李明偉 肖慧芳 馮玉龍

1河南省職工醫(yī)院藥學部，鄭州 450002；2河南省職工醫(yī)院老年醫(yī)學二科，鄭州 450002

肺炎是由支原體、細菌、病毒等感染引起的肺實質(zhì)炎癥，臨床表現(xiàn)為胸悶、鼻塞、咳嗽。機體細胞因子、凝血功能淋巴細胞亞群與肺炎的發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)，但是其中的關(guān)系尚不清楚［1-2］。因此，明確肺炎與機體炎性反應、凝血纖溶功能、淋巴細胞亞群的關(guān)系具有重要的臨床意義。本文利用流式細胞儀與血栓彈力圖測定不同感染程度的肺炎患者凝血功能、細胞因子、淋巴細胞亞群的指標變化情況，探討凝血功能、細胞因子、淋巴細胞亞群與肺炎嚴重程度的相關(guān)性，為臨床診療肺炎提供參考。

資料與方法

1.一般資料

本文為試驗研究。選取2021年1月至2022年12月于河南省職工醫(yī)院就診的肺炎患者80例，根據(jù)急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ（APACHEⅡ）評分［3］，其中危重型及以上（APACHEⅡ評分≥12分）36例，非危重型（APACHEⅡ評分＜12分）44例，男42例、女38例，年齡30～70（52.65±7.32）歲，病程2～14（5.58±1.32）d；另選擇健康中心體檢者50例作為對照組，男27例、女23例，年齡（55.21±5.53）歲。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）符合肺炎診斷標準；（3）所有患者均簽署知情同意書。排除標準：（1）心腦血管、肝、腎功能嚴重障礙患者；（2）患有造血功能障礙、出血性疾病、腫瘤患者；（3）2周內(nèi)使用抗凝藥物［4］。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)河南省職工醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

2.方法

（1）患者入院確診肺炎后，收集受試者清晨空腹靜脈血，進行凝血功能、細胞因子檢測及淋巴細胞亞群檢測，并比較相關(guān)變化，包括白細胞介素（IL）-4、IL-6、IL-10、IL-1β、干擾素-γ（IFN-γ）、凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間、纖維蛋白原水平α角、血小板功能最大振幅（maximum amplitude，MA）、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+［5-6］；通過q-PCR檢測口咽拭子，下呼吸道7項，確定肺炎感染菌株。對照組于清晨空腹收集靜脈血做對照。（2）標本采集和處理。選用促凝管抽取靜脈血用于機體細胞因子的檢測［7］，選用枸櫞酸抗凝管抽取2 ml靜脈血用于血凝功能的檢測，選用EDTA抗凝管用于淋巴細胞亞群的檢測［8］。細胞因子檢測：利用流式細胞儀測定細胞因子的變化情況，將促凝管血離心3 000 r/min，5 min，離心機半徑85 mm。取50 μl上清于流式管后加入50 μl捕獲微球，室溫避光孵育1 h后加入100 μl熒光標記抗體，再次室溫避光孵育1 h，磁分離1～2 min后加入200 μl磁珠稀釋液洗滌，重復1次，加入200 μl磁珠分離液，上機檢測細胞因子的數(shù)據(jù)變化；凝血功能檢測：取1 ml全血予以20 μl高嶺土試劑靜置激活4 min，利用血栓彈力圖儀觀察機體血小板計數(shù)、纖維蛋白原、凝血因子等血凝指標［9］；淋巴細胞亞群檢測：取30 μl的CD3+/CD4+/CD8+/CD45預混抗體分別加到T和BNK流式管中，然后加入50 μl充分混勻的抗凝全血，渦旋混勻，室溫避光孵育15 min，加入450 μl的1×溶血素，渦旋混勻，避光孵育15 min，上機檢測。儀器：流式細胞儀（型號：EasyCell 206A1），血栓彈力圖（型號：LEPU-8800）。

3.觀察指標

觀察并記錄受試者IL-1β、L-4、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-γ等炎性因子的變化；觀察并記錄受試者的血凝情況，包括凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間、纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA；觀察并記錄CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的變化情況，并將其數(shù)據(jù)進行對比與分析。

4.統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prim 8.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)采用獨立樣本t檢驗，凝血功能、細胞因子、淋巴細胞亞群與肺炎嚴重程度的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.80例患者肺炎感染類型分布

由下呼吸道7項結(jié)果可知，本研究80例肺炎患者的感染種類大致分布在肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌。肺炎鏈球菌51例，占比63.75%，肺炎克雷伯菌24例，占比30.00%，二者同時感染患者有5例，占比6.25%。由此可見，本研究肺炎患者大多是由肺炎鏈球菌所致。

