繆濤聲 黃夢(mèng)芬 陳明榆 鄭鴻銘 李逸婷 胡芝凡 莫喬蘭 邱澤鑫 陳 斌

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東省廣州市 510006;2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科,廣東省廣州市 510405)

結(jié)直腸癌是全球第三大癌癥,也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。我國(guó)2015年癌癥中心數(shù)據(jù)顯示,結(jié)直腸癌位于惡性腫瘤死亡譜第五位、發(fā)病譜第三位[2]。近年來(lái),我國(guó)70歲以上人群的結(jié)直腸癌疾病負(fù)擔(dān)明顯增加,中國(guó)老年人群的結(jié)直腸癌防控形勢(shì)嚴(yán)峻,需要采取相關(guān)措施以減輕其疾病負(fù)擔(dān)[3]。結(jié)直腸癌的早期癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、便血[4-5],在中醫(yī)中證屬“血證”中的下焦出血,在中醫(yī)古籍中常被稱為“下血”“痣血”等。如今中醫(yī)藥已被廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療[6],從清熱解毒、益氣健脾、滋補(bǔ)肝腎等多角度提供新的治療方案[7]。地榆記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,有涼血止血、解毒斂瘡之效,主要用于治療便血、痣血等,目前已有研究表明地榆的水提取物可通過(guò)阻滯Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路起到治療結(jié)直腸癌的作用[8]。然而,關(guān)于地榆治療結(jié)直腸癌的主要成分、作用靶點(diǎn)及其他的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過(guò)預(yù)測(cè)中藥所含化合物的靶點(diǎn)和藥理作用,構(gòu)建藥物-基因-疾病網(wǎng)絡(luò),挖掘其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制[9]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索地榆治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制,為地榆的臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 平臺(tái)資料與軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/),藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database,TTD;http://db.idrblab.net/ttd/),OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/),GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/),STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/),Metascape線上軟件(https://metascape.org/),Cytoscape 3.7.2軟件,GraphPad Prism 9軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 地榆有效活性成分的篩選及其作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè):登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),以“地榆”為關(guān)鍵詞,設(shè)置篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18,檢索地榆的有效活性成分。再利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索有效活性成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。最后在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中,將“Popular organisms”限定為“Human”,“Status”選擇“Reviewed(Swiss-Prot)”,將相關(guān)靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名,并使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 收集結(jié)直腸癌的相關(guān)靶點(diǎn):以“Colorectal Cancer”為關(guān)鍵詞,在TTD、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn),將靶點(diǎn)導(dǎo)入Microsoft Excel表格匯總,刪除重復(fù)靶點(diǎn)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2.3 地榆有效活性成分作用靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)共同靶點(diǎn)的獲取:將地榆有效活性成分的作用靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集,即為地榆治療結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn),利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將共同靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名,繪制韋恩圖。

1.2.4 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)和“中藥-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析:將篩選得到的地榆有效活性成分及其作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),并分析地榆有效活性成分的度值。將共同靶點(diǎn)信息輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),蛋白種屬設(shè)置為“Homo Sapiens”,得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理,得到PPI網(wǎng)絡(luò),即“中藥-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 富集分析:針對(duì)共同靶點(diǎn),采用Metascape線上軟件進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,將蛋白種屬設(shè)置為“Homo Sapiens”,其中GO通路包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能。將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理后得到氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 地榆的有效活性成分及其作用靶點(diǎn) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到地榆有效活性成分共41個(gè),根據(jù)篩選條件最終篩選得到有效活性成分13個(gè)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索上述13個(gè)成分的作用靶點(diǎn)(表1),因甜茶皂甙R1、3-O-沒(méi)食子酰原花青素、棕兒茶素B-3、4,甲基-6-O-沒(méi)食子酰-β-D-吡喃葡萄糖苷在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)相關(guān)作用靶點(diǎn)信息,為減少數(shù)據(jù)異質(zhì)性,最終納入地榆9個(gè)有效活性成分,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名并刪除重復(fù)項(xiàng)后,最終得到154個(gè)地榆有效活性成分的作用靶點(diǎn)。構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(圖1),其中紅色菱形節(jié)點(diǎn)為地榆的有效活性成分,節(jié)點(diǎn)越大代表度值越大,根據(jù)度值從大到小將成分按逆時(shí)針順序排列,藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)為有效活性成分的作用靶點(diǎn),外環(huán)是度值為0～1的靶點(diǎn),中環(huán)是度值為2～3的靶點(diǎn),內(nèi)環(huán)是度值>3的靶點(diǎn)。

