王 珂，姚 婷，張 燕，何欣萌，王友升,

（1.北京工商大學，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.山東凱普菲特生物科技有限公司，日照華偉大健康產(chǎn)業(yè)研究院，山東日照 276801）

杏（Prunus armeniacaL.）為薔薇科、李屬植物，果實多汁肉厚，酸甜可口，營養(yǎng)價值豐富。杏果實中含有多種維生素、礦質(zhì)元素以及豐富的β-胡蘿卜素、黃酮醇、黃烷醇、總酚和三萜酸等物質(zhì)，尤其是胡蘿卜素的含量高于其他水果，具有較高的抗氧化活性以及防癌、抗癌功效[1-2]。但杏果實時令性較強，采后果實易軟化，不耐貯藏、運輸困難。杏果實水分、糖分含量高，果皮薄易受到器械損傷，導致病原菌侵染而容易發(fā)生腐爛變質(zhì)，發(fā)病率高達50%，造成嚴重的經(jīng)濟損失，限制了杏果實產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]，因此，造成杏果實貯藏期間發(fā)病的病原菌種類是亟需研究的問題。

杏果實采后侵染性病害主要是由細菌和真菌引起，其中鏈格孢屬真菌引起的黑斑病，青霉屬引起的青霉病以及根霉屬引起的軟腐病報道較多[4-5]。有研究從采后貯藏的杏果實中分離得到鏈格孢菌，并對其碳源代謝指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)分離到的鏈格孢菌可以利用的碳源在88 種以上，表明其對碳源適應(yīng)性較強，這可能是鏈格孢菌侵染范圍廣的原因[6]；韓盛等[7]發(fā)現(xiàn)黑根霉、灰葡萄孢霉、鏈格孢霉、青霉和粉紅聚端孢霉為杏采后病害主要病原菌；程元等[8]在杏果實病斑處分離獲得嗜果門座孢菌；也有研究者從自然發(fā)病的杏果實中分離得到交孢鏈格孢、匍枝根霉和皮落青霉三種病原真菌[9]。此外，Wu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌可導致杏果實腐爛。目前，關(guān)于杏果實采后病害的防治措施主要針對鏈格孢屬、根霉屬、青霉屬和曲霉屬真菌[11-13]，進一步明確杏果實采后病害的病原種類，可為篩選杏采后病害的有效防治措施提供理論基礎(chǔ)。

真菌rDNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）具有一定的保守性，種間差異明顯，通過PCR 技術(shù)擴增真菌ITS 區(qū)目的片段進行序列分析，可有效地將真菌進行分類鑒定[14]。有研究從產(chǎn)生根腐病的人參中分離得到8 株病菌真菌，通過PCR 擴增鑒定其種屬水平[15]，Solairaj 等[16]對采后腐爛葡萄進行病原真菌分離，通過形態(tài)學觀察結(jié)合PCR 擴增的方法鑒定出7 株葡萄采后病原真菌，因此，基于PCR 擴增真菌ITS 區(qū)進行序列分析廣泛應(yīng)用于果蔬采后致病病原真菌的鑒定[17-18]。本研究擬從采后自然發(fā)病的‘金太陽杏’和‘胭脂杏’兩個品種的杏果實上分離得到絲狀病原真菌，通過形態(tài)學特征和真菌rDNA ITS 區(qū)序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對杏果實的致病病原真菌進行鑒定，以發(fā)現(xiàn)更多引起杏果實采后侵染性病害的病原真菌種類，為杏果實的病害研究及開展有效的生物防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金太陽杏、胭脂杏果實 來源于北京新發(fā)地批發(fā)市場，產(chǎn)地為陜西省，采收期為6 月。選擇在室溫下貯藏至發(fā)病的果實進行研究；DNA 分子質(zhì)量標準2×Taq PCR Master Mix、Marker Ⅶ 天根生化試劑公司；通用引物ITS-4、ITS-5 Invitrogen 公司；氫氧化鈉（NaOH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、十二烷基磺酸鈉（SDS） Amersco公司；乙醇、鹽酸 分析純，北京化工廠；瓊脂粉 分析純，Biottopped 公司；葡萄糖 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；麥芽浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：稱取削皮后的馬鈴薯200 g，切片煮沸30 min 后，過濾取汁，加入瓊脂粉18 g、葡萄糖20 g，加水補足至1 L，121 ℃滅菌20 min；麥芽浸粉培養(yǎng)基（ME）：麥芽浸粉20 g、瓊脂粉18 g，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至5.5±0.2，加水補足至1 L，121 ℃滅菌20 min。

