楊 盼 閆成祥 朱利香 姜 鳴 楊 亮 侯仁浩 王江博曹園園 劉 霞△ 白占濤△

（1 延安大學生命科學學院多肽藥物研究中心，陜西省區(qū)域生物資源保護與利用工程技術研究中心，延安 716000；2 延安多肽藥物工程技術研究中心，延安 716000；3 延安神經(jīng)免疫腫瘤與干細胞重點實驗室，延安 716000）

當個體受到傷害性刺激時會作用于外周感受器引起外周組織釋放炎癥因子，通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)機制激活傷害性感受器，促使高閾值感受器轉(zhuǎn)變?yōu)榈烷撝蹈惺芷?，造成痛覺過敏[1]。導致脊髓損傷、炎性疼痛及神經(jīng)病理性疼痛等慢性疼痛的發(fā)生，已報道疼痛病人有11.9%患有無法控制的神經(jīng)病理性疼痛[2]。其中5%復雜性區(qū)域疼痛綜合征的病人檢測到雙側(cè)軀體對稱部位的異常性疼痛，在動物疼痛模型也同樣，這種軀體某一部位損傷后，在損傷部位周圍區(qū)域及身體對側(cè)相應部位出現(xiàn)持續(xù)性的自發(fā)痛或痛敏現(xiàn)象稱之為鏡像痛敏 (mirror-image pain, MIP)[3～6]。在臨床研究中，慢性疼痛病人MIP癥狀頻發(fā)，但MIP 在引起對側(cè)肢體疼痛之后，其癥狀相對緩和，臨床也會忽視對MIP 的預防和治療[6]。MIP 在慢性疼痛病人中反復出現(xiàn)，對病人生活及健康造成極大的影響，因此，探究MIP 發(fā)生機制已成為治療疼痛發(fā)生的重要研究方向。

MIP 的發(fā)生在中樞和外周受多種神經(jīng)活性物質(zhì)共同調(diào)節(jié)。鞘內(nèi)注射α1 腎上腺素受體拮抗劑酚妥拉明(phentolamine)增加了對側(cè)星形膠質(zhì)細胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1 (glutamate transporters-1, GLT-1)蛋白水平，改善了對側(cè)后肢50%縮足閾值，表明鞘內(nèi)注射α1 腎上腺素拮抗劑上調(diào)脊髓GLT-1 緩解MIP[7]。星形膠質(zhì)細胞是分布最廣泛的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其增殖和活化與疼痛發(fā)生和維持密切相關[8,9]，星形膠質(zhì)細胞通過間隙連接彼此形成相互連接網(wǎng)絡。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員多巴胺D2 受體調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞間隙連接蛋白Cx43 通道開放和磷酸化而介導MIP 的發(fā)生。α2A 腎上腺素受體（α(2A)AR）作為G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，在外周和中樞系統(tǒng)均有分布[11]。α(2A)AR 激動劑可樂定(clonidine, Clo)作為鎮(zhèn)痛藥物，在臨床中有降低心率的功能[12,13]。對大鼠進行部分坐骨神經(jīng)結扎后，引起雙側(cè)行為痛覺過敏，雙側(cè)神經(jīng)膠質(zhì)激活標記物和細胞因子[14]。腹腔內(nèi)注射Clo 顯著抑制雙側(cè)機械痛和熱痛，抑制膠質(zhì)細胞活化和促炎細胞因子TNF-α和IL-6 表達。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)中的膠質(zhì)細胞對神經(jīng)損傷作出反應，產(chǎn)生炎癥標志物，促進慢性疼痛的發(fā)展[2]。α(2A)AR 和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均可通過不同途徑參與MIP 的發(fā)生，但在DRG 中兩者介導MIP 產(chǎn)生的潛在機制尚待闡明。本研究基于蝎蟄致痛MIP 模型，進一步探究α(2A)AR、神經(jīng)膠質(zhì)細胞在DRG 中參與MIP 的調(diào)控機制，以期找出MIP 發(fā)生的DRG 新路徑。

