孫夢雪，倪立穎，黃裕鴻，王 彬，張 明，吳茂玉，于發(fā)家，馬 超,

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究所，山東濟南 250014；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434022；3.山東恒寶食品集團有限公司，山東日照 276800）

金針菇（Flammulina velutipes），一種腐生異養(yǎng)型真菌，又名構(gòu)菌、毛柄金錢菌和冬菇，屬于口蘑科金錢菌屬，是著名的食藥用菌[1]。金針菇從外界吸收氮元素、微量元素、糖類等[2]，在子實體中轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、膳食纖維等多種營養(yǎng)物質(zhì)。金針菇還含有多糖、萜類、脂肪酸、多酚等活性物質(zhì)[3]，具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎、增強記憶力、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等生物活性[4-7]。近年來，金針菇需求量不斷增加，加工后剩余的菌柄、菌蓋、畸形菇等副產(chǎn)物除極少部分被作為飼料外，絕大部分被直接丟棄，不僅造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且不符合綠色、持續(xù)、健康的發(fā)展理念，資源浪費極大。目前，我國在農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域大力倡導(dǎo)資源高值利用和產(chǎn)品多元化開發(fā)，因此，急需發(fā)現(xiàn)新的技術(shù)促進金針菇廢棄物高值利用，提升國際競爭力，帶動金針菇產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展。

蒸汽爆破技術(shù)（steam explosion，簡稱汽爆技術(shù)）是指在高壓密閉環(huán)境中，利用高溫高壓的蒸汽作用于原料，通過瞬間釋壓過程實現(xiàn)原料組分的分離和結(jié)構(gòu)變化的一項技術(shù)。物料在蒸汽中加熱并維持高壓后瞬間泄壓，隨著壓強驟降、水分汽化，氣體迅速膨脹，固體物料受機械力作用結(jié)構(gòu)受到破壞并產(chǎn)生爆破效應(yīng)[8-9]。蒸汽爆破作為新興的預(yù)處理技術(shù)，最早是在1926 年，由美國學(xué)者W.·H. 梅森（W. H. Mason）開發(fā)，應(yīng)用于硬紙板生產(chǎn)、造紙、木材加工等工業(yè)化領(lǐng)域[10]。截至目前，蒸汽爆破技術(shù)已被開發(fā)用于動物飼料加工、食品預(yù)處理、中草藥預(yù)處理和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的開發(fā)[11]，汽爆技術(shù)可以促使膳食纖維改性，在高溫高壓的處理條件破壞了纖維素的氫鍵和有序結(jié)構(gòu)，降低多糖的分子量，提高其可溶性膳食纖維的溶出并提高了相關(guān)的理化特性[12-16]。然而，汽爆技術(shù)由于其復(fù)雜的物理和化學(xué)過程，難以準(zhǔn)確地控制處理的強度和均勻性，因此更容易引起有效成分的降解和美拉德反應(yīng)的發(fā)生，且處理不能連續(xù)進行[17]。金針菇菇腳中含有多種生物活性成分，因此，本研究采用蒸汽爆破技術(shù)對金針菇菇腳進行預(yù)處理，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-MS/MS）對比分析汽爆前后金針菇菇腳水提物活性成分的差異；通過DPPH、ABTS和FRAP 法測定蒸汽爆破前后金針菇菇腳水提物的體外抗氧化能力；研究其對LPS 刺激的巨噬細胞釋放NO 的影響及抗炎機制，對比汽爆前后金針菇菇腳水提物抗炎活性的差異。本研究旨為金針菇廢棄物產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化及新產(chǎn)品研發(fā)提供技術(shù)參考，以期為金針菇菇腳的高值化利用提供參考，并拓展蒸汽爆破技術(shù)在食品預(yù)處理及加工行業(yè)的利用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇菇腳 山東鄒城友和菌業(yè)有限公司；沒食子酸、抗壞血酸、苯酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 上海MACKLIN 生化科技有限公司；2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、Trolox（水溶性維生素E）、FeCl3、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑 北京索萊寶科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、氨卡青霉素/鏈霉素 美國Sigma 公司；無水乙醇 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；小鼠巨噬細胞系RAW264.7、IL-6 試劑盒、IL-1β試劑盒、TNFα試劑盒 武漢博士德生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清 美國ScienCell 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液 武漢普諾賽生命科技有限公司。

