周昌頤 王瑞 沈靂

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科 上海市心血管病研究所,上海 200032)

藥物洗脫支架(drug-eluting stent,DES)在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療中的應(yīng)用,顯著降低了血運(yùn)重建后不良事件的發(fā)生率,但支架內(nèi)再狹窄和支架內(nèi)新生動脈粥樣硬化等晚期并發(fā)癥仍舊影響支架植入患者的遠(yuǎn)期預(yù)后[1]。近年來被寄予厚望的生物可降解支架(bioresorbable stents,BRS)仍未能減少支架相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[2],BRS吸收過程中局部降解產(chǎn)物的聚集,使其存在獨特于DES的血管交互機(jī)制。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是動脈血管中膜的主要細(xì)胞成分,支架植入后與支架表面直接接觸,其增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為與不良事件的發(fā)生密切相關(guān)。因此,更好地理解支架植入對VSMC行為的影響,將有助于現(xiàn)有器械的優(yōu)化和改進(jìn),并為未來創(chuàng)新治療手段的開拓提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)就血管支架植入對VSMC的影響做簡要綜述。

1 VSMC的表型

生理情況下動脈血管中膜中的VSMC形態(tài)細(xì)長,呈長梭形,似紡錘,主要表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白家族,如肌動蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈和平滑肌細(xì)胞特異性抗原[3],此時VSMC細(xì)胞周期停滯、增殖和遷移能力低下,主要參與動脈的收縮與舒張,從而調(diào)節(jié)器官和組織的血流量,故稱其為收縮表型[4]。收縮表型并不是VSMC分化的終末,在包含絲裂原和各種生長因子的血清等刺激下,VSMC能夠重編程、去分化,重新進(jìn)入細(xì)胞周期,開始增殖[5]。

具有增殖能力的VSMC形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱庑?遷移能力增強(qiáng),并且上調(diào)了與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)豐度,呈現(xiàn)合成表型。一般將VSMC從收縮表型去分化成為合成表型的這一過程稱為表型轉(zhuǎn)換[6]。VSMC的表型轉(zhuǎn)換促進(jìn)了肺動脈高壓[7]和動脈瘤[8]等疾病的發(fā)生發(fā)展,合成表型的VSMC能夠合成、分泌過量細(xì)胞外基質(zhì),增加動脈血管的硬度,并且能夠遷移至血管內(nèi)膜后過度增殖導(dǎo)致內(nèi)膜增厚,以及血管腔狹窄[9]。

血管支架植入誘導(dǎo)VSMC成為表達(dá)c-Kit的干細(xì)胞表型,參與血管修復(fù)[10],并且通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路[11]、Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)通路[12-13]將自身轉(zhuǎn)化為合成表型,導(dǎo)致新生內(nèi)膜過度增殖。

近年來隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展,從病理性血管組織中鑒定出了更多VSMC亞群[14],提示VSMC具有高度的異質(zhì)性,但其與支架植入后并發(fā)癥的關(guān)系尚未完全闡明。一般認(rèn)為VSMC還具有以下表型：(1)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型：VSMC收縮能力下降,增殖能力增強(qiáng),高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞具有的標(biāo)志物,如SCA1、CD34及CD44;(2)纖維細(xì)胞樣表型：VSMC更多參與到細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌過程,高表達(dá)膠原蛋白(如COL1A1)及蛋白聚糖(如DCN、BGN),與間充質(zhì)細(xì)胞樣表型的VSMC一同導(dǎo)致新生內(nèi)膜過度增殖和血管僵硬[15];(3)巨噬細(xì)胞樣表型：通過獲得巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白(如LGALS3、CD45及CD68),VSMC能夠吞噬脂質(zhì)并繼續(xù)分化為泡沫細(xì)胞[16];(4)成骨表型：成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(如MSX2、RUNX2及SOX9)被激活,合成分泌含生物礦化相關(guān)堿性磷酸酶的囊泡至細(xì)胞外膠原纖維致使鈣鹽沉積,最終導(dǎo)致血管鈣化[4];(5)脂肪細(xì)胞樣表型：功能類似棕色脂肪細(xì)胞[17]。目前鮮有研究驗證VSMC的表型在支架植入后的變化,尚需進(jìn)一步明確不同表型是否參與了支架植入后血管修復(fù)的過程。

2 機(jī)械作用的影響

血管中膜的VSMC、膠原纖維及彈性纖維是血管壁主要的承力結(jié)構(gòu),維持著血管的彈性和張力。血管支架植入后管壁被拉伸,產(chǎn)生強(qiáng)周向應(yīng)力。細(xì)胞表面的整合素、非選擇性陽離子通道和一些G蛋白耦聯(lián)受體可將這些機(jī)械性牽拉信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),使黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、血小板衍生生長因子受體α等發(fā)生磷酸化,進(jìn)而通過Rho、MAPK及PI3K/Akt等通路,激活p53,促使DNA片段化,使VSMC發(fā)生細(xì)胞凋亡[18]。機(jī)械性牽拉還能通過升高胞內(nèi)活性氧水平激活NOTCH信號通路,促進(jìn)VSMC增殖和表型轉(zhuǎn)換[19]。