方 法

1.實驗動物

體重為200～250 g 的成年雄性SD (sprague-dawley, SD)大鼠購于中國科學院上海斯萊克實驗動物有限責任公司（SCXK (滬) 2022-0004），常規(guī)動物房飼養(yǎng)，每籠5 只，自由飲食，室溫21～26℃，空氣濕度50%，12 h 晝夜交替。所有實驗過程遵循國家實驗動物使用指南和國際疼痛學會(International Association for the study of pain, IASP)清醒動物疼痛實驗守則，經(jīng)延安大學動物倫理委員會審核通過（倫理批號yadx-smll-2021-0651）。

2.儀器設備

vonFrey 纖維(58011, Stoelting Co, USA)，輻射熱刺激器 （PL-200，成都泰盟科技有限公司），Leica 切片機（CM1900，北京悅昌行科技有限公司），激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 800，卡爾蔡司(上海)管理有限公司）。

3.藥品準備及實驗動物分組

BmK I：河南鄭州東亞鉗蝎養(yǎng)殖場購買的東亞鉗蝎粗毒，經(jīng)分離純化得到單一組分BmK I[15,16]。將10 μg BmK I 溶于50 μl 9%氯化鈉注射液(Saline)，經(jīng)大鼠左后足底中心皮下注射。以足底注射50 μl 無菌0.9%氯化鈉注射液為實驗對照?？蓸范?4205-90-7, Sigma)：0.9%氯化鈉注射液溶解，濃度分別為0.2 μg/μl、1 μg/μl 和5 μg/μl。參照Mestre 等[17]的方法實施鞘內(nèi)給藥。

32 只SD 大鼠隨機分為4 組(n= 8)，鞘內(nèi)分別注射10 μl 的0.9%氯化鈉注射液、2 μg Clo、10 μg Clo 和50 μg Clo，30 min 后，足底皮下注射10 μg/50 μl 的BmK I，以足底和鞘內(nèi)均注射0.9%氯化鈉注射液為對照。BmK I 注射完成后立即進行自發(fā)痛檢測，并于4 h 和8 h 檢測機械痛和熱痛閾值。

4.行為學測試

（1）自發(fā)痛：提前將大鼠放于行為學室適應環(huán)境，在測試箱適應30 min。測試箱為20 cm×20 cm×30 cm 的帶有透明玻璃底板的透明有機玻璃箱，放置在桌子上方75 cm 的支架上。鞘內(nèi)注射Clo 30 min后，根據(jù)實驗需求給大鼠足底分別注射0.9%氯化鈉注射液和不同濃度的BmK I，立即放回測試箱，連續(xù)觀察記錄自發(fā)疼痛行為2 h，記錄內(nèi)容包括每5 min 內(nèi)大鼠同側(cè)和對側(cè)足的縮足次數(shù)、舔足時間及次數(shù)、靜止時間，保持每5 min 記錄1 次。

（2）機械痛：自發(fā)痛檢測完成后，將大鼠按照編號放回鼠籠安靜30 min 后再適應30 min 至1 h，每只大鼠單獨放置。待大鼠安靜后用vonFrey 纖維(0.008～300 g)測定機械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 。

（3）熱痛：大鼠放置于20 cm×20 cm×30 cm大小的透明有機玻璃箱內(nèi)（2 mm 厚玻璃底板），測量其對熱刺激的敏感性。輻射熱刺激直接施加在大鼠左足足心處。自動切斷時間為25 s，在同一位點重復測量5 次，每2 次測量間隔至少10 min，為消除刺激方式的潛在干擾，不使用第1 次熱刺激數(shù)據(jù)，從隨后的4 個熱刺激中選取數(shù)據(jù)取平均值作為熱痛閾值。根據(jù)這一程序，在實驗前1 天確定熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) 基線。