Forma ClassⅡA2 生物安全柜 美國Thermo公司；Axio Image A1 顯微鏡 德國Zeiss 公司；MG96+PCR 儀 杭州朗基科學儀器有限公司；CJ100 凈化試驗臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；MJX-250Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離、純化與回接 分離：取杏果實的發(fā)病部位和健康交界處組織（5 mm×5 mm）于PDA 固體培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)1～3 d。純化：將分離菌邊緣菌塊，分別三點轉(zhuǎn)接到PDA 和ME 固體培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)14 d，觀察7 d 和14 d菌落形態(tài)特征。回接：挑選健康無損傷的杏果實，用體積分數(shù)為75%的乙醇進行表面消毒，無菌接種針刺孔，將純化后的菌塊回接到相應(yīng)品種杏果實傷口處，觀察果實接種處是否出現(xiàn)與分離果實相同病癥，并從該病害部位再次分離病原菌，比較分離到的病原菌與接種病原菌的菌落形態(tài)[19]。

1.2.2 菌落形態(tài)學觀察 PDA 培養(yǎng)基上的菌落經(jīng)純化后，取菌落外沿菌塊，分別三點轉(zhuǎn)接到PDA 和ME 培養(yǎng)基平板上，于25 ℃條件下培養(yǎng)14 d，觀察菌落形態(tài)。采用乳酸石炭酸棉藍染色液法，置于顯微鏡下觀察菌落產(chǎn)生分生孢子及分生孢子梗的形狀、色澤和分生孢子隔膜等性狀[20-21]。

1.2.3 基因組DNA 的提取及ITS 區(qū)序列分析 采用改良后十二烷基硫酸鈉-氯化芐法提取待鑒定菌株總DNA[18]。將菌體用液氮研磨至粉狀，取0.1 g 菌粉加入500 μL 氯化芐提取液（100 mmol/L Tris-HCl，pH9.0；40 mmol/L EDTA，pH8.0），充分振蕩混合后，加入100 μL SDS（10%）和300 μL 氯化芐提取液，劇烈振蕩，50 ℃下保溫1 h 后，12000 r/min，4 ℃離心10 min 棄上清。加入300 μL NaAc（3 mol/L，pH5.2）混勻，冰浴15 min，12000 r/min，4 ℃離心10 min 收集上清液。加入等體積300 μL 無水乙醇室溫沉淀20 min，12000 r/min，4 ℃離心10 min，沉淀用70%乙醇清洗一次，揮發(fā)后加入30 μL TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA。

以真菌rDNA ITS 區(qū)通用引物ITS-4（5’-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS-5（5’-GGAAGT AAAAGTCGTAACAAGG-3’）為PCR 擴增引物。PCR體系：10 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.8 μL ITS-4，0.8 μL ITS-5，0.5 μL DNA 模板和7.9 μL ddH2O；PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸5 min，35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司華大基因進行脫鹽、純化和雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源序列比對（blast），并且用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與回接結(jié)果分析