FAK是傳導(dǎo)細(xì)胞外機(jī)械信號的關(guān)鍵分子,其作為一種酪氨酸激酶,能夠通過其C端的黏著斑靶向結(jié)構(gòu)域接受來自血小板衍生生長因子受體和整合素的信號,進(jìn)而從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核穿梭。FAK蛋白的N端能夠與S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)相互作用促進(jìn)SKP2的泛素化降解,在被外界信號激活后,VSMC胞內(nèi)的FAK更多定位于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核中FAK依賴的蛋白酶體途徑對轉(zhuǎn)錄因子GATA4和SKP2的降解作用減少,使核內(nèi)GATA4直接結(jié)合cyclin D1基因啟動子區(qū)域,促進(jìn)cyclin D1蛋白表達(dá),繼而與SKP2結(jié)合,使VSMC進(jìn)入細(xì)胞周期[20]。另外,FAK還可通過表觀遺傳學(xué)途徑調(diào)控VSMC表型。核內(nèi)DNMT3A的泛素化降解同樣受FAK調(diào)控,FAK出核能夠增加收縮相關(guān)基因啟動子中的DNA甲基化程度,阻礙收縮相關(guān)基因表達(dá),使VSMC發(fā)生去分化[21]。血管支架植入伴隨著血清中血小板衍生生長因子等化學(xué)信號的刺激及血管壁牽拉傳遞的機(jī)械信號刺激,而FAK是兩種刺激的共同下游關(guān)鍵蛋白分子,針對其活性的調(diào)控將有望成為防止支架植入對血管壁損傷的靶點之一。

3 抗增殖藥物的影響

DES使用涂層控制抗細(xì)胞增殖藥物的釋放,主要目的是抑制新生內(nèi)膜的過度增殖。新生內(nèi)膜主要由VSMC及細(xì)胞外基質(zhì)如蛋白多糖、膠原等成分構(gòu)成。動物模型的DES植入后新生內(nèi)膜組織進(jìn)行單細(xì)胞測序分析結(jié)果表明,內(nèi)皮細(xì)胞僅占總細(xì)胞數(shù)的10%[22],故抑制VSMC增殖應(yīng)是抗支架內(nèi)再狹窄的主要靶點。

微管抑制劑紫杉醇促使VSMC靜止于M期,阻止其增殖和遷移,是較早應(yīng)用于DES的抗細(xì)胞增殖藥物,但部分研究表明其支架內(nèi)血栓發(fā)生率相較其他DES高[23],現(xiàn)已少用。

目前廣泛應(yīng)用于DES涂層的是大環(huán)內(nèi)酯類抗增殖藥物雷帕霉素及其類似物(如sirolimus、everolimus、zotarolimus和biolimus A9),主要結(jié)合細(xì)胞存活和增殖的關(guān)鍵調(diào)控蛋白mTOR復(fù)合體中的mTORC1[24],進(jìn)而抑制mTOR通路,促進(jìn)VSMC向收縮表型轉(zhuǎn)換。

雷帕霉素的應(yīng)用顯著降低了支架內(nèi)再狹窄率,但卻提高了支架內(nèi)新生動脈粥樣硬化發(fā)生率[25]。新生動脈粥樣硬化定義為支架周圍新生內(nèi)膜內(nèi)出現(xiàn)帶有CD68抗原的泡沫狀巨噬細(xì)胞簇,伴或不伴鈣化、纖維粥樣斑塊、薄纖維帽粥樣斑塊和血栓形成破裂[26],但DES引起新生動脈粥樣硬化的機(jī)制尚未完全闡明。通過譜系追蹤技術(shù)構(gòu)建的動脈粥樣硬化小鼠模型表明,VSMC可以通過表型轉(zhuǎn)換成為表達(dá)CD68表面抗原的巨噬細(xì)胞樣VSMC[27],利用單細(xì)胞技術(shù)等分析方法表明其占小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細(xì)胞總量的30%～70%[4,28]。目前,支架植入后的新生動脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞的來源尚不明確,VSMC向巨噬細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)換是否受到抗增殖藥物涂層的支架影響也缺乏嚴(yán)格的實驗證據(jù),仍需要進(jìn)一步探索。

近年來也有許多研究嘗試在DES上應(yīng)用新型的抗增殖藥物。比如以傳統(tǒng)毒性藥物砒霜制成的三氧化二砷DES,能夠通過阻斷VSMC中的YAP/ROCK通路,調(diào)節(jié)其表型,達(dá)到抑制新生內(nèi)膜的形成、抗支架內(nèi)再狹窄的效果[13]。