表1 地榆的有效活性成分信息

圖1 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.2 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)及地榆治療結(jié)直腸癌的靶點(diǎn) 通過(guò)檢索TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù),共篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)1 908個(gè)。將其與地榆有效活性成分的154個(gè)作用靶點(diǎn)取交集,共獲得94個(gè)共同靶點(diǎn),繪制韋恩圖(圖2),其中藍(lán)紫色圓圈代表地榆有效活性成分的作用靶點(diǎn),黃色圓圈為結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn),交集部分為地榆治療結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)。

圖2 韋恩圖

2.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),直觀展示地榆有效活性成分與結(jié)直腸癌靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)程度與相互作用關(guān)系,見(jiàn)圖3。圖中橙色六邊形節(jié)點(diǎn)代表地榆,黃色正方形節(jié)點(diǎn)代表結(jié)直腸癌,紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表地榆的有效活性成分,藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表共同靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,得到度值排名前3的有效活性成分為槲皮素、山柰酚與β-谷甾醇。

圖3 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建地榆治療結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖4)。在該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點(diǎn)的顏色越深、越靠近中心、直徑越大代表其度值越高,且同一圓圈上度值從大到小按逆時(shí)針順序排列;每條邊代表節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)系,線條越多提示關(guān)聯(lián)度越大。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)的平均度值為37,度值位于前20的靶點(diǎn)包括腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase,AKT)1、Caspase-3、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)等(見(jiàn)圖5),這些靶點(diǎn)可能是地榆治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)中度值位于前20的靶點(diǎn)

2.5 富集分析結(jié)果 采用Metascape網(wǎng)站對(duì)94個(gè)地榆治療結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。94個(gè)共同靶點(diǎn)共涉及1 387個(gè)生物學(xué)過(guò)程、55個(gè)細(xì)胞組分、116個(gè)分子功能,按-lgP值從小到大進(jìn)行排序,選取排名前20的條目進(jìn)行可視化分析,其中涉及的生物學(xué)過(guò)程主要有細(xì)胞群增殖的負(fù)調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)等,涉及的細(xì)胞組分主要有膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、染色體區(qū)域等,涉及的分子功能主要有激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、內(nèi)肽酶活性、核受體活性等。94個(gè)共同靶點(diǎn)共富集至173條通路,根據(jù)-lgP值大小篩選排名前20的主要通路,包括癌癥信號(hào)通路、磷脂?；?-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信號(hào)通路等。見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG通路富集分析與GO功能富集分析結(jié)果圖

3 討 論

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年升高,已成為全球第三大高發(fā)癌癥,是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。近年來(lái),隨著生活習(xí)慣的改變,亞洲人群結(jié)直腸癌的發(fā)病率也越來(lái)越高[10],我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率與病死率均呈上升趨勢(shì),是威脅我國(guó)人民健康的重要因素之一[11]。目前,結(jié)直腸癌的主要治療方法有手術(shù)治療、放療、化療等,但這些治療方法存在治療費(fèi)用較高、副作用較大、患者依從性較差等缺點(diǎn)。中醫(yī)藥因其具有簡(jiǎn)便性、安全性等特點(diǎn),已成為結(jié)直腸癌的治療方法之一。朱月伊等[12]發(fā)現(xiàn),四君子湯可通過(guò)降低程序性死亡受體1/程序性死亡配體1的表達(dá),抑制自然殺傷細(xì)胞的活性與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。還有研究顯示,復(fù)方苦參注射液對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用,并可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。