QBS-80 型蒸汽爆破設(shè)備 鶴壁政道啟寶實業(yè)有限公司；MCO-18AC 細胞培養(yǎng)箱 松下健康醫(yī)療器械有限公司；SHA-B 雙功能水浴恒溫振蕩器 蘇杰瑞爾電器有限公司；JRA-1000X 低溫超聲波破碎儀 無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司；RXH-B-1 熱風(fēng)循環(huán)烘箱 江陰市宏達粉體設(shè)備有限公司；FD-2 真空冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；JXFSTPRP-48 全自動樣品快速研磨儀 上海凈信科技公司；TGL-10B 高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；RH-600A 高速粉碎機 永康市榮浩工貿(mào)有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用UHPLC-MS/MS（Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive HF） 美國賽默飛世爾科技公司；Zorbax Eclipse C18色譜柱（1.8 μm×2.1 mm×100 mm） 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒸汽爆破處理 將金針菇菇腳分為蒸汽爆破處理組（命名為SFV 組），和未經(jīng)蒸汽爆破處理組（命名為FV 組），每組1 kg。SFV 組按照之前研究對金針菇菇腳膳食纖維汽爆改性工藝優(yōu)化后的參數(shù)[18]進行蒸汽爆破處理，即蒸汽爆破料腔比5:8，保壓時間105 s，蒸汽爆破壓強1 MPa。隨后，將SFV 組和FV組同時置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，60 ℃，干燥5 h 以上至恒重。干燥的金針菇菇腳用高速粉碎機打粉，過80 目篩，備用。

1.2.2 水提物的制備 采用梁慧嘉等[19]的方法測定并稍作改進。分別取SFV 和FV 組金針菇菇腳粉末100 g，料液比1:30（g/mL）加入蒸餾水，100 ℃水浴提取3 h，過濾，取濾液。重復(fù)2 次，合并2 次濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，即得水提物SFVE 和FVE，放入4 ℃冰箱備用，用于后續(xù)成分分析及抗氧化、抗炎活性評價實驗。

1.2.3 UHPLC-MS/MS 分析 采用An 等[20]的方法測定并稍作改進，稱取上述得到的金針菇菇腳水提物100 mg 置于2 mL 離心管中，加入1 mL 70%甲醇和3 mm 規(guī)格鋼珠，用全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-48，70 Hz）振蕩破碎3 min，冷卻后低溫超聲（40 kHz）10 min，4 ℃低溫下12000 r/min 離心10 min。取上清液稀釋100 倍，加入10 μL 濃度為100 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)（二氯苯丙氨酸），用0.22 μm PTFE濾頭過濾后，使用安捷倫C18柱（1.8 μm×2.1 mm×100 mm），通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLCMS/MS）進行化學(xué)組成分析。使用Compound Discoverer 3.3 進行保留時間矯正、峰識別、峰提取等工作，根據(jù)二級質(zhì)譜信息利用Thermo mzCloud 在線數(shù)據(jù)庫、Thermo mzValut 本地數(shù)據(jù)庫進行物質(zhì)鑒定。根據(jù)各樣品中物質(zhì)的峰面積，計算物質(zhì)在樣品中相對百分比，確定含量（各物質(zhì)相對濃度=內(nèi)標(biāo)濃度/內(nèi)標(biāo)峰面積×代謝物峰面積/樣品取樣量）。

色譜條件為：柱溫30 ℃，進樣量2 μL，流速0.3 mL/min。流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序為5% B，0～2 min；5%～30% B，2～6 min；30% B，6～7 min；30%～78% B，7～12 min；78%B，12～14 min；78%～95% B，14～17 min；95% B，17～20 min。質(zhì)譜條件為：正離子模式下進行全掃描，一級全掃描（Full Scan，m/z 100～1500）與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：120000（一級質(zhì)譜），60000（二級質(zhì)譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：330 °C；S-Lens RF Level：55%。

1.2.4 粗多糖的測定 金針菇菇腳粗多糖的測定參照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》所述方法進行測定，根據(jù)試驗測定的葡萄糖溶液OD 值制得粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0065x+0.0255，R2=0.9994。

