李傳天，高 鵬，朱金芳, ，劉 婷，馬雪紅，孫秋菊，麥合麗婭·伊卜拉伊木，陳 麗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

番茄紅素（Lycopene，LYC）是一種類胡蘿卜素，分子式為C40H56[1]，相對(duì)分子質(zhì)量為536.85，屬于異戊二烯類不飽和烯烴化合物，在甲醇、乙醇等極性溶劑中幾乎不溶，但溶于二氯甲烷、乙醚等非極性溶劑[2]，其抗氧化活性是α-生育酚的10 倍[3]。LYC 還具有降血脂[4]、防癌抗癌[5]、提高機(jī)體免疫力[6]、保護(hù)心血管[7]等功能，因而被廣泛應(yīng)用于保健食品及醫(yī)用藥品中。

由于LYC 含有多個(gè)不飽和鍵，導(dǎo)致其具有多種幾何異構(gòu)體[8]，而實(shí)際上能檢測(cè)到的主要異構(gòu)體包括全反式（All-E）和順式異構(gòu)體（5Z、9Z、13Z、15Z 等）。LYC 在自然界中主要以全反式構(gòu)型存在，而人體組織中大部分為順式構(gòu)型[9]。LYC 穩(wěn)定性很差，容易在光、氧、熱、酸條件下被氧化降解[10]和發(fā)生順?lè)串悩?gòu)轉(zhuǎn)化[11]，進(jìn)一步影響到LYC 產(chǎn)品的保存和生物利用度，這使其應(yīng)用受到了很大的限制。研究表明，將LYC 包載于聚合物膠束中，可明顯提高LYC 的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度[10]。

聚合物膠束是指兩親性聚合物在水溶液中自組裝形成的具有核殼結(jié)構(gòu)的一種熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)，其疏水內(nèi)核可以裝載難溶性藥物，提高難溶性藥物的水溶性，親水外殼可保護(hù)膠束內(nèi)部的藥物分子不被外界吸附或降解[12]。聚乙二醇單甲醚-聚乳酸（mPEG-PLA）是一種具有良好生物相容性的兩親性聚合物，其中PEG 嵌段無(wú)毒、無(wú)刺激性，可有效延長(zhǎng)被修飾物在體內(nèi)的半衰期，其性能已得到了美國(guó)食品和藥物管理局的認(rèn)可[13]；PLA 嵌段毒性低，可生物降解，在體內(nèi)代謝為二氧化碳和水，不會(huì)在體內(nèi)蓄積[14]，近年來(lái)mPEGPLA 被廣泛用作制備膠束載體。王麗等[15]制備柚皮素-mPEG-PLA 聚合物膠束，考察其體外釋放行為，發(fā)現(xiàn)同時(shí)間點(diǎn)聚合物膠束累積釋放度均高于原料，柚皮素-mPEG-PLA 聚合物膠束增加了柚皮素的釋放量，改善了其生物利用度。mPEG-PLA 的嵌段組成比例和相對(duì)分子質(zhì)量不同，其對(duì)難溶性物質(zhì)的增溶控釋作用也不同[16]。因此選擇合適嵌段比例mPEGPLA 包載LYC，可以更好提升其水溶性和生物利用度。鑒于此，本研究以三種不同嵌段比例的mPEGPLA（ mPEG45-PLA36、 mPEG114-PLA90、 mPEG114-PLA180）為載體，以脂溶性番茄紅素為原料，制備番茄紅素膠束（M-LYC），比較三種M-LYC中LYC 各異構(gòu)體的載藥量、包封率、粒徑和Zeta 電位。同時(shí)測(cè)定MLYC 和LYC 原料在pH1.2、pH6.8、pH7.4 條件下各異構(gòu)體的累積釋放百分率，篩選最佳比例mPEG-PLA載體，以期增加LYC 水溶性并提高其生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全反式LYC 對(duì)照品（批號(hào)：039M4100V，純度99.5%） Sigma 公司；番茄紅素原料（純度64.88%）

本實(shí)驗(yàn)室提取純化；mPEG45-PLA36、mPEG114-PLA90、mPEG114-PLA180本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)文獻(xiàn)方法[17]合成；大豆磷脂 上海太偉藥業(yè)有限公司；油酸聚乙二醇甘油酯（PEG-OA2） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲基叔丁基醚 色譜純，阿拉丁試劑公司；丙酮 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷、磷酸二氫鉀 天津永晟精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；三氯甲烷 成都市科隆化學(xué)品有限公司；無(wú)水乙醚 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇 天津市鑫鉑特化工有限公司；所有試劑如未特殊標(biāo)明均為分析純；水 蒸餾水。

