徐云,白立煒,王迪,耿銳娜,劉北彥

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 內分泌科,河南 新鄉(xiāng) 453100)

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)屬全身代謝內分泌系統(tǒng)疾病,長期高血糖狀態(tài)可破壞正常骨代謝平衡,誘發(fā)骨質疏松。據(jù)統(tǒng)計,T2DM患者骨質疏松發(fā)病率為37.80%,隨著時間推移可引起骨質疏松骨折,增加殘疾及死亡風險[1-2]。資料顯示,成骨細胞與破骨細胞間失衡是引起骨質疏松的關鍵環(huán)節(jié)[3]。脂質運載蛋白-2(lipocalin-2,LCN2)主要由成骨細胞合成,除參與糖脂代謝過程外,還可抑制干細胞骨化,參與骨質疏松發(fā)病過程[4]。護骨素/核因子κB受體活化因子配體(osteoprotegerin/receptoractivator of nuclear factor-κB ligand,OPG/RANKL)信號通路是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的骨代謝調節(jié)機制,其中OPG可抑制骨吸收,RANKL可刺激破骨細胞分化、成熟,抑制破骨細胞凋亡。動物實驗證實,OPG/RANKL信號通路可通過調控骨代謝參與骨質疏松發(fā)生發(fā)展過程[5]。本研究通過檢測T2DM患者LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子表達,分析其間關系,指導臨床防治。

1 對象與方法

1.1 臨床資料

選取2020年1月至2022年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的140例T2DM患者作為研究組,男80例,女60例;年齡60～85(72.51±3.38)歲;另按照1∶1比例納入140例同期健康體檢者作為對照組,男75例,女65例;年齡60～83(71.68±3.76)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(審批號2023312)。

1.2 選取標準

(1)納入標準:符合T2DM診斷標準[6],表現(xiàn)為多食、多飲、多尿、原因不明的體重下降,任意時間隨機血糖≥11.1 mmol·L-1;簽署知情同意書。(2)排除標準:肝、腎異常;伴影響骨代謝疾病;近3個月內骨折;1型糖尿病;近3個月內服用骨代謝藥物。

1.3 研究方法

1.3.1LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子

(1)兩組患者至少禁食8 h,采集入院當天清晨空腹肘靜脈血4 mL,均分為2份(各2 mL)。(2)LCN2測定:取2 mL血液標本行離心處理(2 500 r·min-1,15 min),采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清LCN2水平。(3)OPG/RANKL信號通路關鍵因子測定:取2 mL血液標本行離心處理(1 500 r·min-1,10 min),取上清液,加入等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)及淋巴細胞分離液,低溫離心20 min,吸出單個核細胞層,置于離心管,加3倍體積PBS洗滌,離心取上清液,加入PBS懸浮沉淀,獲得外周血單個核細胞,提取RNA,配置反應體系,以GAPDH作內參進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),反應體系:cDNA 2 μL,上游和下游引物各0.8 μL,滅菌蒸餾水6.4 μL,SYBR Green Master Mix 10 μL。引物序列:OPG上游5’GCTGTTCCTACCAAGATTATAC-3’,下游5’GAATCAGAACACAAGTCAGT-3’;RANKL上游5’GCGTACCTACAGACTATC-3’,下游5’GGACACCTGAATGCTAAT-3’;GAPDH上游5’AGGCCGGTGTGAGTATGTC-3’,下游5’TGCCTGCTTCACCACCTTGT-3’。反應條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40個循環(huán),重復3次后取OPG和RANKLmRNA均值,繪制熔曲線。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定OPG和RANKL蛋白水平。

1.3.2分組標準[7]

根據(jù)雙能X線骨密度儀測定骨密度T值,當骨密度T值≥-1提示骨量正常,-2.5<骨密度T值<-1提示骨量減少,骨密度T值≤-2.5提示骨質疏松。

1.3.3試劑與儀器

Microfuge 16臺式微量離心機購自貝克曼庫爾特國際貿易(上海)有限公司,酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購自北京力波生物科技有限公司,雙能X線骨密度儀購自淮安辛宇弘醫(yī)療科技有限公司,離心管購自美國Corning公司,RT-PCR試劑盒購自上海西格生物科技有限公司,PCR儀購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子