5.實時定量PCR

大鼠經(jīng)鞘內(nèi)注射藥物和左足底皮下注射BmK I后，在2 h、4 h、8 h 和24 h 時分別急性分離DRG(L4～L5) 組織，鞘內(nèi)注射無菌0.9%氯化鈉注射液為對照組，進行總RNA 抽提。利用EasyScript One-Step Gdna Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311-02, TransGen Biotech) 步驟進行cDNA 合成，利 用Trans-Start?Green qPCR SuperMix (AQ101-01,TransGen Biotech) 進行mRNA 表達量檢測。實驗結束后，利用2-△△Ct法進行相對定量分析。

6.免疫印跡檢測 (Western blot)

行為測試后，使用RIPA 裂解液 (P0013B, Beyotine Biotechnology) 提取0.9%氯化鈉注射液或給藥組(n= 5)大鼠DRG 總蛋白，利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒 (PC0020, Solarbio) 定量。利用10%凝膠通過SDS-PAGE 分離所得的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜 (IPVH00010, Millipore) 上。使 用ECL 蛋白質(zhì)印跡試劑(P0018FM, Beyotime Biotechnology)進行可視化。顯影儀(5200Multi, Tanon)檢測蛋白質(zhì)條帶進行成像，使用Image J 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

7.免疫組織化學

行為學測試結束后，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉 (Tc-P8411, Merck) (60 mg/kg)深度麻醉后，灌注0.9%氯化鈉注射液。分離DRG，在4℃條件下4%多聚甲醛(143174, Biosharp)中固定48 h。然后將DRG浸潤在20%蔗糖（10021418，滬試）中24 h，用30%蔗糖浸潤至少48 h。使用Leica (CM1900)切片機制備切片(20 μm)。使用PBST [PBS (AP0321,AccuRef Scientific) + 0.3%Triton X-100 (T8200, Solarbio)]漂洗3 次，每次10 min。將切片放置在含有5%血清的PBST 中封閉2 h，孵育一抗GFAP 抗體(1:500, 53-9892-82, Invitrogen)、Integrin αM/CD11b 抗體 (OX42)(1:400, sc-53086, Santa Cruz)、IB4 (1:500, sc-65254,Santa Cruz)、NF200 抗體 (1:500, K009971M, Solarbio)，搖床上 4℃過夜。PBST 洗滌3 次，每次10 min，將熒光二抗滴加在組織切片上，室溫下避光孵育2 h，棄掉二抗溶液。添加DAPI 溶液(1:1000, C0060,Solarbio)，PBST 洗滌 3 次，每次10 min。滴加熒光封片劑(P0128S, Beyotime Biotechnology)后封片并干燥。使用具有20×物鏡的共聚焦顯微鏡(Zeiss 800)獲取一系列熒光圖像。使用Image J 軟件進行圖像統(tǒng)計分析。

8.統(tǒng)計學分析

本研究數(shù)據(jù)使用Image J 和GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計和分析。使用t檢驗、One-way ANOVA和Two-way ANOVA 進行組間差異性分析，統(tǒng)計結果采用均數(shù)±標準誤(±SEM) 表示。P＜ 0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.α(2A)AR 在DRG 中廣泛分布

首先，采用免疫組織化學分析正常SD 大鼠DRG 中α(2A)AR 的分布情況。結果表明，α(2A)AR與OX42（小膠質(zhì)細胞標記物）、IB4（非肽能神經(jīng)元標記物）、GFAP（衛(wèi)星/星形膠質(zhì)細胞標記物）和NF200（大直徑神經(jīng)元標記物）均有共定位（見圖1A-D)，其中α(2A)AR 與小膠質(zhì)細胞的共定位為60%（見圖1A），與非肽能神經(jīng)元的共定位為37%（見圖1B），與衛(wèi)星/星形膠質(zhì)細胞的共定位為75%（見圖1C），與大直徑神經(jīng)元的共定位為50%（見圖1D）。上述結果表明，α(2A)AR 在DRG 中大量分布，特別是在膠質(zhì)細胞中廣泛分布。