1.2.5 總酚含量的測定 用Folin-Ciocalteu（FC）法[21]測定樣品的總酚（TPC）含量，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0198x+0.0091,R2=0.9993。通過甲醇溶解樣品后，向0.5 mL 的福林酚試劑和0.4 mL蒸餾水的混合液中加入0.6 mL 樣品溶液，反應(yīng)1 min后，加入1.5 mL Na2CO3（m/v: 20%）和6 mL 蒸餾水。將整個反應(yīng)體系放置于70 ℃中，水浴10 min。待冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀765 nm 處測定吸光值。樣品中總酚含量表示為每mg 樣品中含有沒食子酸（GAE）的量（mg GAE/mg 水提物）。

1.2.6 總黃酮含量測定 總黃酮（TFC）的含量根據(jù)Cai 等[22]的方法測定。用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3189x+0.0066，R2=0.9995。在0.3 mL 的5% NaNO2和3.8 mL 的70%乙醇混合液中加入樣品溶液1.2 mL，充分混合。反應(yīng)8 min 后，加入0.3 mL 10% Al（NO3）3、4.0 mL 4% NaOH 溶液和0.4 mL 的水溶液，在室溫下反應(yīng)12 min，用酶標(biāo)儀測量510 nm處的吸光度。樣品中總黃酮含量表示為每mg 樣品含有蘆?。≧E）的量（mg RE/mg 水提物）。

1.2.7 DPPH 自由基清除能力測定 按照文獻[23]的方法測定樣品的DPPH 自由基清除能力。0.1 mmol/L的DPPH 甲醇溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。0.5 mL 的水提物溶液以及Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與2 mL 的DPPH 溶液混合，在25 ℃條件下避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測量517 nm 處的吸光度。水提物的DPPH 自由基清除能力用每mg 水提物含有Trolox（TE）的量來表示（nmol TE/mg 水提物）。

1.2.8 ABTS+自由基清除能力測定 ABTS+自由基清除能力的測定方法按照文獻[24]的報道并稍作修改。7 mmol/L 的ABTS 溶液和40 mmol/L 的過硫酸鉀溶液按照5:88 比例進行混合，避光條件下反應(yīng)12 h 后ABTS 工作溶液配制完成。1 mL ABTS 溶液用100 mL 左右的無水乙醇進行稀釋，在波長734 nm測量其吸光值。取0.5 mL 的樣品溶液加入4 mL的ABTS 工作液，混勻后，37 ℃避光反應(yīng)6 min。用酶標(biāo)儀測定734 nm 處的吸光值。以Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中ABTS+自由基清除能力用每mg 水提物含有Trolox（TE）的量（nmol TE/mg 水提物）來表示。

1.2.9 鐵離子還原能力測定 鐵離子還原能力測定按照文獻[25]的報道并稍作修改。0.5 mL 水提物溶液或Trolox 溶液與4.5 mL 現(xiàn)配FRAP 試劑混勻，在37 ℃的避光環(huán)境中反應(yīng)10 min。使用酶標(biāo)儀測定593 nm 處的吸光值。以Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中鐵離子還原能力用每mg 水提物含有Trolox （TE）的量來表示（nmol TE/mg 水提物）。

1.2.10 抗炎活性測定

1.2.10.1 金針菇菇腳水提物對RAW264.7 細胞相對活性的影響 在96 孔板中加入1×104個/孔對數(shù)期生長的RAW264.7 細胞，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜。根據(jù)實驗設(shè)計空白組、陰性對照組及樣品組，空白組為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，陰性對照組每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，樣品組為LPS+終濃度為62.5、125、250、500 μg/mL 的FVE 或SFVE。處理24 h后，每孔分別加入CCK-8 試劑10 μL，放入37 ℃，5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度，細胞相對活性根據(jù)公式（1）計算。

1.2.10.2 金針菇菇腳水提物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞NO 產(chǎn)生量的影響 NO 產(chǎn)生量采用Griess 分析法[26]。在96 孔板中加入1×104個/孔對數(shù)期生長的RAW264.7 細胞，37 ℃，5% CO2條件下過夜培養(yǎng)。加入不同濃度的FVE 和SFVE（0、62.5、125、250、500 μg/mL）處理1 h，加入終濃度為1 μg/mL 的LPS溶液，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在96 孔板中加入100 μL 上清液，隨加入100 μL Griess 試劑，反應(yīng)10 min，于540 nm 處測定吸光度值。NO 的產(chǎn)生率根據(jù)公式（2）計算。