LC-16 高效液相色譜儀（配有光電二極管陣列檢測(cè)器和LabSolutions 色譜工作站） 島津儀器（蘇州）有限公司；YMC Carotenoid S-5（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 日本YMC 公司；BSA-124S 型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；90Plus PALS Zeta 電位及粒度分析儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司；XHF-DY 型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ZWF-200D 氣浴恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；TG16B 醫(yī)用離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 M-LYC 的制備 M-LYC 的制備在本課題組之前研究的基礎(chǔ)上稍加修改[10]。分別稱取mPEG45-PLA36、mPEG114-PLA90、mPEG114-PLA180各50 mg，每份中加入LYC 原料5 mg，注射級(jí)大豆磷脂5 mg，溶于1 mL 二氯甲烷和2 mL 無(wú)水乙醚中，同時(shí)分別加入0.7 mL 無(wú)水乙醇，繼續(xù)加入9 mL 蒸餾水，用高速剪切機(jī)13000 r/min 乳化1 min，迅速轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在35 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機(jī)溶劑，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，制得mPEG45-PLA36-MLYC、 mPEG114-PLA90-M-LYC、 mPEG114-PLA180-M-LYC。

1.2.2 LYC 各異構(gòu)體的含量測(cè)定及M-LYC 中LYC的包封率和載藥量計(jì)算

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：YMC Carotenoid S-5（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈，B：甲基叔丁基醚；線性梯度洗脫：流動(dòng)相B 在5 min 內(nèi)由0%增加至40%，5～15 min 由40%增加至50%，15～25 min 由50%增加至60%，25～35 min 內(nèi)由60%增加至65%，35～40 min 由65%減少至0%，40～45 min保持0%不變；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：472 nm；PDA 檢測(cè)器光譜收集范圍：200～800 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.2.2 用于含量測(cè)定的全反式LYC 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取全反式LYC 對(duì)照品1 mg，用三氯甲烷溶解并定容至10 mL，搖勻，即得全反式LYC 對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取一定量的全反式LYC 對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于10 mL 棕色容量瓶中，用丙酮定容，配制成濃度分別為0.52、1.04、1.73、2.08、3.46 和6.93 μg/mL的全反式LYC 對(duì)照品溶液，通過(guò)HPLC 測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=14518x+1370.5（R2=0.9991）。

1.2.2.3 LYC 原料供試液的配制 精密稱取LYC原料5 mg，用三氯甲烷溶解，定容至10 mL。精密吸取上述溶液100 μL，置于10 mL 棕色容量瓶中，用丙酮定容，在13000 r/min 條件下離心15 min，即得。

1.2.2.4 M-LYC 供試液的配制 精密量取“1.2.1”項(xiàng)下M-LYC 溶液100 μL，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入1 mL 三氯甲烷充分振搖以提取膠束中的LYC，用丙酮定容，在13000 r/min 條件下離心15 min 即得。

1.2.2.5 LYC 原料及M-LYC 中LYC 各異構(gòu)體的鑒別

參照文獻(xiàn)[18-19]的方法，從LYC 原料及M-LYC含量測(cè)定HPLC 圖中提取各異構(gòu)體在300～550 nm 特征區(qū)域的全波長(zhǎng)光譜圖，對(duì)LYC 各異構(gòu)體進(jìn)行定性鑒別，計(jì)算其在順式特征吸收峰（360～362 nm）與最大吸收波長(zhǎng)處主吸收峰（472 nm 左右）吸光度的比值，即Q 值。根據(jù)單峰保留時(shí)間、特征吸收峰位置及Q 值鑒定番茄紅素各異構(gòu)體。

1.2.2.6 LYC 原料及M-LYC 中LYC 各異構(gòu)體含量的計(jì)算 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算全反式番茄紅素的含量，采用峰面積歸一化法計(jì)算LYC 各順式異構(gòu)體的含量[19-20]，各異構(gòu)體的含量總和為T(mén)otal LYC 含量。M-LYC 中各異構(gòu)體包封率和載藥量的計(jì)算分別按公式（1）、（2）計(jì)算M-LYC 中各異構(gòu)體及Total LYC的包封率（EE）和載藥量（DL）。

