楊文華 李娟紅

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院疼痛科，北京 100038）

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是成年人關(guān)節(jié)炎中常見的類型，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙的主要原因，也是導(dǎo)致殘疾的第四大原因[1]。OA 最常見于膝關(guān)節(jié)，以進(jìn)行性軟骨退化、軟骨下骨增生、骨贅形成、半月板退變、韌帶鈣化和滑膜增生等為特征[2]。美國約有3200 萬人、全球超過2.4 億人患有OA[3]。預(yù)計到2032 年，45 歲以上人群中約30%患有OA[4]。OA 的治療方法包括早期的非手術(shù)治療和后期的關(guān)節(jié)置換。非手術(shù)治療包括控制體重、運(yùn)動療法、物理治療、藥物治療等，以減輕疼痛、控制癥狀為主要目的，但治療效果有限，不能阻止疾病的進(jìn)展，最終會導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙甚至殘疾。目前，尚缺乏有效手段來干預(yù)OA 的發(fā)生和/或阻止OA 的進(jìn)展。

干細(xì)胞具有沿著不同譜系分化的能力，能緩解疼痛，促進(jìn)軟骨恢復(fù)，改善關(guān)節(jié)功能。2001 年至2021年科學(xué)核心收藏網(wǎng)(Web of Science Core Collection)的出版物中顯示干細(xì)胞被廣泛用于OA 研究，其中軟骨修復(fù)和旁分泌功能是目前干細(xì)胞機(jī)制的研究熱點(diǎn)，而且干細(xì)胞治療已經(jīng)從基礎(chǔ)研究逐步推進(jìn)到臨床應(yīng)用階段[1]。異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSCs)被證實(shí)為克羅恩病伴肛瘺的安全且有效的臨床治療手段[5]。

目前有關(guān)干細(xì)胞治療OA 的研究大多側(cè)重于軟骨修復(fù)機(jī)制，而對鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究相對較少。本文將重點(diǎn)闡述干細(xì)胞治療OA 的機(jī)制，尤其是鎮(zhèn)痛機(jī)制的進(jìn)展，同時對2020 年以來的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的最新進(jìn)展進(jìn)行評述。以期為干細(xì)胞治療OA的基礎(chǔ)與臨床研究提供參考資料。

一、干細(xì)胞

干細(xì)胞包括成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是從胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中獲得的，人類胚胎干細(xì)胞的使用涉及法律和倫理方面的顧慮，臨床應(yīng)用較少。而成體干細(xì)胞的使用涉及法律和倫理方面的問題較少，目前成體干細(xì)胞種類較多，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)也叫間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，最早于1970 年被Friedenstein 等發(fā)現(xiàn)于人類骨髓中；脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)、骨髓干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞和人臍帶血液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞/Whatton's Jelly 源間充質(zhì)干細(xì)胞是目前軟骨組織中最廣泛使用的MSCs 來源，每一種都具有其各自的軟骨再生特征優(yōu)勢[6]。在過去的十年中，干細(xì)胞移植在修復(fù)神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)綜合征的神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面顯示出巨大的潛力，而不僅僅是提供暫時的緩解。干細(xì)胞治療已成為NP的替代治療方法。

1.干細(xì)胞治療OA 的機(jī)制

（1）分化為軟骨：MSCs 可以從軟骨下骨遷移到受損部位，并分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞來修復(fù)軟骨和軟骨下骨組織[7]。與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，MSCs 顯著提高軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因aggrecan、sox-9和col-2 的mRNA 表達(dá)水平，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制軟骨細(xì)胞凋亡[8]。轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor beta, TGF-β) 通過ERK/JNK 信號通路調(diào)節(jié)維生素D 的功能，繼而促進(jìn)MSCs 的細(xì)胞增殖和遷移，最終影響軟骨細(xì)胞分化[9]。生長因子、支架和共培養(yǎng)技術(shù)等常用于改善MSCs 的軟骨細(xì)胞分化潛能。神經(jīng)生長因子可以顯著上調(diào)MSCs 軟骨特異性標(biāo)記物的表達(dá)。納米纖維基聚醚砜支架可以增強(qiáng)MSCs 分化為軟骨的潛力，同時保持MSCs 的增殖和分化能力[10]。MSCs 分化為軟骨細(xì)胞、促進(jìn)軟骨再生的效應(yīng)仍存在爭議。促進(jìn)軟骨再生在一些臨床環(huán)境中觀察到了，而在部分研究中沒有[11]。這些差異可能是由于OA 程度較高的病人參與、活性軟骨細(xì)胞數(shù)量稀少或隨訪時間短等因素導(dǎo)致。然而，也有研究認(rèn)為MSCs 的作用可能不是由于其直接分化為再生或替代組織[11]。