1.2.10.3 炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌量的影響 按1.2.10.2 對細胞進行處理，取細胞上清液，參照酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）試劑盒說明書對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）的分泌量進行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各種炎癥因子的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇菇腳水提物化合物種類及含量的差異

金針菇菇腳的食用和藥用價值很大程度上取決于其生物活性化合物的含量。因此，本研究通過UHPLC-MS/MS 檢測了蒸汽爆破前后金針菇菇腳水提物的化合物種類及含量變化。圖1 展示了未蒸汽爆破（FVE）與蒸汽爆破后（SFVE）金針菇菇腳水提物的總離子色譜圖（TIC）。結(jié)果可知，金針菇菇腳水提物具有136 種羧酸衍生物、肉桂酸及其衍生物和吲哚類衍生物及有機氧化物等化合物等，主要化合物如表1 所示。結(jié)果表明，經(jīng)過蒸汽爆破后，部分化合物含量顯著升高（P＜0.05），如甜菜堿、反式-3-吲哚丙烯酸、腺苷、煙酰胺等，含量為1356.69、832.86、1134.54和192.15 μg/g，分別是未汽爆組的1.14 倍、1.32 倍、3.39 倍、3.21 倍，相關(guān)研究表明，汽爆的物理爆破作用能夠打破植物組織-細胞-細胞壁水平的多尺度抗提取屏障結(jié)構(gòu)，提高活性成分的破壁促溶效果[17]，這可能是影響蒸汽爆破前后水提物化合物含量差異的原因。據(jù)報道，甜菜堿具有顯著的抗氧化、抗炎、保肝護肝等生物活性[27]，吲哚類衍生物同樣具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗抑郁、抗炎、抗真菌及抗HIV 等[28]。煙酰胺具有顯著的降低皮膚黑色素的作用及抗菌活性[29]。腺苷具有降血糖及保肝護肝及治療腎功能紊亂和腎衰竭的作用[30]，值得注意的是，蒸汽爆破處理促進了N-甲?；?L-酪氨酸、α-亞麻酸、4-胍基丁酸的溶出，在未汽爆組中未檢出。因此，蒸汽爆破處理能夠促進部分活性化合物的溶出，增加其提取率。蒸汽爆破前后化合物種類及含量的不同可能會導(dǎo)致樣品抗氧化及抗炎等生物活性存在差異。

表1 蒸汽爆破前后金針菇菇腳化合物組成及含量Table 1 Composition and content of compounds in Flammulina velutipes stembase before and after steam explosion

圖1 蒸汽爆破前后金針菇菇腳水提物總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of Flammulina velutipes stembase water extracts before and after steam explosion

2.2 蒸汽爆破處理對金針菇菇腳水提物中粗多糖、總酚及總黃酮的含量的影響

為了探究蒸汽爆破處理對金針菇菇腳中活性成分含量的影響，對其粗多糖、總酚及總黃酮的含量進行檢測及對比，結(jié)果見表2。爆破加工是利用高溫和高壓共同作用于原料，并通過瞬時釋壓過程實現(xiàn)原料的組分分離和結(jié)構(gòu)的變化，通過與其他分離技術(shù)的結(jié)合，可實現(xiàn)物料在組分水平、細胞水平和組織水平的分級分離。由表可知，蒸汽爆破處理后金針菇菇腳水提物（SFVE）多糖含量為（105.37±0.17）mg/g 樣品干重，相比蒸汽爆破前的金針菇菇腳增加了56.03%，這可能是由于蒸汽爆破過程中存在類酸性水解、熱降解、類機械斷裂、氫鍵破壞以及結(jié)構(gòu)重排等作用[31]打開了多糖溶出的通道，使多糖溶出加快，或者高溫高壓對化學(xué)鍵的破壞，使多糖的含量及種類發(fā)生變化[32]，實驗結(jié)果與何陳燦等[33]的研究一致。值得注意的是，F(xiàn)VE 的多酚及黃酮含量分別為（13.47±0.02）mg GAE/g和（11.81±0.18）mg RE/g，而SFVE 的多酚及黃酮含量分別為（12.62±0.20）mg GAE/g 和（9.86±0.07）mg RE/g，相比之下，蒸汽爆破處理后金針菇菇腳總多酚及總黃酮含量有所減少，這可能是因為樣品高溫高壓環(huán)境中長時間停留會導(dǎo)致酚類化合物降解或聚合[34]，從而導(dǎo)致其含量減少。