如圖1 所示，從采后貯藏自然發(fā)病的杏果實發(fā)病部位進行取樣，在‘金太陽杏’果實上分離得到絲狀真菌325#、327#、328#（圖1 a1～c1），在‘胭脂杏’果實上分離得到326#、331#病原菌（圖1 d1～e1），將分離到的病原菌回接到健康無傷的相應(yīng)品種杏果實上，導致杏果實發(fā)病的病斑特征如圖1 a2～e2，在接種部位均出現(xiàn)同樣的病癥，并能從該病害部位再次分離得到相應(yīng)病原菌，因此，上述5 株絲狀真菌確定是杏果實致病菌。

圖1 5 株病原菌分離與回接病癥Fig.1 Symptoms of isolated fruits and reinululated fruits of five pathogenic fungi

2.2 病原菌的形態(tài)觀察結(jié)果

將分離到的5 株絲狀病原真菌，經(jīng)純化后分別三點轉(zhuǎn)接至PDA 和ME 固體培養(yǎng)基上，并于25 ℃條件下培養(yǎng)14 d，菌落形態(tài)如圖2。圖2 結(jié)果顯示，菌株325#在PDA 培養(yǎng)基和ME 培養(yǎng)基上均生長旺盛，菌落質(zhì)地致密，培養(yǎng)7 d 后，菌落在PDA 培養(yǎng)基上覆蓋整個平板，菌絲呈白色（圖2 a1），14 d 后菌落顏色加深（圖2 a2）；在ME 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 菌絲呈淺黃褐色，具邊緣不整齊的輪紋（圖2 a3），14 d 后菌落顏色不均，白色小點增多（圖2 a4）。顯微觀察可以看到，325#在PDA 培養(yǎng)基上未產(chǎn)孢（圖3 a1），菌絲著色較淺、分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯 （圖3 a2）。

圖2 5 株病原菌在PDA 和ME 培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)7 d 和14 d 的菌落特征（1 cm）Fig.2 Colony characteristics of five pathogenic fungi cultured on PDA and ME plates for 7 d and 14 d at 25 ℃ (1 cm)

圖3 5 株病原菌在PDA 培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)14 d 的顯微形態(tài)觀察結(jié)果（10 μm）Fig.3 Result of morphological characteristics of five pathogenic fungi cultured on PDA plate for 14 d at 25 ℃ (10 μm)

菌株327#在PDA 和ME 培養(yǎng)基上長勢相近，菌落形態(tài)較大，在PDA 平板培養(yǎng)7 d 時，菌絲呈灰綠色，菌絲質(zhì)地緊密（圖2 b1），14 d 后菌落顏色變?yōu)樯詈稚?（圖2 b2）；在ME 平板培養(yǎng)7 d 時，與PDA 板形態(tài)類似（圖2 b3），培養(yǎng)至14 d，菌落顏色變?yōu)榛液稚?（圖2 b4）。菌株327#表面粗糙（圖3 b1），菌絲著色較深，分枝少且內(nèi)部隔膜觀察明顯（圖3 b2），分生孢子單孢，呈灰褐色。

菌株328#在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 時，菌落已覆蓋整個平板，質(zhì)地松散且菌絲較長，外觀干燥，菌絲呈黃褐色，菌絲上密布黑色孢子（圖2 c1），培養(yǎng)14 d后菌落外觀無明顯變化，菌絲顏色均加深（圖2 c2）；在ME 平板上形態(tài)與PDA 平板相似，生長旺盛，培養(yǎng)7 d 后產(chǎn)生黑色孢子，14 d 后菌絲顏色加深（圖2 c3）和（圖2 c4）。菌株328#孢子梗頂端膨大形成頂囊，分生孢子卵圓形，密生于頂囊之上，表面干燥，常具黑色花紋（圖3 c1），菌絲著色較淺，具隔或不具隔（圖3 c2）。

