向秀連，趙慧君，王玉榮，侯強川，王 婷，楊 瑩，郭 壯,

（1.湖北文理學院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽 441053；2.湖北文理學院乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點實驗室，湖北襄陽 441053；3.襄陽市公共檢驗檢測中心，湖北襄陽 441001）

鲊廣椒是我國西南及華中等地區(qū)常見的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，其制作主要以大米粉、辣椒和食鹽等佐料混合均勻后置于陶瓷罐中密封發(fā)酵[1]。因具有酸辣的口感和特殊的香味而受到廣大群眾的喜愛。目前鲊廣椒的制作還是以家庭作坊式為主，制作工藝和環(huán)境均較為粗放，導(dǎo)致品質(zhì)參差不齊，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[2]。近年來針對鲊廣椒的研究越來越多，鄧風[3]和雷炎等[4]從不同地區(qū)的鲊廣椒中分離鑒定出多株乳酸菌，并將乳酸菌再投入鲊廣椒中進行純種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其能改善鲊廣椒的品質(zhì)；王玉榮等[5-6]發(fā)現(xiàn)鲊廣椒中的細菌和真菌均能直接影響鲊廣椒的滋味品質(zhì)，而鄒金等[7-8]通過添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和大豆分離蛋白探究其對鲊廣椒肉丸品質(zhì)的影響。盡管不同的工藝均可能改善鲊廣椒的品質(zhì)，但食鹽作為最基本的添加物，不僅可以通過調(diào)節(jié)食品滲透壓控制發(fā)酵菌群的結(jié)構(gòu)[9]，還能直接影響食品的滋味品質(zhì)[10]。通過研究食鹽的添加量，改善鲊廣椒的生產(chǎn)工藝，對于鲊廣椒的產(chǎn)業(yè)化具有重要的推動作用。

近年來，隨著科技的迅速發(fā)展和人們對食品安全的日益關(guān)注，越來越多的新技術(shù)被應(yīng)用到食品的品質(zhì)評測中。Wang 等[11-12]基于電子舌和電子鼻對中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉的滋味和風味品質(zhì)進行了數(shù)字化評價，同時采用高通量測序技術(shù)對豆豉中的細菌和真菌構(gòu)成和多樣性進行了解析，并關(guān)聯(lián)分析了豆豉中微生物對品質(zhì)的影響，為解析傳統(tǒng)發(fā)酵制品的品質(zhì)形成提供了新的思路。

本研究首先制作了不同鹽濃度的鲊廣椒樣本，繼而使用電子舌和電子鼻對滋味和風味進行評價，最后結(jié)合MiSeq 測序技術(shù)對其菌群結(jié)構(gòu)和多樣性進行解析。通過降維和相關(guān)性分析對鲊廣椒中菌群和品質(zhì)結(jié)構(gòu)進行比較分析，從而探究食鹽對鲊廣椒品質(zhì)的影響，以期為鲊廣椒的安全性提升和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

京山大米 湖北京和米業(yè)有限公司；二荊條辣椒（Capsicum annuumL.）、白胡椒、花椒、食鹽 市售；預(yù)處理溶液、內(nèi)部溶液、陽離子溶液、參比溶液、陰離子溶液 日本Insent 公司；dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStartTM FastPfu Buffer北京全式金生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒 德國QIAGEN 公司。

SA402B 電子舌 日本Insent 公司；vetiri 梯度基因擴增儀 美國AB 公司；PEN3 電子鼻 德國Airsense 公司；ND-2000C 微量紫外分光光度計 美國Nano Drop 公司；Illumina MiSeq 高通量測序平臺 美國Illumina 公司；UVPCDS8000 凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鲊廣椒樣本的制備 每份稱取750 g 磨碎的大米粉，共計9 份；每份中分別添加225 g 切碎后的辣椒、3.15 g 白胡椒和3.15 g 花椒；將0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%（以大米粉的質(zhì)量為基準，編號為A0～A8）的食鹽分別添加至大米粉中，攪拌均勻進行密封發(fā)酵，并在瓶口均勻噴灑5 mL 白酒封口，于30 ℃發(fā)酵30 d。