表2 金針菇菇腳水提物總酚、總黃酮含量及抗氧化活性Table 2 Total phenolics, total flavonoids and antioxidant activities of Flammulina velutipes stembase water extracts

2.3 蒸汽爆破處理對金針菇菇腳抗氧化活性的影響

由表2 可知，汽爆前后的金針菇菇腳水提物均具有DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和Fe3+還原能力，說明金針菇菇腳水提物具有顯著的抗氧化活性，且汽爆后的金針菇菇腳（SFVE）抗氧化活性更強。蒸汽爆破后的DPPH 自由基的清除能力、ABTS+自由基清除能力和Fe3+還原能力分別為（77.59±0.84）nmol TE/mg 水提物、（76.38±2.78）nmol TE/mg 水提物、（53.29±2.05）nmol TE/mg 水提物（P＜0.05），分別為未汽爆組（FVE）的1.12 倍、1.07 倍、1.12 倍。與DPPH 及ABTS+自由基清除能力相比，蒸汽爆破前后金針菇菇腳水提物對Fe3+還原能力較弱。經(jīng)過蒸汽爆破處理后，這些活性的增強可能與其水提物中活性成分的更易溶出及相互協(xié)同作用有關(guān)[10,35]，這一結(jié)果與徐一凡等[36]的研究結(jié)果一致。結(jié)果表明金針菇菇腳水提物是一種有效的天然抗氧化劑，具有較好的保健功效，有望開發(fā)新型天然功能食品用于緩解人體衰老或預(yù)防疾病發(fā)生。

2.4 蒸汽爆破前后金針菇菇腳水提物的體外抗炎作用比較

2.4.1 細胞存活率分析 為了明確本實驗所采用的LPS刺激和金針菇菇腳水提物處理是否影響RAW264.7細胞的正常生長，本文分別采用不同濃度LPS 和水提物處理細胞24 h，然后采用CCK-8 法對細胞的相對活性進行了檢測。如圖2 所示，與CON 組相比，添加濃度為62.5、125、250 和500 μg/mL 時，F(xiàn)VE和SFVE 的細胞相對活性均在空白組的98%以上。該結(jié)果表明，F(xiàn)VE 和SFVE 在上述濃度范圍內(nèi)未表現(xiàn)任何細胞毒性。在后續(xù)試驗中采用1 μg/mL LPS作為刺激濃度，并將500、250、125、62.5 μg/mL 作為FVE 及SFVE 的處理濃度。

圖2 金針菇菇腳水提物對RAW264.7 巨噬細胞活力的影響Fig.2 Effect of Flammulina velutipes stembase water extracts on cell viability in RAW264.7 macrophages

2.4.2 金針菇菇腳水提物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞NO 產(chǎn)生率的影響 由圖3 可知，模型組的NO釋放量顯著高于對照組（P＜0.05），表明造模成功。與模型組相比，各濃度FVE 和SFVE 處理均能顯著降低NO 釋放量（P＜0.05），且具有濃度依賴性。據(jù)報道，金針菇多糖具有明顯的抗炎活性，增強RAW264.7細胞活力和吞噬能力，抑制NO 和ROS 的分泌，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α的分泌與基因表達[37]，這可能是FVE/SFVE 主要的抗炎活性物質(zhì)，蒸汽爆破從樣品抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞產(chǎn)生NO 的結(jié)果中顯示，和模型組相比，F(xiàn)VE 和SFVE 均有一定的抑制NO 生成效果，當(dāng)樣品濃度在62.5 μg/mL 時，F(xiàn)VE 和SFVE 的NO 產(chǎn)生率分別為96.78%±0.41%、73.18%±1.52%，樣品濃度達到500 μg/mL 時，F(xiàn)VE 和SFVE 的NO 產(chǎn)生率分別為56.12%±0.23%、52.01%±0.88%。其中蒸汽爆破后的金針菇菇腳水提物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞產(chǎn)生NO 有較為顯著的抑制活性（P＜0.05），且存在劑量依賴關(guān)系，SFVE 的抗炎效果優(yōu)于FVE，這可能和提取物中的多糖含量有關(guān)系，也可能是因為經(jīng)過蒸汽爆破處理促進了其他抗炎活性物質(zhì)的溶出及化合物之間的協(xié)同作用，如甜菜堿、吲哚類衍生物等化合物。