菌株326#生長速度較快，PDA 平板培養(yǎng)7 d，菌絲呈白色，質(zhì)地松散、成簇生長（圖2 d1），14 d 后菌落仍呈白色，菌絲無明顯變化（圖2 d2）；培養(yǎng)7 d 時，ME 板上菌絲較PDA 板稀疏，呈白色，繼續(xù)培養(yǎng)至14 d，菌落顏色和菌絲無明顯變化（圖2 d3）和（圖2 d4）。通過顯微觀察，326#未產(chǎn)生孢子，菌絲著色較淺，分枝多且內(nèi)部隔膜觀察明顯（圖3 d1）和（圖3 d2）。

菌株331#在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d 時，菌落已覆蓋平板，菌絲呈現(xiàn)淺灰褐色，質(zhì)地緊密，外觀干燥（圖2 e1），培養(yǎng)至14 d，菌落顏色加深，形成菌球（圖2 e2）；在ME 培養(yǎng)基上，7 d 時覆蓋平板，菌絲呈現(xiàn)灰褐色（圖2 e3），14 d 后，菌落顏色加深，ME 板相對于PDA 板形成菌球較多 （圖2 e4），其顯微形態(tài)與菌株326#相似。

參考《真菌鑒定手冊》對相關(guān)菌株的菌落及形態(tài)描述[20]，菌株325#為間座殼屬真菌，327#為葡萄座腔屬真菌，328#為短柄霉屬真菌，326#和331#為葡萄孢屬真菌。

2.3 ITS 區(qū)序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

采用SDS-氯化芐方法提取總DNA，以基因組DNA 為模板，ITS-4 和ITS-5 為引物，經(jīng)PCR 擴增得到ITS 區(qū)目的片段，PCR 產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖4，電泳條帶清晰。圖4 結(jié)果表明，325#菌株（圖4a）、327#菌株（圖4b）、328#菌株（圖4c）、326#菌株（圖4d）和331#菌株（圖4e）目的條帶均在600 bp 左右。

圖4 5 株病原真菌的ITS 區(qū)rDNA 電泳檢測圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of ITS rDNA sequence of five pathogenic fungi

將5 株杏果實病原真菌的rDNA ITS 測序結(jié)果在網(wǎng)站NCBI 上進行比對，進行同源性分析并且構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，如圖5 所示，5 株菌分別屬于4 個不同的屬。由圖5 結(jié)果可知，菌株325#與甜櫻間座殼菌（Diaporthe eres）在同一分枝上，親緣距離小于0.01，該結(jié)果置信度達100%（圖5a）。菌株327#與葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）在同一分枝上，親緣距離小于0.02，置信度達95%（圖5b）。菌株328#與出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）在同一分枝上，親緣距離小于0.05，置信度達100%（圖5c）。菌株326#與331#經(jīng)比對均為葡萄孢屬，菌株326#與橢圓葡萄孢（Botrytis elliptica）在同一分枝上，親緣距離小于0.05，置信度達100%（圖5d），菌株331#與灰葡萄孢（Botrytis cinerea）在同一分枝上，親緣距離為零，置信度達97%（圖5d）。因此，分離得到的5 株杏果實病原真菌經(jīng)ITS 區(qū)鑒定：325#為甜櫻間座殼菌（D.eres）、327#為葡萄座腔菌（B. dothidea）、328#為出芽短梗霉（A. pullulans）、326#為橢圓葡萄孢（B. elliptica）以及331#為灰葡萄孢（B. cinerea）。

圖5 以rDNA ITS 序列為分子標記的5 株杏果實病原真菌系統(tǒng)進化樹Fig.5 Position of five fungi pathogenic fungi in the apricot fruit based on ITS rDNA sequence in phylogenetic tree