圖1 α(2A)AR 在DRG 中廣泛分布(A) α(2A)AR（紅色）和OX42（綠色）免疫熒光圖像及共定位分析；(B) α(2A)AR（紅色）和IB4（綠色）免疫熒光圖像及共定位分析；(C) α(2A)AR（紅色）和GFAP（綠色）免疫熒光圖像及共定位分析；(D) α(2A)AR（紅色）和NF200（綠色）免疫熒光圖像及共定位分析。比例尺 = 50 μmFig.1 α(2A)AR widely distribute in DRG(A) α(2A)AR (red) and OX42 (green) immunofluorescence images and colocalization analysis; (B) α(2A)AR (red) and IB4 (green) immunofluorescence images and colocalization analysis; (C) α(2A)AR (red) and GFAP (green) immunofluorescence images and colocalization analysis; (D) α(2A)AR (red) and NF200 (green) immunofluorescence images and colocalization analysis.Scale bar = 50 μm

2.MIP 過程中雙側(cè)DRG 中α(2A)AR 不對稱表達

為明確DRG α(2A)AR 是否參與MIP 過程，利用實驗室構建的東亞鉗蝎蝎毒素BmK I MIP 模型[10]，檢測MIP 不同時間點，雙側(cè)DRG 中α(2A)AR 的表達。結果顯示，BmK I 注射2 h 時，同側(cè)DRG 中α(2A)AR mRNA 表達升高，在 1 h、4 h、8 h 和24 h與對照組相比無差異（見圖2A）。在對側(cè)DRG 中，BmK I 注射后1 h、2 h、4 h、8 h 和24 h 與對照組相比均無顯著差異（見圖2B）。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測BmK I 刺激后2 h、4 h、8 h 和24 h，雙側(cè)DRG 中α(2A)AR 蛋白的表達變化。結果表明，與對照組相比，同側(cè)DRG 中α(2A)AR 蛋白表達水平在2 h、4 h、8 h 和24 h 均顯著升高，在4 h 表達量最高（見圖2C），而在對側(cè)DRG 中，2 h、4 h、8 h 和24 h 均升高，在2 h 達到最大值（見圖2D）。這些數(shù)據(jù)表明，疼痛狀態(tài)下，α(2A)AR 在雙側(cè)DRG 中的表達存在不對稱性，提示α(2A)AR 參與MIP 的發(fā)生發(fā)展。

3.激活α(2A)AR 緩解鏡像疼痛行為

為了進一步評估DRG α(2A)AR 是否參與鏡像疼痛行為，在BmK I 注射前30 min，鞘內(nèi)注射Clo或等量的0.9%氯化鈉注射液作為對照組，檢測其對BmK I 誘導的疼痛行為的影響（見圖3A）。Clo處理后，大鼠縮足次數(shù)減少，縮足次數(shù)隨著Clo 濃度的增加略有減少（見圖3B）。2 μg Clo 縮足次數(shù)比對照組低30%，10 μg Clo 退縮總數(shù)比對照組低50%，50 μg Clo 縮足次數(shù)比對照組低70%（見圖3C）。此外，與基線相比，BmK I 刺激后4 h 和8 h的雙側(cè)機械痛反應閾值降低（見圖3D）。此外，Clo 組則增加4 h 和8 h 同側(cè)和對側(cè)的機械痛閾值（見圖3E, 3F），但熱敏反應閾值無明顯差異（見圖3G, 3H）。這些結果表明，激活α(2A)AR 顯著緩解了BmK I 誘導的MIP 行為。