（2）旁分泌：MSCs 參與組織修復(fù)的主要方式是旁分泌，通過分泌外泌體、釋放多種具有不同特性的營養(yǎng)因子來減少組織損傷和促進(jìn)組織修復(fù)。Platas等[12]報道ADMSCs 的條件培養(yǎng)基具有OA 保護(hù)作用，其機(jī)制可能是ADMSCs 旁分泌作用對抗炎癥應(yīng)激誘導(dǎo)的OA 軟骨細(xì)胞過早衰老。TGF-β1 刺激可促進(jìn)MSCs 外泌體中miR-135b 的表達(dá)上調(diào)；該外泌體與大鼠軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞中SP1（抑制軟骨細(xì)胞增殖）表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活力增強(qiáng)，軟骨細(xì)胞增殖增加。MSCs 通過釋放含miR-135b 的外泌體下調(diào)SP1 的表達(dá)，改善軟骨細(xì)胞的活性[13]。與二維培養(yǎng)相比，3D 球體培養(yǎng)可以提高M(jìn)SCs 分泌外泌體的產(chǎn)量，通過增強(qiáng)MSCs 的旁分泌效應(yīng)來改善細(xì)胞恢復(fù)功能[14]。

（3）抗炎和免疫調(diào)節(jié)：降低趨化因子和炎癥因子的濃度。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs) 治療后兔血清MMP-3、MMP-13、白介素-6 (interleukin, IL-6)、IL-8 水平較治療前明顯下降；UC-MSCs 對OA 軟骨和滑膜具有保護(hù)作用，這與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)[15]。

（4）“歸巢”調(diào)節(jié)：MSCs 會優(yōu)先聚集在組織損傷和炎癥部位。在治療OA 時，MSCs 能靶向傳遞到受損的關(guān)節(jié)軟骨，抑制免疫介導(dǎo)的軟骨破壞，并通過軟骨分化和內(nèi)在殘余修復(fù)的旁分泌刺激促進(jìn)軟骨修復(fù)。1983 年，Gallation 首次提出循環(huán)中的淋巴細(xì)胞有遷移回派生它們的淋巴組織部位的傾向?yàn)椤傲馨图?xì)胞的歸巢”，后來“歸巢”這一概念逐漸引申到干細(xì)胞。2009 年，Krap 等[16]將MSCs 的“歸巢”定義為：MSCs 在目標(biāo)組織的脈管系統(tǒng)中被捕獲，跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞并遷移至目標(biāo)組織的過程。歸巢過程可分為5 個步驟：①系留和滾動(tethering and rolling)：MSCs 表達(dá)CD44，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)選擇素，CD44 與選擇素結(jié)合，使MSCs 沿著血管壁滾動。② 激活(activation)：G 蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體與內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1 結(jié)合。③逮捕 (arrest)：MSCs 表達(dá)的VLA-4 與內(nèi)皮細(xì)胞上的VCAM-1 相互作用。④滲出 (transmigration or diapedesis)：MSCs 在基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的作用下穿過內(nèi)皮細(xì)胞層和基底膜。⑤遷移 (migration)：MSCs 在損傷部位釋放的趨化信號的引導(dǎo)下，通過細(xì)胞外基質(zhì)遷移[7]。在炎癥損傷的情況下，損傷部位SDF-1 表達(dá)增加，與MSCs 表達(dá)的CXCR4 結(jié)合，使得MSCs 定植受損器官。TGFβ1 可以顯著提高M(jìn)SCs 表面CXCR4的表達(dá)和MSCs 的歸巢率[17]。體外對MSCs 進(jìn)行缺氧預(yù)處理也可以上調(diào)CXCR4 表達(dá)，從而顯著增加MSCs 的歸巢率并增強(qiáng)修復(fù)效果[18]。關(guān)節(jié)內(nèi)給藥后，人整合素α10β1 選擇的MSCs 向兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的遷移和歸巢[19]。有關(guān)MSC 與破骨細(xì)胞關(guān)系的研究較少，OA 破骨細(xì)胞生成增多，軟骨下骨丟失增加。破骨細(xì)胞活性可誘導(dǎo)MSC 遷移和成骨，有利于MSCs 進(jìn)入關(guān)節(jié)。MSCs 通過與破骨細(xì)胞接觸、釋放因子（如骨保護(hù)素）和細(xì)胞外囊泡等方式來影響破骨細(xì)胞分化、成熟[20]。OA 病人關(guān)節(jié)內(nèi)注射ADMSCs 可改變循環(huán)破骨細(xì)胞前體的比例[11]。

2.干細(xì)胞對OA 鎮(zhèn)痛的機(jī)制

疼痛是一種主觀感受，動物的OA 疼痛感受只能通過行為學(xué)的觀察、疼痛相關(guān)通路的檢測來評估，因此動物OA 疼痛模型的參考作用有限。干細(xì)胞緩解OA 疼痛的研究相對較少，主要聚焦于抗炎作用。