2.細胞因子（表1）

表1 肺炎患者與健康體檢者的細胞因子對比（ng/L,±s）

表1 肺炎患者與健康體檢者的細胞因子對比（ng/L,±s）

注：根據(jù)急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ（APACHEⅡ）評分，其中危重型及以上APACHEⅡ評分≥12分，非危重型APACHEⅡ評分＜12分；對照組為健康體檢者。IFN-γ為干擾素-γ，IL為白細胞介素；與非危重組、對照組比較，aP＜0.05

組別對照組非危重組危重組F值P值例數(shù)50 44 36 IFN-γ 5.22±1.77 13.61±2.44 26.28±4.63a 4.52 0.044 IL-4 6.32±1.50 15.55±3.76 41.43±4.33a 4.99 0.019 IL-10 5.26±1.23 12.44±2.57 30.35±7.96a 4.22 0.026 IL-8 14.42±3.56 27.25±6.91 121.12±30.53a 5.37 0.031 IL-1β 7.44±2.72 14.42±2.95 30.52±3.19a 5.71 0.025 IL-6 7.16±2.23 90.55±22.67 430.47±110.23a 12.42＜0.001

在肺炎的發(fā)生發(fā)展過程中，機體可產(chǎn)生炎性應激反應，使部分炎性因子不同于正常水平［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎嚴重程度與機體炎性因子水平差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。危重組患者IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6指標均高于非危重組、對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。危重組IL-6水平是非危重組的6.31倍，分析原因為IL-6作為Th2型細胞因子可調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能，當危重型感染患者時IL-6水平會驟然升高，因此，可通過測定細胞因子判定肺炎的嚴重程度［11］。當IL-4、IL-6、IL-8、IL-10因子迅速升高上百倍，甚至數(shù)千倍時，往往代表病情迅速發(fā)展，需要密切觀察和治療。同時，若IL-6、IL-10均升高10倍，可能提示革蘭陰性菌感染；IL-6升高2倍以上，但IL-10增高值＜10倍，可能提示革蘭陽性菌感染，因此，細胞因子測定對臨床判斷感染種類及感染程度具有重要的實踐意義。對照組與非危重組IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6的Spearman相關(guān)系數(shù)（r=0.32、0.36、0.31、0.42、0.35、0.54）；非危重組與危重組IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6的Spearman相關(guān)系數(shù)（r=0.27、0.48、0.30、0.59、0.21、0.89）。

3.凝血功能（表2）

表2 肺炎患者與健康體檢者的凝血功能對比（±s）

表2 肺炎患者與健康體檢者的凝血功能對比（±s）

注：根據(jù)急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ（APACHEⅡ）評分，其中危重型及以上APACHEⅡ評分≥12分，非危重型APACHEⅡ評分＜12分；對照組為健康體檢者。α角、K時間均代表纖維蛋白原水平，MA為最大振幅，代表血小板功能，R時間代表凝血因子活性；與非危重組、對照組比較，aP＜0.05

組別對照組非危重組危重組F值P值例數(shù)50 44 36 α角（deg）72.44±4.82 55.38±4.44 42.62±3.37a 4.31 0.039 MA（mm）71.62±3.54 51.23±3.76 39.61±2.87a 4.27 0.036 R時間（min）4.22±0.50 7.26±0.64 10.43±0.85a 13.65 0.008 K時間（min）1.28±0.41 2.12±0.29 3.92±0.31a 12.59 0.074

機體在肺炎的發(fā)生發(fā)展過程中可產(chǎn)生相應的炎性反應，導致凝血功能發(fā)生異常［12］。利用血栓彈力圖對肺炎患者進行凝血功能監(jiān)測，有助于對病情的診斷與預后。危重組患者纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA均低于非危重組、對照組，凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間均高于非危重組、對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。對照組與非危重組纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA、凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間的Spearman相關(guān)系數(shù)（r=-0.50、-0.78、0.44、0.79）；非危重組與危重組纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA、凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間的Spearman相關(guān)系數(shù)（r=-0.33、-0.36、0.24、0.19）。以上結(jié)果表明，肺炎從非危重型到危重型，凝血功能存在相應變化，與相關(guān)研究一致［13］。因此，實時監(jiān)測凝血功能對肺炎的診斷及預后具有重要的臨床意義。

4.淋巴細胞亞群（表3）

表3 肺炎患者與健康體檢者的淋巴細胞亞群對比（±s）

表3 肺炎患者與健康體檢者的淋巴細胞亞群對比（±s）

注：根據(jù)急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ（APACHEⅡ）評分，其中危重型及以上APACHEⅡ評分≥12分，非危重型APACHEⅡ評分＜12分；對照組為健康體檢者。與非危重組、對照組比較，aP＜0.05