圖3 激活 α(2A)AR 抑制鏡像疼痛行為(A)藥物注射和行為測量時間表的示意圖；(B)鞘內(nèi)注射2 μg、10 μg 和50 μg Clo 后每5 min 自發(fā)縮足次數(shù)(n = 8)；(C) Clo 治療后2 h 內(nèi)的退縮總數(shù)(n = 8)；(D) Clo 治療后2 h 舔咬抬足行為時間(n = 8)；Clo 治療后同側(cè)(E)和對側(cè)(F)機械痛敏閾值分析(n = 8)；Clo 治療后同側(cè)(G)和對側(cè)(H)熱痛敏閾值分析(n = 8)**P ＜ 0.01，****P ＜ 0.0001，與Control 組相比Fig.3 Activation of α(2A)AR alleviates mirror-image pain behaviors(A) Schematic of drug injection and behavioral measurement schedule; (B) Number of spontaneous paw withdrawal per 5 min after intrathecal injection of 2 μg, 10 μg, and 50 μg Clo (n = 8); (C) Total number of flinches within 2 h after Clonidine treatment (n = 8); (D) Time of licking, biting and foot lifting behavior 2 h after Clo treatment (n = 8); Analysis of ipsilateral (E) and contralateral (F) mechanical hyperalgesia threshold after Clo treatment (n = 8); Analysis of ipsilateral (G)and contralateral (H) thermal hyperalgesia thresholds after Clo treatment (n = 8).**P ＜ 0.01, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

4.激活α(2A)AR 促進雙側(cè)DRG 膠質(zhì)細胞活化

為了進一步探究MIP 發(fā)生發(fā)展中雙側(cè)DRG 膠質(zhì)細胞表達情況，首先利用免疫印跡檢測MIP 發(fā)生發(fā)展中DRG 雙側(cè)GFAP 和OX42 的蛋白表達（見圖4A, 4B）。結果顯示，在BmK I 刺激下，同側(cè)DRG中衛(wèi)星膠質(zhì)細胞標志物GFAP在2 h上調(diào)，在4 h、8 h 和24 h 與對照組相比無差異（見圖4C）。對側(cè)DRG 中衛(wèi)星膠質(zhì)細胞標志物蛋白GFAP 在24 h 表達上調(diào)，在2 h、4 h 和8 h 表達與對照組相比無差異（見圖4D）。此外，在BmK I 刺激下，與對照組相比，同側(cè)DRG 中OX42 在2 h 至24 h 蛋白表達下調(diào)（見圖4E），而對側(cè)DRG 中OX42 在2 h 至4 h 蛋白表達上調(diào)，在2 h 達到峰值，但在24 h 時下調(diào)（見圖4F）。以上結果表明，MIP 發(fā)生發(fā)展中雙側(cè)DRG中膠質(zhì)細胞標志物蛋白表達存在差異性。

圖4 Bmk I 刺激下DRG 中膠質(zhì)細胞標志物蛋白表達分析(A) Bmk I 刺激下，DRG 中同側(cè)GFAP、OX42 蛋白表達；(B) Bmk I 刺激下，DRG 中對側(cè)GFAP、OX42 蛋白表達；(C) Bmk I 刺激下，DRG 中同側(cè)GFAP 蛋白表達分析(n = 5)；(D) Bmk I 刺激下，DRG 中對側(cè)GFAP 蛋白表達分析(n = 5)；(E) Bmk I 刺激下，DRG 中同側(cè)OX42 蛋白表達分析(n = 5)；(F) Bmk I 刺激下，DRG 中對側(cè)OX42蛋白表達分析(n = 5)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.0001，與Control 組相比Fig.4 Expression of glial proteins in DRG under Bmk I stimulation(A) The expression of ipsilateral GFAP and OX42 proteins in DRG stimulated by Bmk I; (B) The expression of contralateral GFAP and OX42 proteins in DRG stimulated by Bmk I; (C) Analysis of ipsilateral GFAP protein expression in DRG under BmkI stimulation (n = 5); (D) Analysis of contralateral GFAP protein expression in DRG under Bmk I stimulation(n = 5); (E) Analysis of ipsilateral OX42 protein expression in DRG under Bmk I stimulation (n = 5); (F) Analysis of ipsilateral OX42 protein expression in DRG stimulated by Bmk I (n = 5).*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

