肖博仁，蔣芬芳

（1.湖南佳和智農(nóng)技術(shù)咨詢有限公司，湖南長沙 410100；2.長沙縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410100）

隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的養(yǎng)殖場向集約化、規(guī)?；l(fā)展，生豬單場飼養(yǎng)規(guī)模節(jié)節(jié)攀升。加之國家及民眾對食品安全的重視，飼料禁抗措施的實施，豬場細菌性病原越來越復雜，細菌性疾病對豬場造成的經(jīng)濟損失越來越嚴重[1-3]。

豬鏈球菌病是一種由鏈球菌感染引發(fā)的以腦膜炎、關(guān)節(jié)炎為主要特征，能夠?qū)е禄疾∝i出現(xiàn)敗血癥、跛行、共濟失調(diào)、精神沉郁及角弓反張等臨床癥狀的人畜共患病[4-6]。2022 年5 月底，湖南郴州某規(guī)?；i場保育仔豬發(fā)生異常情況，通過對病豬采樣做細菌分離鑒定，對分離菌株進行PCR 檢測及16S 基因測序，最后診斷為豬鏈球菌病?，F(xiàn)將診斷經(jīng)過總結(jié)如下，旨為豬鏈球菌病的防控及治療提供參考依據(jù)。

1 發(fā)病情況

2022 年5 月，湖南郴州某規(guī)?；i場保育仔豬斷奶前健康狀態(tài)良好，無明顯異常情況。轉(zhuǎn)入保育舍后半個月開始出現(xiàn)毛色粗亂，扎堆等臨床癥狀，隨之偶見關(guān)節(jié)腫大及零星急性倒地死亡的現(xiàn)象。部分病豬死亡前表現(xiàn)為顫抖、動作失調(diào)，倒地后四肢劃水狀。在同年齡段保育仔豬中死亡率約高出2%。

2 實驗室診斷

2.1 細菌分離

取病殘豬的腦脊液、鼻甲、心臟、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等19 份臟器（圖1）用酒精棉球點燃消毒病料表面，無菌手術(shù)刀切口，接著用經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)蘸取病料內(nèi)部組織后，同時無菌劃線接種于THB 培養(yǎng)基（含10 μg/mL 多黏菌素E、15 μg/mL 萘啶酮酸和5%新生牛血清）。

圖1 各病料組織樣品

37℃恒溫培養(yǎng)24 h，在THB 平板上呈現(xiàn)圓形、微凸、表面光滑、濕潤黏滯、邊緣整齊、灰白半透明的單個菌落，假定為疑似菌落（圖2）。

圖2 劃線接種培養(yǎng)基

2.2 分離純化

挑取單個疑似菌落接種于THB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌落和液體培養(yǎng)物分別進行革蘭染色。

鏡檢結(jié)果顯示：疑似菌落培養(yǎng)物經(jīng)革蘭染色呈紫色，視野中以單個或雙卵圓形為主；液體培養(yǎng)物革蘭染色也呈紫色，3～5 個菌體形成短鏈狀（圖3、圖4）。

圖3 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

圖4 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.3 PCR 鑒定

以分離純化菌株為模板，使用豬鏈球菌特異性引物，對細菌進行分離鑒定。首先使用豬鏈球菌gdh 鑒定引物進行鑒定，共檢出11 例陽性（圖5），再使用recN 鑒定引物進行復檢，共檢出8 例陽性（圖6）。

圖5 gdh 鑒定引物鑒定結(jié)果

圖6 recN 鑒定引物鑒定結(jié)果

2.4 疑似菌株測序

樣品在平板上培養(yǎng)后，選取形態(tài)不同的其他疑似菌落，采用豬鏈球菌16S 通用引物參照PCR 方法常規(guī)操作，PCR 擴增產(chǎn)物送華大基因測序鑒定。將測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中比對分析，發(fā)現(xiàn)與豬鏈球菌的同源性為97.8%和99%。根據(jù)測序結(jié)果分析最可能致病菌為豬鏈球菌，并分別命名為HNBJ 和HNNJ。結(jié)果見表1。

表1 樣品分離菌株信息

2.5 藥敏試驗MIC 結(jié)果

根據(jù)美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）推薦的微量稀釋方法測定各種抗菌藥物對豬鏈球菌的MIC。將培養(yǎng)好的菌液用MH 培養(yǎng)基調(diào)至0.5 個麥氏濁度單位進行測定。細菌培養(yǎng)物放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后觀察并記錄結(jié)果（表2）。（耐藥折點參考CLSI 和EUCAST）。

表2 2 株豬鏈球菌對18 種抗菌藥的耐藥情況

3 討論與分析

本次試驗研究從湖南郴州某豬場發(fā)病保育豬的鼻腔拭子、鼻甲、腦脊液、扁桃體、淋巴結(jié)分離到大量疑似豬鏈球菌菌落，通過單個菌落的純化鑒定、PCR 檢測及16S 測序鑒定，證明將本次保育仔豬急性倒地死亡診斷為豬鏈球菌病，并分離得到兩株豬鏈球菌，分別命名為HNBJ、HNNJ。

豬鏈球菌病是一種由鏈球菌感染引發(fā)的熱性、傳染性的人畜共患病，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，對養(yǎng)豬業(yè)及消費者危害較大。養(yǎng)豬場在預(yù)防和治療豬鏈球菌病的首選措施是抗生素，但是抗生素的濫用導致細菌耐藥問題日趨嚴重，不僅給豬場細菌性疾病增加了防控難度，還對公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅。本試驗研究分離的兩株豬鏈球菌對青霉素、紅霉素、替米考星、泰拉菌素、四環(huán)素、多西環(huán)素、泰妙菌素、克林霉素、林可霉素、壯觀霉素、慶大霉素、恩諾沙星等多重耐藥；Tan 等[7]對江西省分離的107 株豬鏈球菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示107 株豬鏈球菌三重耐藥率高達100%，五重耐藥率為30.84%，六重耐藥率為24.3%；韓寧等[8]對廣東省分離的40 株豬鏈球菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示40 株豬鏈球菌多重耐藥率高達87.5%；劉昭穎等[9]浙江省某地區(qū)分離的68 株豬鏈球菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示68 株豬鏈球菌均為多重耐藥性。

隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn)，豬鏈球菌的耐藥問題更加嚴峻。筆者認為單純依賴抗生素是很難長期、徹底地解決豬場鏈球菌病的防控問題，必須采取綜合措施。首先，應(yīng)該關(guān)注欄舍內(nèi)的溫度、濕度、飼養(yǎng)密度及空氣質(zhì)量等，給生豬提供一個舒適的生長環(huán)境；其次，提高豬場內(nèi)生豬的整體健康水平，打好基礎(chǔ)性疫苗，控制免疫抑制因素，如發(fā)霉飼料、免疫抑制性疾病、長期的慢性應(yīng)激等；再次，做好豬舍內(nèi)的衛(wèi)生清掃及消毒工作，減少豬場環(huán)境中的病原載量；然后，做好豬場內(nèi)生豬的創(chuàng)傷管理，小豬合群打架的皮膚創(chuàng)口、閹割創(chuàng)口、斷臍創(chuàng)口及咬耳咬尾等破損傷口及時使用碘制劑或者紫藥水等消毒，防止細菌經(jīng)傷口進入生豬體內(nèi)；最后，豬場應(yīng)注意合理使用抗生素藥物。盡量杜絕漫無目的、毫無依據(jù)的抗生素藥物保健，防止本場細菌過快地產(chǎn)生耐藥性，同時避免抗生素藥物給生豬帶來不必要的毒副作用。 □