式中：M1為膠束中測(cè)得的各異構(gòu)體或Total LYC的量；M2為制備過(guò)程中加入的原料中含各異構(gòu)體或Total LYC 的量；M3為制備過(guò)程中加入的載體材料、LYC 原料及大豆磷脂的總量。

1.2.3 番茄紅素膠束粒徑及Zeta 電位的測(cè)定 采用動(dòng)態(tài)光散射納米粒徑分析儀測(cè)定番茄紅素膠束的平均粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和Zeta 電位，測(cè)定溫度為

25 ℃。

1.2.4 LYC 原料及M-LYC 中LYC 的體外釋放度測(cè)定

1.2.4.1 不同釋放介質(zhì)的配制 a.含0.1% PEG-OA2的pH6.8 緩沖溶液的配制：按照《中國(guó)藥典》（2020版）[21]配制pH6.8 的PBS 緩沖液。取250 μL PEGOA2，置于250 mL 容量瓶中，用pH6.8 的PBS 緩沖液定容，搖勻備用。b.含0.1% PEG-OA2的pH7.4 緩沖溶液的配制：按照《中國(guó)藥典》（2020 版）[21]配制pH7.4 的PBS 緩沖液。取250 μL PEG-OA2，置于250 mL 容量瓶中，用pH7.4 的PBS 緩沖液定容，搖勻備用。c.含0.1% PEG-OA2的pH1.2 溶液的配制：按照《中國(guó)藥典》（2020 版）[21]配制pH1.2 的PBS 緩沖液。取250 μL PEG-OA2，置于250 mL 容量瓶中，用pH1.2 的PBS 緩沖液定容，搖勻備用。

1.2.4.2 LYC 原料油溶液的配制 稱取LYC 原料4 mg，用大豆油溶解并定容至10 mL，搖勻備用。

1.2.4.3 用于釋放度測(cè)定的全反式LYC 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按照“1.2.2.2”的方法，配制濃度分別為0.17、0.35、0.52、0.69、1.04、1.73 μg/mL 的全反式LYC 對(duì)照品溶液，通過(guò)HPLC 測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL），以峰面積為縱坐標(biāo)（y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=15342x+465.53（R2=0.9997）。

1.2.4.4 M-LYC 中LYC 的體外釋放度測(cè)定 分別精密量取三種mPEG-PLA 材料制備的M-LYC（即mPEG45-PLA36-M-LYC， mPEG114-PLA90-M-LYC，mPEG114-PLA180-M-LYC）和LYC 原料油溶液各1 mL 注入透析袋（MWCO：8000～14000 Da）中，再置于10 mL 釋放介質(zhì)中，在37 ℃，100 r/min 條件下進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。分別于0.5、2、4、6、8、24、48、72 h，取出1 mL 釋放液，同時(shí)補(bǔ)充1 mL 37 ℃預(yù)熱的空白釋放介質(zhì)，用丙酮將取出的釋放液稀釋至一定倍數(shù)，在13000 r/min 條件下離心15 min。按“1.2.2”方法測(cè)定并計(jì)算釋放介質(zhì)中LYC 各異構(gòu)體的含量，并按公式（3）計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積釋放率。

式中：Qn為第n 個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)LYC 的累積釋放百分率；C0為L(zhǎng)YC 的初始濃度；Cn為第n 個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)LYC 的濃度；V0為釋放介質(zhì)體積；V 為每次取樣體積；Va為M-LYC 體積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 LYC 各異構(gòu)體的含量測(cè)定及M-LYC 中Total LYC的EE 和DL 計(jì)算