（1）抑制炎癥，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)

MSCs 具有特定的免疫調(diào)節(jié)特性和抗炎功能，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)和抗炎的物質(zhì)，能夠下調(diào)免疫炎癥過程并促進(jìn)組織再生[21]，緩解大鼠關(guān)節(jié)炎的炎癥?？赡苡腥N方式來適應(yīng)免疫系統(tǒng)。①M(fèi)SCs 通過抑制成熟樹突狀細(xì)胞的發(fā)育、抑制IL-2 誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞增殖和降低NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性[22]來控制先天免疫。②MSCs 可以通過抑制細(xì)胞凋亡和減緩T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的發(fā)育來調(diào)節(jié)獲得性免疫[23]。③MSCs 可以將巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞從炎癥 (M1) 表型轉(zhuǎn)換為抗炎 (M2) 表型[24]。M1 表型可產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor, TNF-α)、IL-β 等多種炎癥因子，誘導(dǎo)一氧化氮合酶(iNOs)上調(diào)；M2 表型可分泌TGF-β、IL-10 等抗炎細(xì)胞因子[20]。BM-MSCs 鞘內(nèi)注射，促使M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2 型，并下調(diào)TNF-α、IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、緩解中樞敏化表達(dá)并促進(jìn)巨噬細(xì)胞滅活因子 (IL-4、IL-10) 的釋放[25]。BM-MSCs 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB通路，減少脊髓中AMPK/NF-κB 依賴性神經(jīng)炎癥，從而緩解慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress,CRS) 引起的痛覺過敏[26]。MSCs 可產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1 表型，促進(jìn)M2 表型，抑制NF-κB，同時促進(jìn)PI3K/AKT信號通路的激活，抑制神經(jīng)炎癥，從而緩解去神經(jīng)痛[23]。BM-MSCs 通過分泌TSG-6 抑制同側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR2/MyD88/NF-κB 通路的激活，抑制脊髓組織中坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury, CCI) 模型誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，改善機(jī)械性痛覺異常和熱痛覺過敏[24]。從M1 到M2 的免疫轉(zhuǎn)換有助于減少關(guān)節(jié)周圍炎癥、緩解OA。BM-MSCs 可以改善局部細(xì)胞功能、消除感染和抑制致病性免疫反應(yīng)。④保護(hù)神經(jīng)元：MSCs可產(chǎn)生GDNF，抑制神經(jīng)炎癥，緩解去神經(jīng)痛，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[23]。通過促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌或自身分泌營養(yǎng)因子（如TGF-β1、血管生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等），促進(jìn)受損神經(jīng)纖維修復(fù)，改善炎癥微環(huán)境[26]。Ichiseki 等[27]報道大鼠肩關(guān)節(jié)注射單碘乙酸鹽 (monoiodoacetate, MIA) 的OA模型中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSCs 下調(diào)脊髓背角抗降鈣素基因相關(guān)肽 (anti-calcitonin gene related peptide, CGRP)的表達(dá)，抑制疼痛中樞敏化，關(guān)節(jié)內(nèi)給藥MSCs 可以有效治療早期關(guān)節(jié)炎的疼痛。

（2）MSCs 的“歸巢”

MSCs 遷移到損傷部位發(fā)揮其對NP 的鎮(zhèn)痛作用。脊神經(jīng)結(jié)扎后脊髓中趨化因子配體13 (C-X-C motif chemokine ligand 13, CXCL13) 增加，CXCL13介導(dǎo)綠色熒光蛋白標(biāo)記的IL-1β-BM-MSCs 定向遷移到同側(cè)脊髓。IL-1β-BM-MSCs 可以通過降低脊髓中趨化因子C-C 基元配體7 (chemokine C-C motif ligand 7, CCL7) 的水平來抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)性疼痛[28]。在樹脂毒素介導(dǎo)的NP 小鼠模型中，BM-MSCs 移植可定向遷移至脊髓背角，通過減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化和激活p38 MAPK 通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[29]。MSCs 遷移機(jī)制的深入研究可能是提高OA鎮(zhèn)痛療效率的新靶點(diǎn)。

（3）阿片類受體

CXCL1-CXCR2 信號傳導(dǎo)相關(guān)的中樞μ 阿片受體的激活在BM-MSC 緩解痛覺過敏中起著重要作用[30]。BM-MSCs 在不同的時間域中激活外周和中樞阿片受體緩解CCI 大鼠NP[31]。BM-MSCs 的單次靜脈或局部損傷部位注射緩解CCI 疼痛超敏反應(yīng)，在輸注BM-MSCs 后1～5 周，納洛酮（作用于外周和中樞阿片的受體拮抗劑）能再次誘發(fā)疼痛超敏反應(yīng)，而納洛酮甲氧碘（外周作用的阿片受體拮抗劑）僅在BM-MSCs 治療的前3 周再次誘發(fā)痛覺過敏。RNA 干擾對腦干μ 阿片受體的局灶性下調(diào)逆轉(zhuǎn)了BM-MSCs 移植的鎮(zhèn)痛作用。