1.2.2 基于電子舌和電子鼻技術(shù)鲊廣椒品質(zhì)的測定 準確稱取20 g 鲊廣椒和80 g 蒸餾水混合均勻后12000 r/min 離心10 min，取上清液抽濾后置于4 ℃冰箱中靜置24 h，去除油層后取下清液進行滋味的測定[13]。每份樣品重復(fù)測定4 次，取后3 次數(shù)據(jù)的平均值為本實驗的測試數(shù)據(jù)。

準確稱取15 g 鲊廣椒于電子鼻樣品瓶中，60 ℃水浴加熱30 min，并置于室溫平衡10 min 后進行風味的測定。每份樣本平行測定3 次，每次測試時間為60 s，響應(yīng)曲線在30 s 后趨于穩(wěn)定，選取39、40 和41 s 響應(yīng)值的平均值為本研究的測試數(shù)據(jù)。10 個測試電極分別為W1C（對芳香類物質(zhì)靈敏）、W5S（對氫氧化物靈敏）、W3C（對芳香類物質(zhì)靈敏）、W6S（對氫氣有選擇性）、W5C（對烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏）、W1S（對甲烷靈敏）、W1W（對有機硫化物、萜類物質(zhì)靈敏）、W2S（對乙醇靈敏）、W2W（對有機硫化物靈敏）和W3S（對烷烴類物質(zhì)靈敏）[14]。

1.2.3 樣品微生物宏基因組DNA 提取 稱取2.0 g鲊廣椒樣本，按照DNA 基因組提取試劑盒所提供的方法進行宏基因組DNA 提取，并對其質(zhì)量進行檢驗。

1.2.4 細菌16S rRNA V3～V4 區(qū)PCR 擴增及測序 選用338F_806R 引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3'），參照郭壯等[15]的PCR 參數(shù)進行擴增，所得擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.2.5 生物信息學分析 根據(jù)雙端序列的重疊關(guān)系將下機數(shù)據(jù)拼接為一條序列，對照barcode 信息對序列數(shù)據(jù)進行歸并后質(zhì)控。采用QIIME（v1.70）平臺對質(zhì)控后的有效序列進行分類學地位注釋和微生物多樣性解析，主要分析流程參照Ma 等[16]對奶粉中細菌微生物的分析流程。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用PAST 軟件對不同鹽濃度鲊廣椒的品質(zhì)結(jié)構(gòu)進行解析；基于Procurstes 分析對不同鹽濃度鲊廣椒的菌群和品質(zhì)進行共變化分析；使用Pearson 相關(guān)性分析對優(yōu)勢細菌屬（平均相對含量大于1%）與品質(zhì)指標之間的相關(guān)性及顯著性進行分析，選取|r|＞0.5，P＜0.05 的相關(guān)性關(guān)系，采用Cytoscape 軟件進行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖繪制。使用R 軟件和Origin 2019b 軟件進行數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度鲊廣椒滋味和風味的比較分析

使用電子舌和電子鼻對鲊廣椒的品質(zhì)進行了數(shù)字化評價。鲊廣椒滋味指標相對強度隨鹽濃度的變化趨勢如圖1 所示。

圖1 鲊廣椒滋味指標相對強度的變化趨勢Fig.1 Changing trend of relative intensity of taste index of Zhaguangjiao

由圖1（a）可知，隨著鹽濃度的增加，咸味和鮮味呈現(xiàn)連續(xù)上升的趨勢，而酸味呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢。由圖1（b）可知，隨著鹽濃度的增加，鲊廣椒的澀味、后味B（苦的回味）、苦味和后味A（澀的回味）變化不明顯。

鲊廣椒各風味指標相對強度隨鹽濃度的變化趨勢如圖2 所示。由圖2a 和圖2b 可知，W1C（對芳香類物質(zhì)靈敏）、W3C（對氨氣、芳香類物質(zhì)靈敏）和W5C（對烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏）均呈現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢，W3S（對烷烴靈敏）和W6S（對氫氣有選擇性）則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而W1W（對有機硫化物、萜類物質(zhì)靈敏）、W2W（對有機硫化物靈敏）、W1S（對甲烷靈敏）、W2S（對乙醇靈敏）和W5S（對氮氧化物靈敏）呈現(xiàn)出下降-上升-下降-穩(wěn)定的趨勢。