圖3 金針菇菇腳水提物對RAW264.7 巨噬細胞NO 產(chǎn)生率的影響Fig.3 Effects of Flammulina velutipes stembase water extracts on NO production rate in RAW264.7 macrophages

2.4.3 金針菇菇腳水提物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的影響 LPS可以誘導(dǎo)炎癥細胞中促炎細胞因子的分泌增加，如TNF-α、IL-1β和IL-6 等，這些細胞因子的過度分泌是炎癥的標(biāo)志[38]。在這種情況下，一些具有抗炎活性的物質(zhì)可以減少促炎細胞因子的分泌[39-42]。由圖4可知，各濃度FVE 和SFVE 處理后TNF-α表達量分別為852.27～1254.51 pg/mL 和736.20～1146.21 pg/mL，IL-1β的表達量分別為81.52～133.32 pg/mL 和73.18～130.88 pg/mL，IL-6 的表達量分別為228.87～297.80 pg/mL 和205.84～288.20 pg/mL。與模型組相比，F(xiàn)VE和SFVE 在一定濃度下均對細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達具有顯著的抑制作用（P＜0.05），這一結(jié)果與馬升等[43]的金針菇多糖研究結(jié)果一致，說明多糖可能是主要的抗炎活性成分。在62.5 μg/mL的濃度處理下，F(xiàn)VE 和SFVE 就對TNF-α和IL-6表現(xiàn)出了抑制活性，當(dāng)濃度為125 μg/mL 時，F(xiàn)VE和SFVE 處理才對IL-1β表現(xiàn)出明顯的抑制效果。結(jié)果表明，F(xiàn)VE 和SFVE 處理對TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達具有很強的抑制作用，呈濃度依賴性，且SFVE 處理后的抑制效果更顯著，這一結(jié)果與NO 產(chǎn)生率一致。與FVE 相比，SFVE 是一種更好的炎癥抑制劑。綜上，F(xiàn)VE 和SFVE 處理對細胞炎癥因子均有抑制作用，表明金針菇菇腳水提物能在蛋白表達水平上抑制細胞炎癥因子的表達，降低機體炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。

圖4 金針菇菇腳水提物對RAW264.7 巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥因子的影響Fig.4 Effect of Flammulina velutipes stembase water extracts on inflammatory cytokines in RAW264.7 macrophages

3 結(jié)論

本研究開展了蒸汽爆破前后金針菇菇腳的活性成分及相關(guān)生物活性評價相關(guān)工作。研究證明，蒸汽爆破能有效提高金針菇菇腳中多糖的得率，而且會影響金針菇菇腳中其他化合物的含量及組成。相關(guān)活性評價結(jié)果證明，金針菇菇腳水提物具有顯著的抗氧化及抗炎活性，經(jīng)過蒸汽爆破后效果會更為顯著，這可能和多糖的溶出率及活性成分之間的協(xié)同作用有關(guān)。且ELISA 測定細胞因子水平結(jié)果表明金針菇菇腳水提物能下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6 的分泌水平，從蛋白表達水平上闡述了FVE 以及SFVE 抗炎機制。綜上所述，蒸汽爆破對金針菇菇腳生物活性物質(zhì)的釋放及抗氧化抗炎活性的提升具有良好的效果，并為金針菇菇腳功能性成分提取、多糖制備等方面的應(yīng)用提供有效的途徑，為金針菇菇腳等天然食用菌廢棄物產(chǎn)品開發(fā)提供新思路和理論依據(jù)。蒸汽爆破技術(shù)在食用菌廢棄物的預(yù)處理方面有巨大的潛力，隨著研究的深入，將致力于研究蒸汽爆破的強度和均勻性，避免有效成分的降解和美拉德反應(yīng)的發(fā)生，進一步拓展爆破技術(shù)在食品原料預(yù)處理及加工行業(yè)的利用范圍。