骨質疏松亞組LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白>骨量減少亞組>骨量正常亞組>對照組,OPGmRNA和OPG蛋白<骨量減少亞組<骨量正常亞組<對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子

2.2 LCN2與OPG/RANKL信號通路關鍵因子相關性

Pearson結果顯示,T2DM骨質疏松患者LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白呈正相關,與OPGmRNA和OPG蛋白呈負相關(P<0.05)。見表2。

表2 LCN2與OPG/RANKL信號通路關鍵因子相關性(r)

2.3 LCN2與OPG/RANKL信號通路關鍵因子交互作用

參照2.1中各指標平均值分層,LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白≥平均值、OPGmRNA和OPG蛋白≤平均值為暴露(﹢),反之為非暴露(-)。當LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白同時暴露,T2DM患者骨質疏松發(fā)生風險是非暴露的4.875、1.462倍;當LCN2、OPGmRNA和LCN2、OPG蛋白同時暴露,T2DM患者骨質疏松發(fā)生風險是非暴露的4.643、6.734倍。見表3。

表3 LCN2與OPG/RANKL信號通路關鍵因子交互作用

2.4 LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子聯(lián)合預測T2DM骨質疏松效能

以T2DM骨質疏松為陽性標本,骨量減少為陰性標本繪制ROC曲線,結果顯示LCN2聯(lián)合OPG/RANKL信號通路關鍵因子預測T2DM患者繼發(fā)骨質疏松的AUC為0.943(95% CI:0.877～0.980),優(yōu)于單純LCN2、OPGmRNA及OPG蛋白、RANKLmRNA、RANKL蛋白預測效能[AUC=0.753(95% CI:0.655～0.834),AUC=0.733(95% CI:0.634～0.817),AUC=0.750(95% CI:0.652～0.832),AUC=0.830(95% CI:0.741～0.898),AUC=0.747(95% CI:0.649～0.829)]。見表4。

表4 LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子預測T2DM骨質疏松效能比較

3 討論

T2DM患者受糖代謝異常、高齡因素雙重影響,骨質量受損,骨折風險高。文獻報道,相同骨密度下,T2DM患者骨折風險遠高于非T2DM人群,給其正常生活與工作帶來嚴重困擾[8-9]。骨密度測定是骨質疏松診斷的金標準,但骨密度數(shù)值僅能反映一種病理狀態(tài),臨床醫(yī)生需綜合分析全身狀況方能確診,在此基礎上尋求特異性強、靈敏度高的血清學指標更具現(xiàn)實意義。

3.1 LCN2與T2DM骨質疏松關系

研究證實T2DM患者血清LCN2表達高于健康體檢者[10-11],與本研究觀點相符,考慮原因與T2DM患者存在糖脂代謝異常、胰島素抵抗、肥胖、微炎癥狀態(tài)有關,下調LCN2有望維持葡萄糖穩(wěn)定,控制T2DM病情。動物實驗發(fā)現(xiàn),小鼠成骨細胞中LCN2表達量高于其他組織數(shù)倍,可通過影響骨吸收與骨形成之間平衡誘發(fā)骨質疏松[12]。國外研究表明,上調破骨細胞中LCN2表達可負向調控破骨細胞增殖、分化,增加骨質疏松發(fā)生風險[13]。吳靜等[14]研究發(fā)現(xiàn),高LCN2是老年T2DM合并骨質疏松的獨立危險因素。本研究結果顯示,骨質疏松亞組血清LCN2水平>骨量減少亞組>骨量正常亞組,且與骨密度呈正相關。可能機制為:高LCN2可通過下丘腦調控攝食行為,影響能量代謝和脂肪增長,間接激活成骨細胞分化成熟;高LCN2可削弱巨噬細胞集落刺激因子作用,加快骨鈣磷丟失,增加骨質疏松發(fā)生風險。ROC曲線顯示,LCN2單獨預測T2DM骨質疏松的AUC為0.75,說明LCN2在T2DM骨質疏松預測方面具有一定價值。需注意的是,不同生理病理狀態(tài)下,LCN2表達和功能存在一定差異,可能會引起部分數(shù)據(jù)偏倚,故建議與其他指標聯(lián)合應用。

