龍樹(shù)瑺，葛東穎，蔡文超，劉忠軍，宋子赟，郭千璋，郭 壯,

（1.湖北文理學(xué)院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽(yáng) 441053；2.襄陽(yáng)市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北襄陽(yáng) 441053；3.清香型白酒生物技術(shù)襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽(yáng) 441053；4.山西老雄山酒業(yè)有限公司，山西長(zhǎng)治 047100）

由于釀造時(shí)使用的酒曲類型不同，清香型白酒通常分為大曲清香、小曲清香和麩曲清香，其中大曲清香型白酒選用以大麥和豌豆制成的大曲為糖化發(fā)酵劑，在3 類酒曲釀造的白酒中具有最佳的品質(zhì)[1]。清香型大曲蘊(yùn)含豐富的微生物類群和酶系，在白酒釀造過(guò)程中提供了酒體風(fēng)味和風(fēng)味的前體物質(zhì)[2]，大曲品質(zhì)好壞對(duì)酒體的優(yōu)劣具有較大影響，因而具有“曲乃酒之骨”的說(shuō)法，如何提升清香型大曲的品質(zhì)是釀酒行業(yè)科研人員比較關(guān)心的問(wèn)題。具有豐富經(jīng)驗(yàn)的科研人員，通常從外觀、斷面、曲皮厚和曲香等維度對(duì)大曲進(jìn)行感官鑒評(píng)[3]，結(jié)合大曲液化力、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酒化力的理化分析結(jié)果，對(duì)大曲品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[4]。清香型大曲的微生物類群亦與其品質(zhì)存在較大的關(guān)聯(lián)性，Hou 等[5]研究發(fā)現(xiàn)清香型大曲中糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）與糖化力呈顯著負(fù)相關(guān)，而黃單胞菌屬（Xanthomonas）與發(fā)酵力和酯化力呈顯著正相關(guān)，可見(jiàn)解析不同微生物與理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性對(duì)提升清香型大曲的品質(zhì)具有一定積極作用。

Illumina Miseq 測(cè)序技術(shù)在清香型大曲細(xì)菌類群的解析中被廣泛地應(yīng)用[6]。周森等[7]對(duì)北京、山西、臺(tái)灣、黑龍江和河北等地的清香型大曲微生物類群進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)出產(chǎn)的大曲中乳酸菌和芽孢桿菌數(shù)量之間存在較大差異且不具有規(guī)律性，因而對(duì)不同地區(qū)清香型大曲中特有微生物類群進(jìn)行解析和甄別，對(duì)于清香型白酒品質(zhì)的提升具有積極的作用。清香型白酒以汾酒為代表，長(zhǎng)治市有許多企業(yè)從事清香型大曲和白酒的制作和釀造，然而目前關(guān)于長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲理化特性與細(xì)菌類群關(guān)聯(lián)性研究的報(bào)道尚少。

本研究對(duì)山西長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲的理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，采用Illumina Miseq 測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌類群進(jìn)行解析，在此基礎(chǔ)上揭示清香型大曲理化指標(biāo)與細(xì)菌類群的相關(guān)性，為清香型大曲微生物類群的解析和品質(zhì)提升提供數(shù)據(jù)支持和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清香型大曲 采集于山西省長(zhǎng)治市長(zhǎng)治縣（東經(jīng)113°02′19′′～113°09′51′，北緯35°52′45′～35°57′00′′之間），隨機(jī)采取同一批次生產(chǎn)的11 個(gè)樣品，記為L(zhǎng)XS1～LXS11。樣品采集時(shí)所有的大曲均在庫(kù)房?jī)?chǔ)藏了3 個(gè)月左右，以大麥和豌豆為原料制作而成，屬于青茬清香型大曲，制曲溫度為40～50 ℃；PCA 培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；引物338F/806R 武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；Illumina MiSeq 測(cè)序配套試劑 美國(guó)Illumina 公司。