（4）分泌細(xì)胞外囊泡抑制疼痛

BM-MSCs 可間接通過釋放囊泡發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。膠原酶誘導(dǎo)的OA 小鼠模型中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSCs和MSCs 分泌組(secretome)產(chǎn)生了類似的結(jié)果，均可早期減輕OA 疼痛和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[32]。慢性壓迫背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)大鼠模型中，鞘內(nèi)注射BM-MSCs 裂解物可以產(chǎn)生類似BM-MSCs的疼痛緩解作用，BM-MSCs 通過釋放胞內(nèi)物質(zhì)（如外泌體、囊泡等）引起脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4R 表達(dá)下調(diào)來減輕神經(jīng)性疼痛[25]。

二、干細(xì)胞治療OA 的動物試驗(yàn)和臨床研究

1.動物試驗(yàn)

動物實(shí)驗(yàn)表明，干細(xì)胞有利于緩解OA 疼痛、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和半月板損傷防止軟骨降解、恢復(fù)軟骨細(xì)胞增殖和抑制炎癥反應(yīng)（見表1）。同種異體BM-MSCs 外泌體促進(jìn)MIA 誘導(dǎo)OA 大鼠的軟骨修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)合成，上調(diào)軟骨組織中COL2A1蛋白，下調(diào)MMP13 蛋白；減輕膝關(guān)節(jié)疼痛，抑制OA 大 鼠DRG 組 織 中CGRP 和iNOS 的 上 調(diào)[33]。MIA 誘導(dǎo)的大鼠OA 模型，宏觀和組織學(xué)切片顯示生理鹽水(normal saline, NS)組關(guān)節(jié)軟骨損傷、發(fā)炎、不均勻且薄，并有深染細(xì)胞浸潤；基質(zhì)血管成分 (stromal vascular fraction, SVF)和脂肪干細(xì)胞 (adipose-derived stem cells, ADSCs) 組的軟骨表面在第14 天光滑明亮、已恢復(fù)到幾乎正常；SVF 和ADSC組的白細(xì)胞計數(shù)高于NS 組。SVF 和ADSC 組在第7 天和第14 天的血漿IL-1β 水平降低。SVF 和ADSC有助于軟骨損傷后的關(guān)節(jié)軟骨再生[34]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)通過防止軟骨降解、恢復(fù)軟骨細(xì)胞增殖和抑制炎癥反應(yīng)來改善MIA 誘導(dǎo)的OA。UC-MSCs 下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-13 (matrix metalloproteinase-13, MMP13)、具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶5 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS-5) 的表達(dá)，增強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨中II 型膠原和ki67 的表達(dá)，降低IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)，同時增加TNF-α 誘導(dǎo)的蛋白6 和IL-1 受體拮抗劑[35]。

表1 2020 年以來干細(xì)胞治療OA 動物模型臨床前試驗(yàn)總結(jié)

2.臨床研究

臨床研究表明，干細(xì)胞治療OA 有利于緩解關(guān)節(jié)疼痛、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和半月板損傷、改善生活質(zhì)量（見表2）。MSCs 用于膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛管理尚未廣泛應(yīng)用于臨床，仍處于基礎(chǔ)研究階段，未來可作為新向標(biāo)予以深入研究[41]。

表2 2020 年以來干細(xì)胞治療OA 臨床研究總結(jié)

三、總結(jié)

干細(xì)胞具有分化和自我更新的能力，通過分化為軟骨、旁分泌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)、“歸巢”等機(jī)制修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，通過抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、歸巢、調(diào)節(jié)阿片類受體、分泌細(xì)胞外囊泡等方式來緩解疼痛。更深入的研究干細(xì)胞的歸巢調(diào)節(jié)和干細(xì)胞來源外泌體的分子機(jī)制，將有助于優(yōu)化干細(xì)胞的OA 治療效果。干細(xì)胞治療 OA 有利于改善疼痛和功能評分，其對軟骨信號和MRI 形態(tài)學(xué)改善的研究較少，生成軟骨體積的測量需進(jìn)一步研究。為了解決臨床轉(zhuǎn)化的有效性和安全性問題，干細(xì)胞的來源、劑量、注射次數(shù)和佐劑等的優(yōu)化尚需相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范和引領(lǐng)這一領(lǐng)域的研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。