4 聚乳酸及其降解產(chǎn)物的影響

聚乳酸是應(yīng)用最為廣泛的BRS骨架和可降解涂層材料,其最終降解產(chǎn)物為二氧化碳和水被血管壁所吸收,支架梁局部被結(jié)締組織填充修復(fù),而聚乳酸在降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乳酸可能影響VSMC表型,從而導(dǎo)致不良事件的發(fā)生。內(nèi)源性乳酸是哺乳動物細(xì)胞有氧糖酵解的產(chǎn)物,VSMC在鈣化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,乳酸含量與有氧糖酵解的關(guān)鍵酶PFKFB3的含量均增加[29]。同時,其他研究[30-31]提示,有氧糖酵解的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶在VSMC增殖過程中也發(fā)揮重要作用,提示W(wǎng)arburg效應(yīng)參與介導(dǎo)調(diào)控VSMC表型。外源性的高乳酸環(huán)境能夠促進(jìn)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換,增強(qiáng)VSMC細(xì)胞的增殖及遷移能力[32],同時抑制BNIP3蛋白調(diào)節(jié)的線粒體自噬,使線粒體功能受損,從而誘導(dǎo)其氧化應(yīng)激,促進(jìn)其分化為成骨表型[33]。一些動物實驗和臨床研究表明,聚乳酸BRS植入后新生動脈粥樣硬化進(jìn)展明顯,支架內(nèi)血管段鈣化進(jìn)展迅速[34]。以上研究提示聚乳酸及其降解產(chǎn)物影響VSMC的糖代謝過程,通過Warburg效應(yīng)改變表型,促進(jìn)增殖并且轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞樣表型以及成骨表型,進(jìn)而介導(dǎo)支架內(nèi)再狹窄和新生動脈粥樣硬化等不良事件的發(fā)生。

5 鎂、鋅及稀土元素的影響

鎂合金因其優(yōu)越的力學(xué)性能和抗栓能力,成為繼聚乳酸之后又一理想的BRS骨架材料。鎂離子在人體中含量豐富,且是鈣的天然拮抗劑,在體外試驗中能夠抑制高磷誘導(dǎo)的VSMC成骨分化,近年來有研究認(rèn)為提高鈣化易感患者血清中的鎂濃度可能有助于預(yù)防血管鈣化[35]。

在添加有雷帕霉素和鎂離子的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)家兔VSMC和家兔內(nèi)皮細(xì)胞時,發(fā)現(xiàn)將鎂離子濃度從1 mM提高至3 mM并不影響雷帕霉素對家兔VSMC增殖、遷移的抑制作用,但卻能顯著恢復(fù)家兔內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力[36]。鈰、釹、釔和鐿等元素的體外試驗[37]結(jié)果表明,這些稀土元素添加至鎂合金中只能使VSMC上調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá),但并不引起VSMC凋亡。另外,一項臨床前研究[38]表明,鎂基BRS與DES相比,新生動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著降低。以上研究共同說明,鎂合金不僅具有良好的生物相容性,而且可能抑制VSMC向成骨表型轉(zhuǎn)換,是具有良好前景的BRS骨架材料。

與鎂類似,鋅基支架對新生內(nèi)膜形成也呈明顯的抑制作用[39],能夠誘導(dǎo)VSMC產(chǎn)生線粒體融合,提高VSMC的最大和基礎(chǔ)耗氧量[40],以及通過激活半胱天冬酶凋亡信號通路促進(jìn)VSMC凋亡[41]。在高糖環(huán)境中,鋅離子上調(diào)VSMC中的TNFAIP3,抑制VSMC向成骨表型分化[42]。鋅具有出色的生物相容性和理想的降解速率,但其機(jī)械強(qiáng)度較低,近年來才開始將其作為BRS材料研究,仍需要優(yōu)化和尋找具有更強(qiáng)機(jī)械性能的鋅合金。

6 總結(jié)與展望

VSMC在支架植入后血管壁愈合、組織重塑及最終支架內(nèi)再狹窄和新生動脈粥樣硬化形成中發(fā)揮著核心作用。在這些過程中,VSMC經(jīng)歷了復(fù)雜的變化,由收縮型轉(zhuǎn)換為合成型,獲得了高增殖和遷移的能力。同時,許多關(guān)于VSMC異質(zhì)性的研究在體外分離鑒定出更多的VSMC亞群,通過鑒定這些可由特定基因/蛋白表征的不同VSMC表型,可更好地闡明VSMC在支架植入后血管修復(fù)中的作用,有助于設(shè)計預(yù)防支架相關(guān)不良事件的個體化治療手段。通過對裸金屬支架失敗機(jī)制的研究,DES得以發(fā)展,并成功抑制了再狹窄的發(fā)生,但卻使新生動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著提高。BRS技術(shù)的發(fā)展旨在通過介入無植入的理念,完成病變血管生理性功能的恢復(fù),但其降解過程中的中間產(chǎn)物也影響著VSMC的生物學(xué)行為,對血管重構(gòu)的結(jié)局至關(guān)重要。因此,闡明VSMC在血管支架植入后發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,有助于改進(jìn)血管支架機(jī)械支撐物結(jié)構(gòu)、BRS的分子組成及選擇理想的涂層藥物,或許將引領(lǐng)介入領(lǐng)域的下一場技術(shù)革命。