微帶果香的酒香，且相較單菌發(fā)酵樣品產(chǎn)生了更多的醇類(lèi)和酮類(lèi)香氣成分。PCA 結(jié)果說(shuō)明有孢漢遜酵母DY5+果酒酵母DV10 與有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 發(fā)酵樣品差異較小，但二者與戴爾有孢圓酵母PL09+果酒酵母DV10 樣品差異較大，造成這種差異的可能原因是有孢漢遜酵母DY5、有孢漢遜酵母JW14 菌株為有孢漢遜酵母屬，而戴爾有孢圓酵母PL09 為戴爾有孢圓酵母，不同非釀酒酵母菌種對(duì)發(fā)酵酒揮發(fā)性香氣成分影響較大。感官分析表明有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 發(fā)酵的臍橙酒果香和酒香最濃郁，醇香怡人，整體香氣評(píng)分排名第一。綜合理化指標(biāo)、揮發(fā)性香氣成分和感官評(píng)價(jià)，有孢漢遜酵母JW14+果酒酵母DV10 釀造的臍橙酒整體較優(yōu)，風(fēng)味更復(fù)雜，有望在臍橙酒工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。