2.1.1 LYC 各異構(gòu)體的鑒別 從全反式LYC 對(duì)照品、LYC 原料和M-LYC 的HPLC 色譜圖（圖1、圖2 和圖3）中提取各色譜峰最高點(diǎn)處的300～500 nm 波長(zhǎng)光譜圖，對(duì)LYC 各異構(gòu)體進(jìn)行定性鑒別。將HPLC色譜圖中出現(xiàn)的四個(gè)峰按照出峰順序命名為a、b、c、d 峰。由圖1 可以看出，a、b、c、d 四個(gè)峰的光譜圖在波長(zhǎng)400～550 nm 區(qū)段的峰形與全反式番茄紅素對(duì)照品光譜圖（圖4（5））基本相同，其特征為在472 nm左右均出現(xiàn)了“山字”峰形的主吸收峰，且在472 nm左右有最強(qiáng)吸收峰；圖2 和圖3 峰c 的光譜圖與圖4（5）相同，故判斷峰c 為全反式LYC；圖4（1）（2）（4）不僅在472 nm左右均出現(xiàn)了“山字”峰形的主吸收峰，且在360～362 nm 處均有一個(gè)明顯的特征吸收峰，依據(jù)文獻(xiàn)[22]可初步判斷其為順式LYC；通過(guò)計(jì)算得到峰a、b、d 的Q 值分別為0.53、0.22、0.10，與文獻(xiàn)報(bào)道13Z、9Z、5Z 的Q 值（0.5、0.2、0.11）基本一致[18-19]。綜合光譜圖及Q 值結(jié)果可以判斷HPLC色譜圖上的a、b、c、d 峰分別為L(zhǎng)YC 異構(gòu)體13Z、9Z、All-E、5Z 的色譜峰。

圖1 全反式LYC 對(duì)照品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC spectrum of all-trans LYC control

圖2 LYC 原料的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC spectrum of LYC raw material

圖3 M-LYC 的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC spectrum of M-LYC

圖4 峰a（1），b（2），c（3），d（4）和全反式LYC 對(duì)照品（5）的光譜圖Fig.4 Spectra of peaks a (1), b (2), c (3), d (4) and all-trans LYC control (5)

2.1.2 M-LYC 中LYC 含量測(cè)定及LYC 的EE 和DL計(jì)算 EE 和DL 是評(píng)價(jià)納米膠束包封效果及質(zhì)量的重要指標(biāo)，本研究以此為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，篩選合適的mPEG-PLA 嵌段比例，分別如表1、表2、表3 所示。在三種材料制備的M-LYC 中各LYC 異構(gòu)體含量、EE 和DL 差異較大。一般來(lái)說(shuō)，PLA 鏈分子量越大越易包封LYC[23]，因此，mPEG114-PLA90-M-LYC 中各異構(gòu)體及Total-LYC 的EE 均高于mPEG45-PLA36-M-LYC。但研究發(fā)現(xiàn)，擁有最長(zhǎng)PLA 鏈的mPEG114-PLA180-M-LYC 的各異構(gòu)體及Total-LYC 包封率卻最低（23.62%），其原因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的PLA 鏈?zhǔn)蛊渌苄宰儾睿装l(fā)生聚集而沉降，在用微孔濾膜過(guò)濾時(shí)部分被濾除[24]。綜合三種膠束的EE 和DL 值，選擇mPEG45-PLA36、mPEG114-PLA90作為包載LYC較佳的嵌段共聚物。另外，在三種膠束中，13Z 的包封率均最低，這可能是由于13Z 旋轉(zhuǎn)障礙小，極易發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化，故在膠束制備過(guò)程中發(fā)生了異構(gòu)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致包封率降低，Knockaert 等[25]也發(fā)現(xiàn)在一定溫度下13Z 的異構(gòu)轉(zhuǎn)化程度在幾種順式異構(gòu)體中最高。有研究表明[26]相比于13Z，9Z 需要在更高溫度下才能發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化，這是因?yàn)?Z 異構(gòu)轉(zhuǎn)化所需要的能量高于13Z，故三種膠束中9Z 的包封率均高于13Z。5Z 為常見(jiàn)的LYC 中最穩(wěn)定的順式異構(gòu)體[27]，在三種膠束中5Z的包封率均高于其他異構(gòu)體，甚至高于Total-LYC。

表1 mPEG45-PLA36-M-LYC 中各異構(gòu)體含量和Total-LYC 包封率及載藥量（±SD，n=3）Table 1 Content of each isomer in mPEG45-PLA36-M-LYC and Total-LYC encapsulation rate and drug loadin g capacity(±SD, n=3)

表1 mPEG45-PLA36-M-LYC 中各異構(gòu)體含量和Total-LYC 包封率及載藥量（±SD，n=3）Table 1 Content of each isomer in mPEG45-PLA36-M-LYC and Total-LYC encapsulation rate and drug loadin g capacity(±SD, n=3)

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表2 mPEG114-PLA90-M-LYC 中各異構(gòu)體含量和Total-LYC 包封率及載藥量（±SD，n=3）Table 2 Content of each isomer in mPEG114-PLA90-M-LYC and Total-LYC encapsulation rate and drug loading capacity(±SD, n=3)