為明確MIP 發(fā)生發(fā)展中雙側(cè)DRG 中α(2A)AR對膠質(zhì)細胞的影響，在BmK I 注射前30 min 鞘內(nèi)注射Clo。結果顯示，鞘內(nèi)注射Clo 后，同側(cè)DRG中α(2A)AR mRNA 水平在1 h 時降低，2 h、4 h 和8 h 逐漸恢復至對照組水平，但在24 h 表達下調(diào)（見圖5A），對側(cè)DRG 中，α(2A)AR 在1 h 至24 h 明顯降低（見圖5B）；同側(cè)DRG 中α(2A)AR 蛋白水平在2 h 無差異，在4 h、8 h 和24 h 蛋白表達上調(diào)（見圖5C, 5E），對側(cè)DRG 中α(2A)AR 蛋白在2 h、4 h、8 h 和24 h 顯著升高（見圖5D, 5H）；同側(cè)GFAP 蛋白水平在2 h 無差異，在4 h、8 h 和24 h 極顯著升高（見圖5F），對側(cè)GFAP 蛋白水平在2 h至24 h 明顯下調(diào)（見圖5I）；同側(cè)DRG 中OX42 蛋白在2 h 至24 h 明顯上調(diào)，24 h 最高（見圖5G），對側(cè)OX42 蛋白在2 h 至24 h 明顯上調(diào)，24 h 達到最大值（見圖5J）。以上數(shù)據(jù)表明，激活 DRG 中α(2A)AR 會改變雙側(cè)膠質(zhì)細胞標志物的蛋白表達，與已有研究一致[18]。MIP 發(fā)生發(fā)展過程中，α(2A)AR激活引起同側(cè)DRG 中衛(wèi)星膠質(zhì)細胞和雙側(cè)小膠細胞標志物表達上調(diào)，但是激活α(2A)AR 抑制了對側(cè)DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞標志物的表達。說明DRG 中衛(wèi)星膠質(zhì)細胞參與了α(2A)AR 介導的MIP 鎮(zhèn)痛效應。

圖5 激活α(2A)AR 抑制對側(cè)DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞的激活可樂定治療后1 h、2 h、4 h、8 h 和24 h 同側(cè)α(2A)AR (A)和對側(cè)α(2A)AR (B) mRNA 表達量；可樂定治療后 2 h、4 h、8 h 和24 h 時α(2A)AR、GFAP 和OX42 同側(cè)(C)和對側(cè)(D) 蛋白表達圖；可樂定治療后 2 h、4 h、8 h 和24 h同側(cè)α(2A)AR (E)和對側(cè)α(2A)AR (H)蛋白分析(n = 5)；可樂定治療后 2 h、4 h、8 h 和24 h 同側(cè)GFAP (F) 和對側(cè)GFAP (I)蛋白分析(n = 5)；可樂定治療后2 h、4 h、8 h 和24 h 同側(cè)OX42 (G) 和對側(cè)OX42 (J)蛋白分析(n = 5)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，****P ＜ 0.0001，與Control 組相比Fig.5 Activation of α (2A) AR inhibits contralateral DRG satellite glia Ipsilateral (A) and contralateral (B) mRNA expression of α(2A)AR after clo treatment at 1 h, 2 h, 4 h, 8 h and 24 h.The α(2A) AR, GFAP, and OX42 ipsilateral (C) and contralateral (D) protein expression at 2 h, 4 h, 8 h, and 24 h after treatment with clonidine.The ipsilateral α(2A)AR (E) and contralateral α(2A)AR (H) protein expression analysis after clonidine treatment at 2 h, 4 h, 8 h and 24 h (n = 5).The ipsilateral GFAP (F) and contralateral GFAP (I) protein expression analysis after clonidine treatment at 2 h, 4 h, 8 h and 24 h (n = 5).The ipsilateral OX42 (G) and contralateral OX42 (J)protein expression analysis after clonidine treatment at 2 h, 4 h, 8 h and 24 h (n = 5).*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