K9860 全自動(dòng)凱氏定氮儀 中國(guó)海能公司；HE53 型水分測(cè)定儀 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；VSA 動(dòng)態(tài)水蒸汽吸附分析儀 美國(guó)AquaLAB 公司；MiSeq PE250 高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司；R930 機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 清香型大曲理化指標(biāo)的檢測(cè) 清香型大曲的酸度、氨基酸態(tài)氮、灰分、水分、淀粉、液化力、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酒化力均參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)含量參照GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定；水分活度采用水分活度儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 清香型大曲細(xì)菌Illumina MiSeq 測(cè)序 使用試劑盒提取清香型大曲中微生物的基因組DNA[8]，以338F/806R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[9]，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成高通量測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 去除返回序列中的核苷酸標(biāo)簽與引物，參照王玉榮等[10]的方法對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，使用QIIME（V1.9.1）分析平臺(tái)[11]進(jìn)行PyNAST校準(zhǔn)并對(duì)齊序列[12]，根據(jù)97%相似度進(jìn)行分類操作單元（Operational taxonomic units，OTU）的劃分[13]。使用ChimeraSlayer 檢查剔除含嵌合體的OTU[14]，通過(guò)與Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)明確各分類學(xué)地位[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Graph Pad Prism9 軟件繪制樣品各理化指標(biāo)的小提琴圖；使用R 軟件（v4.1.2）的“reshape2”和“ggplot2”包繪制氣泡圖、“UpSetR”包繪制Upset 圖和“waterfall”包繪制瀑布圖；使用Cytoscape 軟件（v3.7.2）繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲理化指標(biāo)分析

大曲理化性質(zhì)可以反映自身的屬性和發(fā)酵特性。本研究采用理化分析方法，對(duì)長(zhǎng)治地區(qū)11 個(gè)清香型大曲樣品的水分活度、酸度、氨基酸態(tài)氮、灰分、水分、蛋白質(zhì)和淀粉的含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 清香型大曲的理化指標(biāo)Fig.1 Physicochemical indexes of fen-flavor Daqu

由圖1 可知，11 個(gè)清香型大曲水分活度的范圍為0.561～0.690，變異系數(shù)為8.29%；酸度的范圍在0.4～0.7 mmol/10 g，變異系數(shù)為13.09%；氨基酸態(tài)氮的含量范圍為2.46～4.40 g/kg，變異系數(shù)為17.58%；灰分的含量范圍為2.91%～3.19%，變異系數(shù)為2.54%；水分的含量范圍為9.4%～12.3%，變異系數(shù)為8.83%；蛋白質(zhì)的含量范圍為15.601%～18.107%，變異系數(shù)為4.78%；淀粉的含量范圍為51.5%～54.1%，變異系數(shù)為1.60%。由于氨基酸態(tài)氮的變異系數(shù)大于15%，表明納入本研究的11 個(gè)清香型大曲在氨基酸態(tài)氮上存在較大的差異。氨基酸態(tài)氮是大曲生香力的重要指標(biāo)，Zhao 等[16]的研究表明，Bacillus是參與白酒發(fā)酵的主要功能性細(xì)菌，該屬的細(xì)菌可分泌淀粉酶和蛋白酶等水解酶，這些水解酶將淀粉和蛋白質(zhì)等大分子轉(zhuǎn)化為葡萄糖和氨基酸，進(jìn)而產(chǎn)生各種風(fēng)味前體物質(zhì)，有助于白酒風(fēng)味的形成，而酸度的形成主要來(lái)自產(chǎn)酸微生物的有機(jī)酸代謝以及脂肪、淀粉和蛋白質(zhì)的降解[17]。由此推測(cè)，納入本研究的清香型大曲在氨基酸態(tài)氮和酸度上存在明顯差異的原因，可能與其蘊(yùn)含的微生物類群有關(guān)。

大曲的酶活性亦是反映大曲品質(zhì)的重要生化指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)清香型大曲的液化力、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酒化力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 清香型大曲的酶活性Fig.2 Enzymatic activity of fen-flavor Daqu