表2 mPEG114-PLA90-M-LYC 中各異構(gòu)體含量和Total-LYC 包封率及載藥量（±SD，n=3）Table 2 Content of each isomer in mPEG114-PLA90-M-LYC and Total-LYC encapsulation rate and drug loading capacity(±SD, n=3)

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表3 mPEG114-PLA180-M-LYC 中各異構(gòu)體含量和Total-LYC 包封率及載藥量（±SD，n=3）Table 3 Content of each isomer in mPEG114-PLA180-M-LYC and Total-LYC encapsulation rate and drug loading capacity(±SD, n=3)

表3 mPEG114-PLA180-M-LYC 中各異構(gòu)體含量和Total-LYC 包封率及載藥量（±SD，n=3）Table 3 Content of each isomer in mPEG114-PLA180-M-LYC and Total-LYC encapsulation rate and drug loading capacity(±SD, n=3)

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2.2 番茄紅素膠束的粒徑及Zeta 電位分析

文獻(xiàn)報(bào)道[28]膠束分子量的大小是影響膠束粒徑的主要原因，膠束的分子量越小其粒徑則越小。三種膠束的粒徑、PDI、Zeta 電位值如表4 所示，可以看出分子量最小的mPEG45-PLA36-M-LYC 粒徑最小（164.63 nm），分子量最大的mPEG114-PLA180-M-LYC的粒徑最大（210.33 nm），該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[28]一致。三種膠束的PDI 均未超過(guò)0.17，說(shuō)明三種膠束粒徑分布均比較集中。一般Zeta 電位的絕對(duì)值越大，膠束粒子之間排斥性越強(qiáng)，越不易絮凝，體系越穩(wěn)定[29]，mPEG45-PLA36-M-LYC 的Zeta 電位絕對(duì)值最大（15.38 mV），說(shuō)明其在三種膠束中穩(wěn)定性最好。

表4 三種膠束的粒徑、PDI、Zeta 電位值（±SD，n=3）Table 4 Particle size, PDI, and Zeta potential values of the three micelles (±SD, n=3)

表4 三種膠束的粒徑、PDI、Zeta 電位值（±SD，n=3）Table 4 Particle size, PDI, and Zeta potential values of the three micelles (±SD, n=3)

注：同行不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05），表5同。

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2.3 LYC 原料及M-LYC 中LYC 的體外釋放度測(cè)定

由于體內(nèi)生物利用度與體外釋放度具有正相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)以0.1% PEG-OA2的不同pH（1.2、6.8、7.4）溶液作為釋放介質(zhì)，考察LYC 原料和M-LYC 中LYC的體外釋放行為。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），LYC 原料在不同釋放介質(zhì)中均未檢測(cè)到LYC 釋放出來(lái)，其原因主要為L(zhǎng)YC的脂溶性很強(qiáng)，在水性釋放介質(zhì)及體液中很難溶解釋放。三種不同嵌段共聚物包載的M-LYC 在含0.1%PEG-OA2的pH1.2 釋放介質(zhì)中，均未檢測(cè)到LYC 各異構(gòu)體，分析其原因可能與LYC 在酸性介質(zhì)中不穩(wěn)定易被降解有關(guān)，這與朱金芳等[10]的研究相符。在含0.1% PEG-OA2的pH6.8 和pH7.4 的釋放介質(zhì)中，LYC原料及三種M-LYC 中Total LYC 的體外累積釋放百分率見(jiàn)圖5（1）和（2）。結(jié)果顯示在含0.1% PEG-OA2的兩種釋放介質(zhì)中，72 h 累積釋放百分率最高的為mPEG45-PLA36-M-LYC，分別為42.35%（pH6.8）、60.82%（pH7.4），這是由于低分子量的mPEG 具有更高的親水性，即含有mPEG45的膠束比含有mPEG114的膠束親水性更強(qiáng)，水分子更易滲入膠束內(nèi)部[30]，此外，其粒徑最?。?64.63 nm），能夠與水分子接觸充分，因此可以通過(guò)溶脹機(jī)理釋放更多的藥物[31]。但在最初24 h，Total LYC 累積釋放百分率最高的卻為mPEG114-PLA90-M-LYC，分別是19.13%（pH6.8）、22.92%（pH7.4），這可能與其EE 和DL 最高有關(guān)。當(dāng)藥物包載量較高時(shí)，部分藥物會(huì)進(jìn)入疏水端邊緣，甚至到疏水端與親水端交界處，在載體材料溶脹的過(guò)程中，這部分藥物更易擴(kuò)散，進(jìn)而很快地釋放出來(lái)[32]。Musumeci 等[24]也發(fā)現(xiàn)高包封率會(huì)導(dǎo)致藥物在初始階段的快速釋放。通過(guò)比較pH7.4 和pH6.8 條件下三種M-LYC 在72 h 的累積釋放百分率發(fā)現(xiàn)，pH7.4 條件下的累積釋放百分率均高于pH6.8，表明pH7.4 條件更有利于LYC 的釋放?！吨袊?guó)藥典》（2020 版）中規(guī)定藥物在微粒制劑中0.5 h 的釋放度不得超過(guò)40%[21]，由圖5（1）和（2）可知，三種M-LYC 中Total LYC 在含0.1% PEG-OA2不同pH 的釋放介質(zhì)中0.5 h 的累積釋放百分率最高為4.30%，遠(yuǎn)小于40%，符合此標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，說(shuō)明三種M-LYC 膠束均不存在突釋現(xiàn)象。