5.激活α(2A)AR 降低DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中α(2A)AR 的表達

MIP 期間DRG 膠質(zhì)細胞中α(2A)AR 的表達情況結果顯示，BmK I 刺激下，同側(cè)（見圖6A）及對側(cè)（見圖6B）DRG 在4 h 時α(2A)AR 與GFAP 共定位均明顯升高，給藥Clo 后，α(2A)AR 與GFAP 的共定位均明顯降低。在BmK I 刺激下，同側(cè)DRG在4 h 時α(2A)AR 與OX42 共定位升高，給藥Clo后，α(2A)AR 與OX42 共定位無明顯變化（見圖6C），對側(cè)DRG 中 α(2A)AR 與OX42 共定位無明顯差異，給藥Clo后α(2A)AR與OX42無明顯差異（見圖6D）。表明激活α(2A)AR 降低DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中α(2A)AR 的表達，而不影響小膠質(zhì)細胞中α(2A)AR的表達。提示DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中的α(2A)AR 調(diào)控MIP 發(fā)生發(fā)展。

圖6 激活α(2A)AR 降低DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中α(2A)AR 的表達(A) BmK I 刺激后4 h，DRG 中同側(cè)α(2A)AR（紅色），可樂定處理后 4 h，α(2A)AR（紅色）與GFAP（綠色）雙熒光代表性圖像及分析；(B) BmK I刺激后4 h，DRG中對側(cè)α(2A)AR（紅色），可樂定處理后 4 h ，α(2A)AR（紅色）與GFAP（綠色）雙熒光代表性圖像及分析；(C) BmK I 刺激后4 h，DRG 中同側(cè)α(2A)AR（紅色），可樂定處理后4 h，α(2A)AR（紅色）與OX42 （綠色）雙熒光代表性圖像及分析；(D) BmK I 刺激后4 h，DRG 中對側(cè)α(2A)AR （紅色），可樂定處理后4 h，α(2A)AR（紅色）與OX42 （綠色）雙熒光代表性圖像及分析。比例尺 = 100 μm*P ＜ 0.05，****P ＜ 0.0001，與Control 組相比Fig.6 Activation of α(2A)AR reduces the expression of α(2A)AR in DRG satellite glia cells(A) Dual-fluorescence representative images and analysis of ipsilateral α(2A)AR (red) in DRG after 4 h of BmK I stimulation, α(2A)AR (red) and GFAP (green) after 4 h of clonidine treatment; (B) Dual-fluorescence representative images and analysis of contralateral α(2A)AR (red) in DRG 4 h after BmK I stimulation, α(2A)AR (red) and GFAP (green) 4 h after clonidine treatment; (C) Dual-fluorescence representative images and analysis of ipsilateral α(2A)AR (red) in DRG at 4 h after BmK I stimulation and α(2A)AR (red) and OX42 (green) at 4 h after clonidine treatment; (D) Dual-fluorescence representative images and analysis of contralateral α(2A)AR (red) in DRG 4 h after BmK I stimulation and α(2A)AR (red)and OX42 (green) 4 h after clonidine treatment.Scale bar = 100 μm*P ＜ 0.05, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

討 論

MIP 的發(fā)生過程伴隨著復雜的生理和生化變化。本研究顯示，鞘內(nèi)注射Clo 大鼠縮足次數(shù)減少，機械痛閾值增加，說明Clo 起到鎮(zhèn)痛作用。已有研究表明，大鼠腹腔內(nèi)注射 α(2A)AR 激動劑 Clo 顯著抑制雙側(cè)機械痛和熱痛的發(fā)生[14]。與Clo 在臨床中起著鎮(zhèn)靜、降低心率等作用[12]相一致，與2 μg 和5 μg Clo 劑量相比，50 μg Clo 劑量下鎮(zhèn)痛效果最佳，更能緩解MIP 的發(fā)生。在DRG 中α(2A)AR 在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞均有大量表達，α(2A)AR 在DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中高表達，這可能與DRG 中的膠質(zhì)細胞參與慢性疼痛的發(fā)展[2]有關。已有研究表明，衛(wèi)星膠質(zhì)細胞縫隙連接通道與 G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員互作介導疼痛的發(fā)生[2]。α(2A)AR 作為 G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，參與疼痛的發(fā)生過程[11]。