由圖2 可知，納入本研究的11 個(gè)清香型大曲樣品的液化力范圍在1.78～3.20 U/g，變異系數(shù)為18.84%；發(fā)酵力范圍在6.47～11.21 U/g，變異系數(shù)為14.34%；酯化力范圍在555～825 U/g，變異系數(shù)為11.55%；糖化力范圍在810～954 U/g，變異系數(shù)為5.99%；酒化力范圍在3.6～7.4 vol，變異系數(shù)為17.47%。雖然納入本研究的11 個(gè)清香型大曲在液化力和酒化力上存在較為明顯的差異，但其酶活均符合大曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[18]。Wu 等[19]的研究表明隨著大曲中芽孢桿菌含量的增加，其液化力顯著提高，Tang 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)除了酵母菌與大曲的酒化力密切相關(guān)外，Saccharopolyspora、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和戊糖片球菌屬（Pediococcus）等細(xì)菌與酒化力亦呈正相關(guān)。由此可見(jiàn)，清香型大曲的細(xì)菌菌群組成與其酶活力可能也存在一定的關(guān)聯(lián)性。

2.2 長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲的測(cè)序信息及α 多樣性分析

對(duì)清香型大曲的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行了計(jì)數(shù)，細(xì)菌總數(shù)的范圍為7.06～7.46 lg CFU/g。采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)11 個(gè)清香型大曲的細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，整理測(cè)序結(jié)果如表1 所示。

表1 清香型大曲測(cè)序結(jié)果及各分類地位數(shù)量Table 1 Sequencing results and the number of each taxonomic classification of fen-flavor Daqu

由表1 可知，通過(guò)質(zhì)控后共獲得369653 條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品33604 條序列，經(jīng)97%的相似性劃分后共獲得11933 個(gè)OTU，比對(duì)所有序列后共劃分為22 個(gè)門、48 個(gè)綱、85 個(gè)目、160 個(gè)科和277 個(gè)屬，其中鑒定不到門和屬的序列僅有0.22%和7.73%。通過(guò)α多樣性分析可知，在11 個(gè)清香型大曲中樣品LXS7 的超1 指數(shù)最大，而樣品LXS8的香農(nóng)指數(shù)最大，這表明樣品LXS7 的細(xì)菌類群豐度更高，而樣品LXS8 的細(xì)菌類群多樣性更高，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在踩曲等環(huán)節(jié)的人工接種或環(huán)境中微生物的自然接種等方面使得不同樣品在微生物組成和含量上存在些許差異。

2.3 長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲細(xì)菌類群的解析

將在11 個(gè)清香型大曲中均存在、平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門、屬和OTU 定位為核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門、屬和OTU，繪制核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬的氣泡圖如圖3 所示。

圖3 清香型大曲中核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（A）和屬（B）的氣泡圖Fig.3 Bubble diagram of core dominant bacteria phylum (A)and genus (B) in fen-flavor Daqu

由圖3 可知，清香型大曲中3 個(gè)核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形菌門（Proteobacteria，76.07%）、厚壁菌門（Firmicutes，17.81%）和放線菌門（Actinobacteria，2.64%），8 個(gè)核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為水桿菌屬（Aquabacterium，27.30%）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas，17.56%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，14.77%）、雷爾氏菌屬（Ralstonia，8.20%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，6.52%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，5.47%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium，1.77%）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，1.14%）。Cai 等[21]亦采用高通量測(cè)序的方法對(duì)采集自湖北省襄陽(yáng)市的30 個(gè)清香型大曲的細(xì)菌類群進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Bacillus（54.26%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，11.47%）、Saccharopolyspora（11.34%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，6.56%）和Thermoactinomyces（1.53%）。雖然兩個(gè)地區(qū)的清香型大曲微生物類群具有較大區(qū)別，但Bacillus均為兩個(gè)地區(qū)的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。因能產(chǎn)生芽胞且具有牢固的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性，Bacillus在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)代謝產(chǎn)生的游離氨基酸增加了白酒獨(dú)特的香味，是參與白酒釀造的主要功能性細(xì)菌[4]。清香型白酒品質(zhì)講究“一清到底”，然而本研究發(fā)現(xiàn)大曲中除含有Bacillus外，亦含有大量Aquabacterium和Pelomonas，復(fù)雜的細(xì)菌類群是否會(huì)對(duì)清香型白酒的“清”這一品質(zhì)產(chǎn)生影響值得深入研究。Xia 等[22]的研究表明隸屬于Aquabacterium的細(xì)菌可以產(chǎn)生葡聚糖分支酶并參與微生物的厭氧消化過(guò)程，這可能有助于白酒發(fā)酵系統(tǒng)中的碳循環(huán)，但其對(duì)白酒品質(zhì)的影響尚需進(jìn)一步研究揭示。He 等[23]的研究表明人工接種貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）后增加了大曲中細(xì)菌特別是乳酸菌的含量，并且大曲的液化力、糖化力和酯化力亦有顯著提高。在踩曲等環(huán)節(jié)人工強(qiáng)化接種Bacillus，對(duì)提高清香型大曲的品質(zhì)可能具有積極意義。

