許 鳳，張藝萍，趙阿香，侯家娥，朱會(huì)宣，蔣亞蓮*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650200；2.滇西科技師范學(xué)院，云南 臨滄 650500）

捕蠅草屬(DionaeaJ)為茅膏菜科(Droseraceae)下的一個(gè)單種屬，該屬只有捕蠅草(Dionaea muscipula)一個(gè)種，自1760年首次被發(fā)現(xiàn)后，經(jīng)芽變與品種間雜交，截至2019年，在國際食蟲植物協(xié)會(huì)登記的捕蠅草品種有130個(gè)［1］。捕蠅草的捕蟲夾能散發(fā)出含有果香和花香成分的氣味，以此吸引飛蟲，一旦被吸引來的獵物觸碰到捕蟲夾內(nèi)的剛毛，捕蟲夾就會(huì)閉合，這樣昆蟲和其他小獵物就被淪為了捕蠅草的食物［2］；早在18世紀(jì)70年代時(shí)，達(dá)爾文便在其專著《Insectivorous Plants》中描述了捕蠅草的捕食現(xiàn)象，并稱之為世界上最奇妙的植物之一［3］。捕蠅草的葉瓣和葉柄在充足光照下會(huì)變?yōu)榧t色或紫紅色而具有很強(qiáng)的趣味性和觀賞性，因而成為近幾年興起的家庭趣味性小盆栽植物之一。

雜交育種是新品種選育的重要手段之一，而花粉活力及柱頭的可授性直接影響著其授粉的成功率［4］。因此，對(duì)捕蠅草花粉活力及柱頭的可授性進(jìn)行準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)，是保證捕蠅草育種工作順利開展的重要前提，對(duì)育種具有重要的指導(dǎo)意義。目前，對(duì)捕蠅草的研究主要集中于繁育、栽培、捕蟲機(jī)理等方面［5-11］，因此，筆者分析了不同品種捕蠅草的花粉活力、花粉離體萌發(fā)條件、柱頭可授性，旨在為捕蠅草雜交育種提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為捕蠅草人工種子繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2022年5—8月在云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以大嘴、鋸齒、巨夾、23號(hào)捕蠅草4個(gè)捕蠅草品種為供試材料，比較了這4個(gè)品種的花粉萌發(fā)率。另外，選取大嘴捕蠅草(圖1)作為花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分及柱頭可授性研究的供試材料。試驗(yàn)所用的捕蠅草材料均來源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所植物工廠。

1.2 方法

1.2.1 花粉的采集 選取生長(zhǎng)狀況良好、無病蟲害并顯色的花蕾，于晴天上午9:30～11:30用鑷子采集花粉，放入干凈的培養(yǎng)皿中，并帶回實(shí)驗(yàn)室，待散粉時(shí)開展試驗(yàn)。

1.2.2 花粉活力的測(cè)定方法 （1）TTC染色法。參照趙統(tǒng)利等［12-13］的方法，用不同濃度(0.5%、1.0%、2.0%)的TTC染色液對(duì)捕蠅草花粉于35 ℃下分別染色30或50 min，然后鏡檢觀察，紅色的花粉粒表示有活力，淡紅色或無色的花粉粒表示活力低或無活力。

（2）I2-KI染色法。參照詹妮等［14］的方法，將捕蠅草花粉用I2-KI染液，于室溫下分別染色20、40 min，然后鏡檢觀察。其中，活力強(qiáng)的花粉粒呈藍(lán)色，活力弱的花粉粒呈黃褐色，無活力的花粉粒不著色。

（3）孢粉染色法。參照陳家瑞等［15-16］的方法，于30 ℃恒溫箱內(nèi)，反復(fù)將捕蠅草花粉用孢粉染液，黑暗條件下染色30、60 min后鏡檢觀察。有活力的花粉細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，無活力的花粉細(xì)胞壁被染成綠色。

（4）離體萌發(fā)法。參照杜玉虎等［17-18］的方法，以BK培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的MES、蔗糖、硼酸，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～4 h后，統(tǒng)計(jì)其花粉萌發(fā)率，花粉管長(zhǎng)度超過花粉直徑的1/2時(shí)即視為萌發(fā)。