3.2 OPG/RANKL信號通路關鍵因子與T2DMG骨質疏松關系

隨著分子生物學技術不斷提高,越來越多研究發(fā)現(xiàn)細胞信號轉導通路途徑參與T2DM、骨質疏松發(fā)生發(fā)展[15]。證據(jù)表明,OPG/RANKL信號通路與Notch信號通路交叉作用可共同影響胰島β細胞活性與功能,增加血糖水平,促進T2DM病情進展[16]。以往研究指出,糖尿病患者血清OPG、RANKL表達異常,且與胰島素抵抗指數(shù)、糖化血紅蛋白相關[17]?；诖?本研究初步分析T2DM患者和健康體檢人群外周血單個核細胞中OPG、RANKLmRNA和OPG、RANKL蛋白表達,發(fā)現(xiàn)研究組RANKLmRNA和RANKL蛋白高于對照組,OPGmRNA和OPG蛋白低于對照組,這一結果提示T2DM發(fā)生與OPG/RANKL信號通路激活密切相關。另有研究表明,OPG/RANKL信號通路激活是骨質疏松發(fā)生的重要分子生物學機制[18]。RANKL是迄今唯一能直接刺激破骨細胞發(fā)育的細胞因子,OPG是RANKL天然誘導受體,生理狀態(tài)下呈動態(tài)平衡,一旦兩者間平衡被打破,可造成進行性骨量丟失、骨強度降低,從而導致骨質疏松。研究證實,高糖狀態(tài)可下調OPG,上調RANKL,影響骨化,但當前研究集中于小鼠實驗[19-20],鮮見其在T2DM骨質疏松患者中研究報道。本研究對此展開討論分析發(fā)現(xiàn),骨質疏松亞組RANKLmRNA和RANKL蛋白>骨量減少亞組>骨量正常亞組,OPGmRNA和OPG蛋白<骨量減少亞組<骨量正常亞組,這一結果為解釋OPG/RANKL信號通路可能存在的調控機制提供依據(jù),有利于深入研究T2DM骨質疏松發(fā)病機制。長期高血糖及老齡化可引起免疫系統(tǒng)功能持續(xù)低度活化,生成過量炎癥細胞,增加RANKL含量,刺激OPG/RANKL信號通路,作用于破骨細胞,減少骨形成,最終形成骨質疏松。ROC曲線顯示,RANKL、OPGmRNA和RANKL、OPG蛋白均具有T2DM骨質疏松預測效能,但仍存在提升空間。

3.3 LCN2、OPG/RANKL信號通路關鍵因子聯(lián)合預測T2DM骨質疏松效能

本研究擬分析LCN2、RANKLmRNA和LCN2、RANKL蛋白、OPGmRNA和OPG蛋白聯(lián)合預測T2DM骨質疏松效能,AUC為0.943,高于單一指標預測效能,可幫助準確有效識別T2DM骨質疏松,指導臨床防治,延緩病情進展。進一步研究發(fā)現(xiàn),LCN2不僅與OPG/RANKL信號通路關鍵因子存在相關性,還存在交互作用,該結果說明兩者存在協(xié)同效應,可共同促進骨質疏松發(fā)生發(fā)展,密切監(jiān)測LCN2及OPG/RANKL信號通路關鍵因子變化有助于協(xié)同預防骨質疏松發(fā)生,提高骨質疏松防治水平。

4 結論

T2DM患者LCN2、OPG、RANKLmRNA和LCN2、OPG、RANKL蛋白呈異常表達,且LCN2與OPG、RANKLmRNA和OPG、RANKL蛋白存在交互作用,聯(lián)合檢測有助于提高T2DM骨質疏松預測效能,為臨床診治提供有利依據(jù)。但本研究屬單中心、小樣本量研究,可能限制研究結果泛化,仍需進一步研究證實。