3 討論

杏果實屬于呼吸躍變型果實，采收期多為高溫季節(jié)，易受微生物侵染而腐爛變質(zhì)，據(jù)報道，引起杏果實采后病害的病原菌主要涉及到鏈格孢屬、青霉屬、根霉屬以及葡萄孢屬病原真菌等。本研究分離到1 株間座殼屬真菌，該屬真菌分布廣泛，能夠引起植物發(fā)生莖潰瘍病、枝枯病、果實腐爛、葉斑病以及葉片壞死等多種植物病害[22]。研究發(fā)現(xiàn)，甜櫻間座殼菌（D. eres）可導致蘋果[23]、黃桃[24]、梨[25]和葡萄腐爛[26]以及獼猴桃黑斑病[27]，有研究從產(chǎn)生芽枯癥狀的藍莓枝條分離得到甜櫻間座殼菌（LNSY003：D.eres）[28]。本文從自然發(fā)病的“金太陽”杏果實上分離得到了一株甜櫻間座殼菌（D. eres），但目前在杏果實采后貯藏過程中未見該菌引起病害的報道，為該菌的生物學特性及對不同果實侵染機制的研究提供新思路。

葡萄座腔菌（B. dothidea）是葡萄座腔屬中常見的種類，能夠侵染多種果實，引起果實腐爛。有研究者發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌（B. dothidea）是梨輪紋病與干腐病的常見病菌真菌[29]，可導致芒果和獼猴桃采后病害的發(fā)生[30-31]，也有研究從產(chǎn)生采后病害的桃果實中分離得到了葡萄座腔菌（030：B. dothidea）[32]。本研究分離得到1 株葡萄座腔菌（B. dothidea）可導致杏果實采后病害的發(fā)生，目前未見該菌侵染杏果實的報道。短柄霉屬病原菌也可引起果實采后病害，姚婷等[33]從采后自然發(fā)病的棗果實上分離得到1 株產(chǎn)酶短梗霉（230#：Aureobasidium proteae），導致棗果實采后發(fā)病。本研究分離得到的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）有導致葡萄和棗果實腐爛的報道[34-35]，但未見有該菌引起杏果實采后病害的報道。

此外，本研究在采后貯藏期間自然發(fā)病的胭脂杏果實上分離到了兩株葡萄孢屬真菌。據(jù)報道，橢圓葡萄孢（Botrytis elliptica）是百合的主要致病菌[36]，也可引起桃和藍莓采后病害[19,37]，而由橢圓葡萄孢（Botrytis elliptica）引起的杏果實采后病害未見有文獻報道。灰葡萄孢菌是目前報道較多的葡萄孢屬真菌，是果蔬采后貯藏期間常見的致病病原真菌，導致葡萄[17]、草莓和櫻桃[37]等果實灰霉病的發(fā)生，也有在伊犁李光杏果實上發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌病原菌，但未見有侵染胭脂杏果實的報道。葡萄孢屬真菌寄主范圍廣、防治困難，本研究在‘胭脂杏’果實上分離到的兩株葡萄孢屬真菌，為該屬真菌對宿主營養(yǎng)物質(zhì)的需求及病害防治研究提供參考。

4 結(jié)論

從采后貯藏期間的‘金太陽杏’分離得到三株病原真菌（325#、327#和328#），從‘胭脂杏’果實上分離得到兩株病原真菌（326#和331#），結(jié)合形態(tài)學特征及ITS 區(qū)序列分析鑒定325#為甜櫻間座殼菌（D.eres）、327#為葡萄座腔菌（B. dothidea）、328#為出芽短梗霉（A. pullulans）、326#為橢圓葡萄孢（B. elliptica）以及331#為灰葡萄孢（B. cinerea）。D. eres、B.dothidea、A. pullulans以及B. elliptica均未有侵染杏果實導致其產(chǎn)生采后病害的報道，此外，未有B.cinerea導致‘胭脂杏’果實采后病害的報道，因此，本文在產(chǎn)生采后侵染性病害的‘金太陽杏’和‘胭脂杏’果實上發(fā)現(xiàn)了未見報道的5 株絲狀病原真菌，豐富了杏果實采后病原真菌的種類，為杏果實保鮮靶標菌的選擇、篩選杏果實采后病害的廣譜抑菌劑以及開展有效的生物防治工作提供參考。