1.2.3 花粉萌發(fā)的單因素試驗(yàn) 以BK(B3HO30.3 g/L+MgSO42 g/L+KCl 0.08 g/L+CaCL20.6 g/L+肌醇1.8 g/L+MES 1.07 g/L+蔗糖200 g/L)為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、不同溫度(20、25、30、35 ℃)、不同培養(yǎng)時(shí)間(1.0、2.0、3.0、4.0 h)分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)(表1)。通過比較不同條件下的花粉萌發(fā)率來確定最佳的萌發(fā)條件，并在此基礎(chǔ)上測(cè)定一天之中不同時(shí)間段的花粉活力。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn) 根據(jù)1.2.3單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置MES、蔗糖、硼酸共3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)(表2)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平

1.2.5 不同采集時(shí)間對(duì)捕蠅草花粉活力的影響 在同一天的9:00～11:00、11:00～13:00、13:00～15:00、15:00～17:00等4個(gè)不同時(shí)間段內(nèi)分別采集大嘴捕蠅草花粉，并置于最佳培養(yǎng)條件和最優(yōu)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)同一天內(nèi)捕蠅草花粉活力的變化。

1.2.6 不同捕蠅草品種花粉活力的比較 結(jié)合最佳培養(yǎng)條件和最優(yōu)培養(yǎng)基，對(duì)大嘴、鋸齒、巨夾、23號(hào)4個(gè)捕蠅草品種的花粉活力進(jìn)行比較。

1.2.7 花粉萌發(fā)率的測(cè)定與統(tǒng)計(jì)分析 在Leica DM6000體式顯微鏡(目鏡10×，物鏡4×)下觀察捕蠅草花粉粒著色及萌發(fā)情況。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)制備3個(gè)玻片，每個(gè)玻片隨機(jī)取3個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野觀察不少于30?；ǚ郏y(tǒng)計(jì)每個(gè)視野內(nèi)萌發(fā)花粉粒數(shù)和總的花粉粒數(shù)，并計(jì)算花粉萌發(fā)率，計(jì)算公式為：

捕蠅草花粉萌發(fā)率(%)=染色或萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉?？倲?shù)×100%。

1.2.8 捕蠅草柱頭的可授性觀察 采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法，觀察大嘴捕蠅草的柱頭可授性［17-22］。在捕蠅草花蕾顯色后，取不同株的花序?qū)ζ溥M(jìn)行掛牌觀察，發(fā)現(xiàn)捕蠅草的單朵花期為7 d。因此，自花蕾顯色后于每天9:00～11:00取樣并觀察其柱頭活力，連續(xù)取樣和觀察7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 捕蠅草花粉活力不同檢測(cè)方法的比較

如圖2所示，所有經(jīng)0.5%、1.0%、2.0% TTC溶液染色后的花粉均變?yōu)榧t色；所有經(jīng)I2-KI染色后的花粉均呈黃褐色或者黃色，未見藍(lán)色、藍(lán)黑色花粉粒；孢粉染液染色后，所有花粉都呈紫紅色，未見花粉壁為綠色的花粉粒。由此可見，TTC、孢粉染色法雖然能使捕蠅草花粉粒染色，但不能精確地反映花粉的活力狀況，而離體萌發(fā)法可以準(zhǔn)確地顯示捕蠅草花粉的活力狀況。

圖2 不同測(cè)定方法下捕蠅草花粉活力的鏡檢結(jié)果

2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

2.2.1 pH值對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響 在溫度30 ℃、培養(yǎng)3 h的條件下，設(shè)置pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5共6個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)。由圖3可知：當(dāng)pH值為5.0時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)到了60.58%；隨著pH值的升高，花粉萌發(fā)率則不斷下降。因此，pH值較低時(shí)有利于捕蠅草花粉的萌發(fā)。進(jìn)一步的方差分析發(fā)現(xiàn)，pH值與捕蠅草花粉萌發(fā)率呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