疼痛狀態(tài)下，α(2A)AR 在雙側(cè)DRG 中的表達存在不對稱性，再次表明α(2A)AR 參與MIP 的發(fā)生發(fā)展。大鼠進行部分坐骨神經(jīng)結扎后，雙側(cè)神經(jīng)膠質(zhì)激活標記物增加[14]。本研究的結果顯示，雙側(cè)膠質(zhì)細胞的表達在不同MIP 時間點呈現(xiàn)雙側(cè)時間差異性，在BmK I 刺激下，與對照組相比同側(cè)DRG 中GFAP 標志物在2 h 表達上調(diào)，對側(cè)在24 h 表達上調(diào)；同側(cè)OX42 表達下調(diào)，對側(cè)表達上調(diào)，提示MIP 過程中DRG 膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出雙側(cè)異質(zhì)性，膠質(zhì)細胞參與了MIP 發(fā)生。已有研究表明，衛(wèi)星膠質(zhì)細胞縫隙連接介導的細胞網(wǎng)絡，允許各種離子和炎癥介質(zhì)的擴散，以促進異常性疼痛信號傳導和遠距離傳輸[19]。齊雪濤等[20]報道，動物經(jīng)歷特定行為事件時，大腦中與此行為相關的神經(jīng)元會激活，c-fos、Arc 等表達上調(diào)。脊髓衛(wèi)星膠質(zhì)細胞的激活有助于紫杉醇誘導的神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機制的形成，給藥紫杉醇后7 天（即小鼠出現(xiàn)熱痛的時間點），GFAP 轉(zhuǎn)錄物水平升高5 倍以上，GFAP 蛋白表達增加，衛(wèi)星膠質(zhì)細胞活化，靶向衛(wèi)星膠質(zhì)細胞激活是調(diào)控神經(jīng)性疼痛的治療途徑[21]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，BmK I 刺激下，雙側(cè)DRG 中衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中的α(2A)AR 表達上調(diào)，α(2A)AR 激活后，雙側(cè)DRG 衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中α(2A)AR 的表達下調(diào)，而影響小膠質(zhì)細胞中α(2A)AR 的表達，這可能與α(2A)AR 激活后引起GFAP的表達升高有關。此外，疼痛刺激下雙側(cè)衛(wèi)星膠質(zhì)細胞激活，而小膠質(zhì)細胞活性被抑制，鞘內(nèi)注射衛(wèi)星膠質(zhì)細胞抑制劑后緩解疼痛[18]。

綜上所述，本研究證明DRG 中衛(wèi)星膠質(zhì)細胞α(2A)AR 參與了MIP 的鎮(zhèn)痛效應，進一步表明激活α(2A)AR 抑制對側(cè)DRG 中衛(wèi)星膠質(zhì)激活緩解MIP的發(fā)生發(fā)展。衛(wèi)星膠質(zhì)細胞增殖和活化與疼痛發(fā)生緊密相關[8,9]，衛(wèi)星膠質(zhì)細胞α(2A)AR 參與MIP 發(fā)生發(fā)展和調(diào)控的下游分子通路有待進一步探究。已報道衛(wèi)星膠質(zhì)細胞表面表達多種信號傳遞分子，其中縫隙連接蛋白Cx43 可以傳遞炎癥刺激信號，主要在衛(wèi)星膠質(zhì)細胞中表達，是衛(wèi)星膠質(zhì)細胞整合核心[22,23]。因此，深入解析DRG 中Cx43 是否參與以及如何參與α(2A)AR 介導的MIP 的發(fā)生發(fā)展，將可能闡明α(2A)AR 介導MIP 的鎮(zhèn)痛機制，為靶向α(2A)AR 治療或開發(fā)MIP 藥物奠定理論基礎。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。