地榆藥性苦、酸、澀,微寒,有涼血止血、收斂止血、解毒斂瘡之功效。《本草約言》中提到地榆“性沉寒,惟治下焦”,因此地榆常被用于治療下焦出血。結(jié)直腸癌的主要癥狀為腹痛、便血,因此有醫(yī)家提出采用中藥治療結(jié)直腸癌時(shí)可配伍地榆[14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明地榆的水提取物可通過(guò)阻滯Wnt/β-catenin信號(hào)通路起到治療結(jié)直腸癌的作用[8],但其潛在的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)地榆治療結(jié)直腸癌的有效活性成分及其作用機(jī)制進(jìn)行研究,最終共篩選出9個(gè)地榆有效活性成分,其中度值排名前3的有效活性成分為槲皮素、山柰酚與β-谷甾醇。研究表明,槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smad3蛋白信號(hào)通路,抑制下游8號(hào)染色體上的MYC的表達(dá),從而抑制結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。在結(jié)直腸癌Kirsten大鼠中,肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)和B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-Raf proto-oncogene,serine/threonine kinase,BRAF)基因發(fā)生突變,槲皮素可同時(shí)作用于KRAS和BRAF,從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡[16]。山柰酚為黃酮醇類化合物,提高山柰酚的攝入量可以降低結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌的發(fā)生率[17-18]。有學(xué)者利用下一代測(cè)序等技術(shù)發(fā)現(xiàn)山柰酚可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲,同時(shí)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[19]。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到地榆治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn),包括TP53、AKT1、TNF等。TP53基因是17號(hào)染色體上的抑癌基因,其編碼的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡方面,以及在癌癥易感性及癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[20-21]。TP53基因突變可引起高頻率的DNA損傷,造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI),促進(jìn)癌癥的發(fā)生[22]。TP53功能的喪失還可以促進(jìn)腸道細(xì)胞的增殖,并使其細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控,這也是結(jié)直腸癌發(fā)生的核心機(jī)制[23]。有研究顯示,TP53基因的突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生顯著相關(guān)[24]。Nakayama等[25]發(fā)現(xiàn),TP53基因的突變可通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)核因子κB及癌癥相關(guān)通路的激活,促進(jìn)腸上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生,加速結(jié)直腸癌的進(jìn)展,提示TP53功能缺失是結(jié)直腸癌發(fā)生的潛在危險(xiǎn)因素之一。AKT1是PI3K信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),PI3K/AKT信號(hào)通路可傳遞抗凋亡信號(hào),并與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝及腸上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)[26]。有研究顯示AKT1的過(guò)度活化可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化及代謝等正常生理功能紊亂,而腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖有助于其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[27]。Agarwal等[26]的研究表明,結(jié)直腸癌小鼠中可伴隨AKT1的活化及下游致癌信號(hào)通路的激活,抑制AKT1的磷酸化可能是抑制結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展的重要途徑。TNF是參與核因子κB 信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,核因子-κB信號(hào)通路廣泛參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展,在結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28-29],因此TNF也是防治結(jié)直腸癌的重要靶點(diǎn)[29]。

本研究的GO功能富集分析結(jié)果顯示,地榆治療結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過(guò)程主要有細(xì)胞群增殖的負(fù)調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)等;涉及的細(xì)胞組分主要有細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、染色體區(qū)域等;涉及的分子功能主要有激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、內(nèi)肽酶活性、核受體活性等。腫瘤細(xì)胞遷移是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié),膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、染色體區(qū)域等皆是細(xì)胞信號(hào)傳遞的重要位點(diǎn),其可能與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[30]。蛋白激酶活性、激酶結(jié)合與蛋白質(zhì)的磷酸化密切相關(guān),結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)分析與GO中的生物學(xué)過(guò)程分析,我們推測(cè)地榆可能通過(guò)調(diào)節(jié)TP53、AKT等蛋白的磷酸化,激活PI3K/AKT等信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等,從而達(dá)到治療結(jié)直腸癌的目的。

本研究的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,地榆治療結(jié)直腸癌涉及的通路主要有癌癥信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等。PI3K/AKT信號(hào)通路是結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵通路。Duan等[31]發(fā)現(xiàn),次黃苷單磷酸脫氫酶2可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Jiang等[32]的研究表明,結(jié)直腸癌患者血清環(huán)狀RNA IL4R水平較正常人升高且與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA IL4R可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展的作用?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,有學(xué)者嘗試通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路治療結(jié)直腸癌,如Wei等[33]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制因子同源物4可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路,從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促使其發(fā)生自噬。本研究結(jié)果顯示,地榆治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)AKT1、EGFR及IL-6等均是PI3K/AKT信號(hào)通路中的一部分,因此PI3K/AKT信號(hào)通路可能是地榆治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵通路。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),地榆的有效活性成分之一槲皮素可以通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗癌作用[34-35]。Na等[36]發(fā)現(xiàn),槲皮素在抑制PI3K/AKT磷酸化的同時(shí)可上調(diào)Caspase-3和B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而發(fā)揮治療結(jié)腸癌的作用。

綜上所述,地榆中的多種有效活性成分可能通過(guò)TP53、AKT1、TNF、EGFR、IL-6等靶點(diǎn)來(lái)作用于膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、染色體區(qū)域等細(xì)胞組分,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的磷酸化、細(xì)胞增殖及凋亡等分子功能,以及調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路等生物過(guò)程,從而發(fā)揮治療結(jié)直腸癌的作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)地榆治療結(jié)直腸癌的潛在機(jī)制進(jìn)行研究,預(yù)測(cè)地榆治療結(jié)直腸癌的可能作用通路,為地榆治療結(jié)直腸癌的實(shí)驗(yàn)研究提供了方向。