組別對照組非危重組危重組F值P值例數(shù)50 44 36 CD3+（%）78.15±4.22 62.27±3.21 48.42±3.38a 6.84 0.002 CD4+（%）42.32±1.56 37.22±2.72 29.56±1.15a 7.30 0.010 CD4+/CD8+1.85±0.13 1.46±0.20 1.15±0.16a 5.90 0.020

T淋巴細胞是評價免疫功能最重要的指標，其分子標志物為CD3+，可反映機體免疫功能狀態(tài)。CD4+/CD8+比值可反映集體的免疫功能程度，比值越低免疫功能越差［14］。對照組、非危重組、危重組的CD3+、CD4+淋巴細胞亞群及CD4+/CD8+比值均呈下降趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。由此可見，不同嚴重程度的肺炎與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。危重組患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指標均低于非危重組、對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。對照組與非危重組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指標的Spearman相關(guān)系數(shù)（r=-0.22、-0.10、-0.11）；非危重組與危重組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指標的Spearman相關(guān)系數(shù)（r=-0.15、-0.19、-0.08）。

討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查顯示，呼吸系統(tǒng)急性感染病死率中，肺炎占75%。因此，肺炎感染程度準確的判斷對于臨床合理用藥、保障人民身體健康具有重要的臨床意義。機體經(jīng)病原微生物感染后可分泌炎癥因子和毒素而加重感染程度，甚至引發(fā)更多的并發(fā)癥，嚴重威脅人們的生命健康［15］。炎癥因子隨著血流進入血液系統(tǒng)可引起機體血小板功能、凝血因子活性、纖維蛋白原水平發(fā)生顯著變化，導致機體凝血功能障礙。因此，肺炎患者進行細胞因子及凝血功能測定對判斷患者感染嚴重程度具有重要意義。

在感染性疾病中，IFN-γ、IL-8、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子可激活全身或局部的炎性反應，感染程度不同，其數(shù)值可發(fā)生較大變化［16］。本研究中，危重組IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6分別是非危重組肺炎患者的2.46、7.69、3.09、4.22、2.66、6.31倍，且均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。這表明促炎細胞因子在重癥肺炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此，可通過測定細胞因子判斷機體感染程度及預后療效。同時，危重組及非危重組肺炎患者的凝血功能顯示，凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間隨著肺炎嚴重程度數(shù)值會升高，具有一定相關(guān)性，危重組及非危重組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。這是由于R時間代表機體的凝血狀態(tài)，K時間代表血凝塊形成的速度，當患者為重癥肺炎時，機體血小板和纖維蛋白原較少，形成血凝塊的速度放緩，表現(xiàn)為低凝狀態(tài)，二者數(shù)值水平與炎癥程度密切相關(guān)。纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA分別代表血凝酶形成的速度和血凝塊的硬度及最大強度，危重組肺炎患者的數(shù)值均低于非危重組，二者呈負相關(guān)關(guān)系。肺炎嚴重程度的增加，纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA逐漸降低，對毛細血管的保護相應降低，病死率相應增加［17-18］。

本研究采用流式細胞儀技術(shù)比較正常人及不同嚴重程度肺炎患者的淋巴細胞亞群變化。當肺炎較為嚴重時，機體免疫能力會下降，T淋巴細胞從而減少，可能會導致疾病進一步嚴重的現(xiàn)象［19］。本研究表明，隨著肺炎嚴重程度的增加，機體的免疫功能逐漸降低，危重組CD3+T淋巴細胞與非危重組、對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值與肺炎嚴重程度呈負相關(guān)關(guān)系，比值越低，表明肺炎越嚴重。因此，在疾病早期檢測淋巴細胞亞群，有助于疾病的治療及預后［20］。

由本研究可知，當機體正相關(guān)系數(shù)細胞因子、凝血因子活性R時間、纖維蛋白原水平K時間增加時，肺炎的嚴重程度相應增高，Spearman相關(guān)系數(shù)均r＞0；隨著體內(nèi)負相關(guān)系數(shù)纖維蛋白原水平α角、血小板功能MA、CD3+、CD4+的降低，肺炎的嚴重程度相應增高，Spearman相關(guān)系數(shù)均r＜0。因此，本研究表明細胞因子及凝血功能測定對評估肺炎感染程度及預后具有重要的臨床意義，臨床可廣泛使用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李明偉：文章撰寫，試驗設計和統(tǒng)籌安排；肖慧芳：試驗操作，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；馮玉龍：數(shù)據(jù)分析