圖3 不同pH值對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響 在pH值6.5、培養(yǎng)時(shí)間3 h的條件下，設(shè)置20、25、30、35 ℃等4個(gè)溫度梯度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。由圖4可知，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，捕蠅草的花粉萌發(fā)率最高，為15.75%。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果表明，不同培養(yǎng)溫度處理之間的捕蠅草花粉萌發(fā)率差異極顯著(P＜0.01)。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響 在pH值6.5、溫度30 ℃的條件下，將捕蠅草花粉分別培養(yǎng)1、2、3、4 h。由圖5可知，在不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)下，各處理的花粉萌發(fā)率無顯著差別，只是花粉管隨時(shí)間的延長(zhǎng)而伸長(zhǎng)。由此可知，培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)花粉萌發(fā)率無明顯的影響。

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

2.3 培養(yǎng)基組分對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

從表3可以看出，RC＞RB＞RA，說明硼酸、蔗糖和MES對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響程度表現(xiàn)為硼酸＞蔗糖＞MES；從K1、K2、K3、K4值的大小可以得出培養(yǎng)基組分的最佳組合為A4B3C2，即B3HO30.1 g/L+MgSO42 g/L+KCl 0.08 g/L+CaCL20.6 g/L+肌醇1.8 g/L+MES 3.0 g/L+蔗糖100 g/L，且該組合也在正交設(shè)計(jì)表中，因此，采用該培養(yǎng)基所培養(yǎng)的大嘴捕蠅草的花粉萌發(fā)率最高，為62.23%。在該培養(yǎng)基中萌發(fā)的花粉粒的花粉管幾乎全為雙花粉管，少數(shù)會(huì)出現(xiàn)3根花粉管；A3B2C4組合培養(yǎng)的捕蠅草的平均花粉萌發(fā)率最低，僅為 5.32%。

表3 L16(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及捕蠅草花粉萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

進(jìn)一步的方差分析結(jié)果表明，B、C因素對(duì)花粉萌發(fā)率的影響達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，A因素對(duì)花粉萌發(fā)率的影響達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，說明硼酸、蔗糖和MES均對(duì)捕蠅草花粉的萌發(fā)率有影響(表4)。

表4 不同培養(yǎng)基組分的方差分析結(jié)果

2.4 不同捕蠅草品種花粉萌發(fā)率的比較

采用篩選出的實(shí)際最佳培養(yǎng)基組合，即0.1 g/L硼酸+2 g/L硫酸鎂+0.08 g/L氯化鉀+0.6 g/L氯化鈣+1.8 g/L肌醇+3 g/L MES+100 g/L蔗糖，對(duì)4個(gè)品種捕蠅草的花粉萌發(fā)率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：4個(gè)捕蠅草品種的花粉萌發(fā)率間存在極顯著差異，其中大嘴捕蠅草的花粉萌發(fā)率達(dá)到了62.14%，而鋸齒捕蠅草和23號(hào)捕蠅草的花粉萌發(fā)率分別僅為2.60%和4.04%(圖6)。

圖6 不同品種捕蠅草花粉萌發(fā)率的比較

2.5 取樣時(shí)間對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

以大嘴捕蠅草為試驗(yàn)材料，在同一天的9:00～11:00、11:00～13:00、13:00～15:00、15:00～17:00 這4個(gè)時(shí)間段內(nèi)采集花粉進(jìn)行培養(yǎng)。由圖7可知，在9:00～11:00這一時(shí)間段的花粉萌發(fā)率高達(dá)51.83%。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果顯示，不同取樣時(shí)間的捕蠅草花粉萌發(fā)率的差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。

圖7 不同取樣時(shí)間對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響

2.6 捕蠅草柱頭的可授性

捕蠅草花朵在未開至開放及凋謝的過程中，柱頭的形態(tài)呈階段性的變化(表5)。利用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測(cè)定柱頭的可授性可知，當(dāng)小花未開花、開花第1天、開花第2天時(shí)的柱頭直立，直至開花第3天，柱頭逐漸彎曲，呈“γ”狀；柱頭的可授性從開花第2～第7天呈現(xiàn)出先增強(qiáng)隨后減弱的趨勢(shì)，第4～第5天最強(qiáng)，且柱頭的形狀從“γ”狀慢慢變成“羊角狀”(圖8)。

圖8 不同開花時(shí)間的柱頭形態(tài)