圖2 鲊廣椒風味指標相對強度的變化趨勢Fig.2 Changing trend of relative intensity of flavor index of Zhaguangjiao

2.2 不同鹽濃度鲊廣椒中物種組成及多樣性分析

本研究進一步使用高通量測序技術(shù)對鲊廣椒的多樣性和物種構(gòu)成進行了解析。不同鹽濃度鲊廣椒的α多樣性指數(shù)和物種組成如圖3 所示。

圖3 不同鹽濃度下鲊廣椒細菌的α 多樣性（a）和物種組成（b）Fig.3 Alpha diversity (a) and species composition (b) of bacteria in Zhaguangjiao with different salt concentration

由圖3（a）可知，當鹽濃度不高于3%時，香農(nóng)指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)呈現(xiàn)快速上升的趨勢；當鹽濃度在3%到7%時，兩者均呈現(xiàn)一個輕微的下降趨勢；而當鹽濃度大于7%時，兩者均快速下降。由圖3（b）可知，鲊廣椒中絕對優(yōu)勢菌門（平均相對含量大于1%，且在所有樣本中均出現(xiàn)）為Firmicutes（厚壁菌門）和Proteobacteria（變形菌門），其平均相對含量分別為84.87%和13.65%。且A0、A1 和A2 樣品中存在較多的變形菌門，隨著鹽濃度的增加，相對含量逐漸減少。由圖3（b）亦可知，鲊廣椒中的優(yōu)勢細菌屬分別為Lactobacillus（乳桿菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pediococcus（片球菌屬）、Enterobacter（腸桿菌屬）、Weissella（魏斯氏菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬），其平均相對含量分別為60.20%、9.59%、9.19%、8.16%、3.97%和3.34%。其中乳酸菌類群（乳桿菌屬、葡萄球菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬）平均相對含量累計高達82.96%。值得注意的是，乳桿菌屬作為鲊廣椒中變化最大的細菌屬，其在鹽濃度較低的鲊廣椒樣本中含量極低，當鹽濃度大于3%時，其相對含量明顯上升。

2.3 不同鹽濃度鲊廣椒中發(fā)酵菌群與品質(zhì)的相關(guān)性分析

為了進一步驗證菌群對品質(zhì)的影響，本研究基于主成分分析和Procurstes 分析對兩者之間的關(guān)系進行了研究，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 基于產(chǎn)品品質(zhì)（a）和細菌類群（b）的主成分分析及產(chǎn)品品質(zhì)和菌群的Procurstes 分析（c）Fig.4 Procurstes analysis (c) and principal component analysis based on quality (a) and bacteria structure (b)

基于歐式距離的主成分分析對不同鹽濃度鲊廣椒的品質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了解析（圖4a），9 個鲊廣椒呈現(xiàn)出明顯的分離聚類趨勢，A3 和A4，A5、A6、A7 和A8 及剩余鲊廣椒樣本均自成一簇，且隨著食鹽添加量的不斷提高，相鄰鹽濃度的兩份鲊廣椒樣本距離不斷減小。基于加權(quán)Uni-Frac 的主成分分析發(fā)現(xiàn)（圖4b），不同鹽濃度鲊廣椒在空間排布上具有一定的規(guī)律，其中A0、A1 和A2 可歸為一類，位于X 軸負方向；A3、A4、A5、A6 和A7 可歸為一類，位于主成分圖的右上角，而A8 為單獨一類。綜合圖4a 和4b 可知，當鹽濃度超過4%時，其感官品質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，且隨著鹽濃度的繼續(xù)增加，其無明顯變化。由圖4c 可知，不同鹽濃度鲊廣椒（基于Uni-Frac 和歐氏距離對菌群和品質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)進行主成分分析）在空間排布上呈現(xiàn)出顯著的共變化趨勢（P=0.01），說明品質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化與菌群結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)。為進一步探究菌群對鲊廣椒品質(zhì)產(chǎn)生影響的原因，本研究對優(yōu)勢菌屬與品質(zhì)指標之間的相關(guān)性和顯著性進行了計算，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同鹽濃度下鲊廣椒中優(yōu)勢菌屬與品質(zhì)指標相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network diagram of the correlation between dominant bacteria and quality indexes of Zhaguangjiao with different salt concentration