圖5 含0.1% PEG-OA2 的不同釋放介質(zhì)中三種M-LYC 及 LYC 原料中LYC 異構(gòu)體的體外釋放（±SD, n=3）Fig.5 In vitro release of LYC isomers from three M-LYC and LYC feedstocks in different release media containing 0.1% PEG-OA2（±SD, n=3）

在含0.1% PEG-OA2的pH6.8 和pH7.4 的釋放介質(zhì)中，三種M-LYC 中LYC 全反式和5Z 的體外累積釋放百分率見(jiàn)圖5（3）～（6）。13Z 和9Z 在釋放液中均未檢出，這可能因?yàn)槠浜枯^少且易發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化[25-26]。在含0.1% PEG-OA2的兩種釋放介質(zhì)中，All-E 72 h 累積釋放百分率比Total LYC 略高。mPEG45-PLA36-M-LYC、mPEG114-PLA90-M-LYC 中5Z 在24 h 后才在釋放介質(zhì)中被檢測(cè)到，而mPEG114-PLA180-M-LYC 中5Z 在48 h 后才在釋放介質(zhì)中被檢測(cè)到，這可能是由于5Z 在膠束中的含量較低，那么釋放出來(lái)的量更低，導(dǎo)致儀器未檢出，此外，5Z 擁有更強(qiáng)的疏水性，可能會(huì)與載體材料PLA 核心接觸更緊密[33]，不易釋放。而經(jīng)過(guò)72 h 后，5Z 在兩種釋放介質(zhì)中的累積釋放百分率均高于All-E，這可能是由于載體材料mPEG-PLA 在72 h 后已經(jīng)充分溶脹，5Z 溶解在滲入膠束核心的溶液中，在濃度梯度的驅(qū)使下，穿過(guò)溶脹的載體材料釋放出來(lái)[31]，同時(shí)也可能與All-E 部分異構(gòu)化為5Z 有關(guān)[11]。

表5 含0.1% PEG-OA2 的不同釋放介質(zhì)中三種M-LYC 及LYC 原料中 LYC 異構(gòu)體的72 h 累積釋放百分率（±SD，n=3）Table 5 Cumulative 72 h release percentages of LYC isomers from three M-LYC and LYC feedstocks in different release media containing 0.1% PEG-OA2 (±SD, n=3)

表5 含0.1% PEG-OA2 的不同釋放介質(zhì)中三種M-LYC 及LYC 原料中 LYC 異構(gòu)體的72 h 累積釋放百分率（±SD，n=3）Table 5 Cumulative 72 h release percentages of LYC isomers from three M-LYC and LYC feedstocks in different release media containing 0.1% PEG-OA2 (±SD, n=3)

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3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究采用了乳化-溶劑揮發(fā)法制備膠束，故乳化效果的好壞對(duì)其膠束的性質(zhì)有直接的影響，mPEGPLA 既是M-LYC 的載體材料，又可作為非離子型乳化劑使用。但由于乳液中靜電液滴排斥力不足，不能有效防止絮凝的發(fā)生，導(dǎo)致乳滴發(fā)生聚集。Aveyard等[23]研究發(fā)現(xiàn)其制備的僅有非離子表面活性劑的O/W 型乳液存在易于絮凝和分層等不穩(wěn)定現(xiàn)象，在加入陰離子表面活性劑十八烷基硫酸鈉或陽(yáng)離子表面活性劑十八烷基三甲基溴化銨后可有效防止絮凝。因此本研究通過(guò)添加少量?jī)尚噪x子型乳化劑大豆磷脂來(lái)改善乳化效果，以提高乳液的穩(wěn)定性。