進(jìn)一步對(duì)OTU 在各樣品中的分布及核心優(yōu)勢(shì)OTU 進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 基于OTU 的Upset 分析（A）與核心優(yōu)勢(shì)OTU 的瀑布圖（B）Fig.4 Upset analysis based on OTU (A) and waterfall diagram of core advantage OTU (B)

由圖4 可知，在11 個(gè)清香型大曲中均存在的OTU 有278 個(gè)，包含的序列數(shù)為297348 條，占質(zhì)控合格序列的80.44%，而其中核心優(yōu)勢(shì)OTU 僅有11 個(gè)，分別為隸屬于Bacillus的OTU337、OTU4056和OTU7205，隸屬于Aquabacterium的OTU6251和OTU6311，隸屬于Pelomonas的OTU2807，隸屬于Ralstonia的OTU5368，隸屬于Sphingomonas的OTU361，隸屬于Burkholderia的OTU894，隸屬于Bradyrhizobium的OTU2556 和隸屬于Methylobacterium的OTU8829。由此可見(jiàn)，納入本研究的樣品中存在大量的共有細(xì)菌類群，且主要由Bacillus、Aqu-abacterium、Pelomonas、Ralstonia、Sphingomonas、Burkholderia、Bradyrhizobium和Methylobacterium組成。

2.4 長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲理化特性和細(xì)菌類群的相關(guān)性分析

在對(duì)清香型大曲理化指標(biāo)和微生物類群進(jìn)行測(cè)定和解析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行研究，兩者相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖如圖5 所示。

圖5 清香型大曲中核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與理化性質(zhì)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Correlation network diagram of core dominant bacterial genera and physicochemical properties in fen-flavor Daqu

由圖5 可知，清香型大曲中核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與各理化指標(biāo)之間存在63 個(gè)正相關(guān)和33 個(gè)負(fù)相關(guān)，但僅6 組指標(biāo)間的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中Sphingomonas與蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而與酸度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Ralstonia與水分活度和酯化力均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），Pelomonas和Aquabacterium與水分活度均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Sphingomonas作為白酒發(fā)酵過(guò)程中的稀有微生物，Zhang 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)其通常來(lái)源于原料和釀造環(huán)境中的空氣，與白酒中丁二酸二乙酯和己酸乙酯等香氣物質(zhì)呈正相關(guān)。Xu 等[25]的研究表明Ralstonia可以利用H2O、CO2和甲酸生成異丁醇，異丁醇等某些醇類是白酒中芳香和后味的過(guò)渡橋梁。

3 結(jié)論

雖然長(zhǎng)治地區(qū)清香型大曲樣品間存在大量隸屬于Aquabacterium、Pelomonas、Bacillus、Ralstonia、Sphingomonas、Burkholderia、Methylobacterium和Bradyrhizobium等的共有細(xì)菌類群，但不同樣品在氨基酸態(tài)氮、液化力和酒化力上存在較大的差異，并且Sphingomonas與蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)且與酸度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Ralstonia與水分活度和酯化力均呈顯著正相關(guān)，Pelomonas和Aquabacterium與水分活度均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），后續(xù)研究中進(jìn)一步揭示這些菌群與酒曲品質(zhì)的共變性，對(duì)提升清香型大曲的品質(zhì)可能具有積極意義。