由圖5 可知，鲊廣椒中有5 個優(yōu)勢細菌屬與11 個品質(zhì)指標之間存在顯著相關(guān)性（|r|＞0.5，P＜0.05），每一個優(yōu)勢菌屬均與多種品質(zhì)指標之間存在顯著相關(guān)。由圖5 亦可知，葡萄球菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬與后味B、酸味、W3S、W5S 和W1W 呈顯著正相關(guān)（r＞0.5，P＜0.05），而與豐度和鮮味等優(yōu)良指標呈現(xiàn)顯著負相關(guān)（r＜-0.5，P＜0.05）；片球菌屬與后味A 和W6S 呈現(xiàn)顯著負相關(guān)（r＜-0.5，P＜0.05），但與酸味、澀味和后味B 卻呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r＞0.5，P＜0.05）；乳桿菌屬與豐度和鮮味等指標呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r＞0.5，P＜0.05），而與酸味、W3S 和后味B 等標呈現(xiàn)顯著負相關(guān)（r＜-0.5，P＜0.05）。

2.4 不同鹽濃度鲊廣椒中發(fā)酵菌群的表型和功能預(yù)測

本研究基于菌群結(jié)構(gòu)的主成分分析對不同鹽濃度的鲊廣椒進行了分類研究，將9 個鲊廣椒分為3 個聚類，不添加食鹽、添加1%和2%食鹽樣品隸屬于聚類Ⅰ，添加3%、4%、5%、6%和7%食鹽的樣品隸屬于聚類Ⅱ，而添加8%食鹽的樣品則隸屬于聚類Ⅲ。因聚類Ⅲ僅一個鲊廣椒樣本，不具有統(tǒng)計學意義，所以后續(xù)僅針對聚類Ⅰ和聚類Ⅱ進行研究。上述研究證實鲊廣椒中細菌微生物的多樣性與品質(zhì)之間存在密切的聯(lián)系，因此本研究進一步對鲊廣椒中的細菌的表型和功能進行了預(yù)測，以便于進一步解析鲊廣椒中的細菌對品質(zhì)的作用機制。

由圖6 可知，對鲊廣椒中細菌預(yù)測的9 個表型中有7 個表型在兩組之間具有顯著性差異（P＜0.05），其中可移動原件、生物膜形成、革蘭氏陰性菌和壓力耐受性在聚類Ⅰ中的相對含量顯著較高（P＜0.05），而厭氧，革蘭氏陽性菌和致病潛力在聚類Ⅱ中的相對含量顯著較高（P＜0.05）。但值得注意的是，隸屬于聚類Ⅰ的鲊廣椒中細菌在與環(huán)境適應(yīng)和生長繁殖相關(guān)的表型上均優(yōu)于聚類Ⅱ。這表明通過在鲊廣椒的發(fā)酵過程中添加低劑量的食鹽能增強發(fā)酵菌株的發(fā)酵潛力，縮短發(fā)酵時間，同時降低其致病性。

圖6 鲊廣椒中細菌微生物的表型預(yù)測Fig.6 Phenotypic prediction of bacterial microorganisms in Zhaguangjiao

本研究使用PICRUSt 對鲊廣椒中細菌微生物的功能進行預(yù)測，并基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）進行了注釋（圖7）。本研究共注釋到235 條代謝通路，通過差異分析和功能富集（P＜0.05，Z＞1.6 且Ko 的表達概率大于80%或小于20%）共甄別到7 條差異代謝通路。7 條差異代謝通路中有4 條在聚類Ⅰ顯著富集，分別為脂多糖的生物合成、硝基甲苯降解、細菌趨化性和鞭毛組裝，而另外3 條差異代謝通路在聚類Ⅱ顯著富集，分別為光合作用、D-丙氨酸代謝和分泌細菌系統(tǒng)。值得注意的是，7 條差異代謝通路中有4 條差異代謝通路與代謝相關(guān)，這也說明隸屬于不同聚類的鲊廣椒中的細菌微生物可通過其自身代謝影響其品質(zhì)。