載體材料的相對(duì)分子量大小、親/疏水鏈段的比例及M-LYC 各異構(gòu)體與載體材料的相互作用等因素均可造成三種M-LYC 中各異構(gòu)體的包封率有所不同；同一載體材料制備的M-LYC 各異構(gòu)體的包封率也有差異，這是由于在制備過(guò)程中溶劑、溫度變化等因素可能使LYC 發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致各異構(gòu)體的包封率產(chǎn)生差異，其包封率大小順序?yàn)?Z＞9Z＞13Z。Yu 等[27]也發(fā)現(xiàn)LYC 易于發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化，且在LYC 的順式異構(gòu)體中，5Z 比13Z 和9Z 具有更高的穩(wěn)定性，相對(duì)不易發(fā)生異構(gòu)轉(zhuǎn)化。

LYC 是一種高度疏水性的物質(zhì)，難溶于胃腸液中，因此人體對(duì)攝入的番茄紅素利用率很低[34]。通過(guò)比較LYC 原料與M-LYC 的體外釋放度，證明膠束可以提高LYC 的體外釋放度，從而預(yù)測(cè)其有望提高LYC 的生物利用度，這與Zhao 等[35]的研究相符。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)載體材料的相對(duì)分子量大小、親/疏水鏈段的比例均會(huì)影響LYC 的釋放，Sunoqrot 等[36]使用mPEG5K-PLA3K、mPEG5K-PLA7.8K為載體制備槲皮素膠束，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種膠束具有明顯不同的釋放速率。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在以不同mPEG-PLA 為載體包載生長(zhǎng)激素時(shí)，PLA 鏈段的比例增加會(huì)降低生長(zhǎng)激素的釋放速率[37]。因此，選擇合適嵌段比例的聚合物包載LYC 對(duì)于LYC 增溶控釋作用的發(fā)揮至關(guān)重要。人體攝入M-LYC 后，通常以被動(dòng)擴(kuò)散、胞吞等方式被直接吸收，最后由血液轉(zhuǎn)運(yùn)到全身器官[38-39]。因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了M-LYC 在模擬胃液、腸液、血液環(huán)境下（pH1.2、pH6.8、pH7.4）的體外釋放度。結(jié)果顯示三種M-LYC 在pH7.4 環(huán)境下更易釋放，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在pH1.2 條件下釋放液中未檢出LYC，這可能與LYC 在強(qiáng)酸性條件下不穩(wěn)定易被破壞有關(guān)[10]，建議將來(lái)可將M-LYC 制成腸溶制劑以避免其被胃酸破壞。

3.2 結(jié)論

以三種不同嵌段比例的mPEG-PLA 共聚物為載體材料制備了M-LYC，并對(duì)番茄紅素各異構(gòu)體的理化性質(zhì)及其增溶控釋作用進(jìn)行了研究，其中mPEG114-PLA90-M-LYC 中各異構(gòu)體及Total-LYC 的EE 最高（71.73%），其次為mPEG45-PLA36-M-LYC（65.04%），三種膠束中各順式異構(gòu)體包封率大小順序均為5Z＞9Z＞13Z；mPEG45-PLA36-M-LYC 粒徑最?。?64.63 nm）且Zeta 電位絕對(duì)值最大（-15.38 mV）。LYC 原料在不同釋放介質(zhì)中均未檢測(cè)出釋放，三種膠束在pH7.4 釋放介質(zhì)中的累積釋放百分率均高于pH6.8，且mPEG45-PLA36-M-LYC 的Total LYC 在不同釋放介質(zhì)中72 h 累積釋放百分率均最高；三種膠束中全反式番茄紅素（All-E）72 h 累積釋放百分率比Total LYC 略高，5Z 在初期無(wú)釋放，經(jīng)過(guò)72 h 后累積釋放百分率高于All-E。mPEG45-PLA36-M-LYC表現(xiàn)出良好的增溶效果和體外釋放特性，為番茄紅素膠束進(jìn)一步研究提供依據(jù)。