姚 艷，逯金瑤，吳耀祥，吳慧，朱晉梅，宋林，唐松元，李 立

（湖南省生物多樣性保護中心，湖南長沙 410004）

馬來穿山甲（Manis javanica） 屬于鱗甲目（Pholidota）鯪鯉科（Manidae）鯪鯉屬（Manis）[1]，是全球現(xiàn)存的8 種穿山甲之一，世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）將其列為極危（CR）物種。亞洲分布有4 種穿山甲：中華穿山甲（M. pentadactyla）、馬來穿山甲（M. javanica）、印度穿山甲（M. crassicaudata）、菲律賓穿山甲（M. culionensis）；其余4 種分布在非洲，分別是：大穿山甲（M. gigantea）、樹穿山甲（M.tricuspis）、南非穿山甲（M. temminckii）以及長尾穿山甲（M. tetradactyla）。國內中華穿山甲主要分布于長江以南，云南省西南地區(qū)分布有少量印度穿山甲和馬來穿山甲，穿山甲野外食物較單一，主要以白蟻和螞蟻為食。由于穿山甲的肉與鱗片具有被吹捧起來的經(jīng)濟價值，致使其成為世界上遭受非法貿(mào)易最嚴重的哺乳動物。大規(guī)模的非法狩獵與非法貿(mào)易導致野生穿山甲種群數(shù)量銳減。除此之外，棲息地的破壞也對穿山甲的野外種群數(shù)量有很大影響。2016 年，在第17 屆國際貿(mào)易公約大會上，穿山甲科所有物種均被列入CITES 附錄Ⅰ；其中，中華穿山甲、馬來穿山甲被升級為極度瀕危等級，另外6種穿山甲也均升級為瀕危等級。我國把國內分布的3 種穿山甲均列為國家I 級重點保護動物，列為《中國瀕危動物紅皮書·獸類》中易危種（V）。

國內外學者們都是通過生態(tài)學、行為學和疾病等方面對圈養(yǎng)和野生穿山甲進行研究[2-5]。本研究從中心救護的馬來穿山甲的脾臟、肝臟、腎臟等內臟器官樣品無菌分離培養(yǎng)獲得單一菌株，對分離菌株進行16Sr DNA 鑒定和序列分析，最終確定致病菌為葡萄球菌，同時對分離菌進行藥敏實驗，以期對馬來穿山甲葡萄球菌病的診治提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品來源

患病馬來穿山甲為中心救護個體，發(fā)病馬來穿山甲主要表現(xiàn)為食欲不振、精神沉郁、鼻腔有黏液分泌物、呼吸不暢、等癥狀。病馬來穿山甲死亡后送實驗室進行病理剖檢。

1.2 試劑和設備

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、K-B 法藥敏紙片（25 種）、細菌微量生化鑒定管、0.5 麥氏比濁管、DNA 提取試劑盒、2000DNAMarker、PCR 反應預混酶、50× TAE、瓊脂糖、生化培養(yǎng)箱、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、顯微鏡、水浴恒溫蕩擋器、純水儀、超凈臺、電子天平、抗生素藥敏片等。

2 方法

2.1 病原分離培養(yǎng)

將無菌采集死亡馬來穿山甲的肝臟、肺臟、腎臟等臟器接種于營養(yǎng)肉湯增菌；取24 h 的增菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板進行純化培養(yǎng)；純化菌落用高溫灼燒后的接種環(huán)蘸取少量病變組織液接種巧克力瓊脂平板、血瓊脂平板培養(yǎng)基表面，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h 后，涂片革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 細菌16S rDNA 基因序列擴增

將鏡檢疑似菌落按照細菌基因組DNA 小量提取試劑盒說明書的步驟提取分離菌的DNA。以分離菌的基因組為模板，利用設計的16S rDNA 通用引物在PCR 儀內進行目的基因的擴增。反應條件：94℃變性4 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72℃10 min。 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。將特異性擴增產(chǎn)物送至通用生物實驗公司測序，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行對比分析。通用引物為：16SrRNA-27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SrRNA-1492R:5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