圖7 鲊廣椒中細菌微生物的功能預(yù)測Fig.7 Functional prediction of bacterial microorganisms in Zhaguangjiao

3 討論與結(jié)論

在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程中，食鹽的添加對于發(fā)酵制品的品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用。食鹽作為鲊廣椒的主要添加佐料，對于鲊廣椒發(fā)酵菌群和品質(zhì)形成起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)隨著食鹽比例的增加，其不僅直接導(dǎo)致鲊廣椒的咸味和澀味的強度上升，還改變了發(fā)酵制品中的菌群結(jié)構(gòu)。越來越多的研究表明，發(fā)酵食品中的菌群結(jié)構(gòu)差異對其品質(zhì)具有較大的影響。Mania 等[17]認為環(huán)境中的微生物對于發(fā)酵食物的發(fā)酵過程和最終品質(zhì)均存在影響；張逸舒和葛東穎等[18-19]發(fā)現(xiàn)使用分離于鲊廣椒中的乳酸菌制作鲊廣椒能明顯改善食物的風味和滋味品質(zhì)。由此可見，添加食鹽不僅能直接調(diào)節(jié)發(fā)酵制品的相關(guān)滋味的強度，還可通過影響鲊廣椒中的菌群結(jié)構(gòu)塑造不同滋味和風味。

鲊廣椒中主要以厚壁菌門和變形菌門為主，這與王玉榮等[2]解析當陽鲊廣椒中細菌多樣性的結(jié)果相一致。變形菌門中包含有許多病原菌，例如大腸桿菌、幽門螺旋桿菌和沙門氏菌等，而目前已證實變形菌門的增加與輕度的炎癥有關(guān)[20]。王婷婷[21]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者的變形菌門相較于健康組顯著偏高。Shin等[22]研究亦發(fā)現(xiàn)，盡管變形菌門廣泛存在于人體腸道中，但其在健康人腸道中的含量相對較低，且許多疾病和營養(yǎng)不良均與變形菌門的大量繁殖有關(guān)。隨著食鹽濃度的增加，變形菌門的相對含量幾乎變?yōu)榱?。食鹽可以提升發(fā)酵食品中的滲透壓，改變菌群的生存環(huán)境，相關(guān)報道也證實了食鹽對于變形菌門的生長具有一定的抑制作用[23]。因乳酸桿菌屬抗?jié)B透壓的能力較強[24]，在一定鹽濃度范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增加，乳酸桿菌屬的含量也明顯上升。而眾多的研究亦表明，乳酸桿菌屬具有良好的益生特性，能夠顯著改善發(fā)酵制品的品質(zhì)[25]。由此說明，增加發(fā)酵食品中一定量的食鹽比例對發(fā)酵食品中的菌群結(jié)構(gòu)影響較大，且能減少傳統(tǒng)發(fā)酵食品中致病菌的含量，對后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)品的安全性和產(chǎn)業(yè)化推動具有重要的意義。菌群結(jié)構(gòu)和品質(zhì)指標的變化趨勢的結(jié)果表明，通過對鲊廣椒中菌群結(jié)構(gòu)進行解析可以準確預(yù)判其產(chǎn)品品質(zhì)。因此在工業(yè)化生產(chǎn)中通過添加發(fā)酵菌株來定制鲊廣椒的品質(zhì)，可以使其滿足更多消費者的要求。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，當鹽濃度為5%時，鲊廣椒中的菌群結(jié)構(gòu)已趨于穩(wěn)定，無較大變化，而風味和滋味中的整體結(jié)構(gòu)已達到最優(yōu)。由此可見，在鲊廣椒中添加5%的食鹽可以顯著改善鲊廣椒的品質(zhì)。