表5 捕蠅草的柱頭可授性與柱頭形態(tài)

3 結(jié)論與討論

3.1 捕蠅草花粉活力的測(cè)定

杜文文等［16］采用4種方法檢驗(yàn)了30種秋海棠的花粉活力，發(fā)現(xiàn)TTC、I2-KI染色法均不能使花粉粒染色，離體培養(yǎng)后也不會(huì)萌發(fā)，而用孢粉染色法能很好地區(qū)分有活力或敗育的花粉。本研究也采用這4種方法測(cè)定了捕蠅草花粉活力，結(jié)果表明：3種染色法雖然都能使花粉染色，但是不能準(zhǔn)確地區(qū)分有活力或敗育的花粉；而在培養(yǎng)基培養(yǎng)下捕蠅草花粉能萌發(fā)并長(zhǎng)出花粉管，這表明離體萌發(fā)法是測(cè)定捕蠅草花粉活力最有效的方法。

花粉萌發(fā)需要在一定的環(huán)境條件下才能進(jìn)行。王曉慶等［23］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，早生新水梨花的萌發(fā)率提高了53%。同時(shí)，段青等［24］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值6.0、培養(yǎng)溫度25 ℃時(shí)，大麗花花粉的萌發(fā)率明顯提高，培養(yǎng)時(shí)間2.5 h時(shí)花粉管明顯伸長(zhǎng)。本研究通過單因素試驗(yàn)得出pH值5.0、培養(yǎng)溫度30 ℃的條件適合于捕蠅草的花粉萌發(fā)，而培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)花粉萌發(fā)率的影響不明顯。本試驗(yàn)對(duì)pH值設(shè)置了6個(gè)梯度，但未進(jìn)行更低pH值的試驗(yàn)，下一步擬開展pH值＜5.0條件對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率影響的比較試驗(yàn)。

在優(yōu)化的條件下，以BK培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探討了硼酸、蔗糖和MES對(duì)捕蠅草花粉萌發(fā)率的影響，結(jié)果表明其花粉萌發(fā)率依次表現(xiàn)為硼酸＞蔗糖＞ MES。BK培養(yǎng)基中還含有其他的營養(yǎng)元素，對(duì)花粉的萌發(fā)也起到了一定的作用，但考慮到因素過多而使得分析變得復(fù)雜，本試驗(yàn)只選取了硼酸、蔗糖、MES這3個(gè)主要的因素進(jìn)行試驗(yàn)。

在優(yōu)化的培養(yǎng)基中，對(duì)4個(gè)品種的捕蠅草的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：各品種之間的花粉萌發(fā)率存在顯著差異，大嘴捕蠅草的花粉萌發(fā)率高達(dá)62.14%，而鋸齒捕蠅草和23號(hào)捕蠅草的花粉萌發(fā)率分別僅為2.60%和4.04%，說明捕蠅草花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基具有特異性。

趙劍穎等［25］研究發(fā)現(xiàn)，萬壽菊的花粉活力在一天之中表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，其中在11∶00 ～13∶00之間的花粉活力最高。本研究發(fā)現(xiàn)捕蠅草花粉活力在一天之中呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，以9∶00～11∶00時(shí)捕蠅草花粉活力最高，為51.83%，該時(shí)間段適合進(jìn)行捕蠅草雜交授粉。

3.2 捕蠅草柱頭的可授性

捕蠅草柱頭形態(tài)與可授性密切相關(guān)，未開花的柱頭無可授性；當(dāng)柱頭開始從中間分叉時(shí)，柱頭開始具有可授性，柱頭的可授性可保持5 d；當(dāng)柱頭的分叉向外卷曲為“羊角狀”時(shí)，柱頭則會(huì)失去可授性。聯(lián)苯胺—過氧化氫法被普遍認(rèn)為是檢測(cè)柱頭可授性的可靠方法［25-28］，然而對(duì)于捕蠅草來說，柱頭需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能被染上棕色而不是藍(lán)色，但仍會(huì)產(chǎn)生氣泡。因此，在本研究中以產(chǎn)生氣泡的多少來確定捕蠅草的柱頭活力的強(qiáng)弱。