2.3 藥敏試驗

挑取純培養(yǎng)的菌落到滅菌生理鹽水，調節(jié)其濃度為0.5 麥氏單位。滅菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布在普通瓊脂平板上，菌液吸附數(shù)分鐘后，再用滅菌鑷子將藥敏紙片均勻貼在平板的表面，37℃培養(yǎng)24 h 后，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，游標卡尺測定抑菌圈直徑并記錄，測量3 次取平均值。結合2013 版美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）判讀標準，將所有菌株試驗結果分為敏感（S）、中度敏感（I）、耐藥（R）。

3 結果

3.1 剖檢變化

對患病馬來穿山甲剖檢時，發(fā)現(xiàn)個體肺臟彌漫性充血、出血，肌肉樣變，肺間質增寬，肝臟、腎臟有出血點（圖1～圖3）。

圖2 腎臟病理變化Fig.2 Pathologicalexamination of spleen

圖3 肝臟病理變化Fig.2 Pathologicalexamination of liver

3.2 培養(yǎng)特性

菌株在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，形成灰白色、不透明，表面光滑，大而突起、邊緣整齊的小菌落（圖4）。革蘭染色鏡檢菌株呈紫色，單個、雙或串狀的革蘭陽性菌（圖5）。

圖4 分離菌株培養(yǎng)形態(tài)Fig.4 Colony morphology of bacterialisolates

圖5 分離菌株革蘭氏染色觀察Fig.5 Grain staining observation of bacterialisolates

3.3 分離株16S rDNA 鑒定

用細菌通用引物對其16S rDNA 基因序列進行擴增，凝膠電泳結果（圖6）所示，該菌株16S rDNA基因序列PCR 產(chǎn)物大小約1500 bp。將純化菌液送往測序公司，測序結果在GenBank 中進行搜索、比對，結果顯示與葡萄球菌（OM758218.1、MT409899.1、MT4099900.1、LC437030.1、MG798679.1、MG798672.1、KT372844.1、MH179469.1、MK43941.1）聚為一大枝，有可能為同一菌株。

圖6 分離株16SrDNA 的PCR 擴增Fig.6 PCR amplification of16SrDNAgene from bacterialisolates

3.4 藥敏試驗結果

對分離菌株進行藥敏試驗（結果見表1），參考美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）檢定所的紙片瓊脂擴散標準判定結果。由表1 可知，分離菌株對丁胺卡那霉素、新霉素高敏感，頭孢塞肟、頭孢他啶中度敏感，對青霉素、恩諾沙星、卡拉霉素、環(huán)丙沙星等耐藥。

表1 分離菌的藥敏試驗結果

4 結論與討論

穿山甲是哺乳動物綱中最小的類群之一，主要分布于我國南部、尼泊爾和中南半島等地。目前，對馬來穿山甲體內細菌的研究較少，何梅紅[7]等研究報道馬來穿山甲腸道細菌有變形桿菌屬、埃希氏菌屬- 志賀氏菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬、普羅威登斯菌屬、葡萄球菌屬等細菌，劉根[8]等研究報道死亡的馬來穿山甲肺臟分離出奇異變形桿菌。

圖7 遺傳進化樹（注：sample3 為本試驗分離株）Fig.7 Phlyogenetic tree

本研究從死亡馬來穿山甲的脾臟、肝臟、腎臟等內臟器官樣品中，分離出致病菌，通過形態(tài)學特性、培養(yǎng)特性、分離株16S rDNA 鑒定結果，證明分離的菌株為葡萄球菌。葡萄球菌是人與動物機體中的一種重要病原菌，可能會誘發(fā)口腔黏膜、皮膚與鼻腔等組織感染，在獸醫(yī)臨床上通常會表現(xiàn)為皮膚、軟質感染，誘發(fā)牛羊乳腺炎，很可能會造成動物病死。本研究通過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，該分離株對丁胺卡那霉素、新霉素高敏感，頭孢塞肟、頭孢他啶中度敏感，對青霉素、恩諾沙星、卡拉霉素、環(huán)丙沙星等耐藥。徐春萍等[9]、徐國[10]、王麗坤[11]等結果也表明，丁胺卡娜對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，而對頭孢哌酮、頭孢噻肟、恩諾沙星、鏈霉素中度敏感。因此，在治療葡萄球菌感染的臨床治療中應根據(jù)藥敏試驗結果采取聯(lián)合用藥、合理用藥，從而有效提高藥物的治療效果，避免由于應用無效藥物對馬來穿山甲產(chǎn)生不良反應。 □