王萬(wàn)坤,康 超,曾維軍,鄭 旋,楊 玲,劉忠玄,王 芳,王 晶

(貴州省生物研究所,貴陽(yáng) 550009)

【研究意義】冬蓀別名竹下菌、竹菌和無(wú)裙蓀等,屬鬼筆目(Phallales)鬼筆科(Phallaceae)鬼筆屬(Phallus)真菌,是一種珍稀食藥用菌,其子實(shí)體具有活血止痛、祛風(fēng)除濕及抗癌等功效[1-2]。冬蓀是可食用鬼筆屬真菌統(tǒng)稱,常包括白鬼筆(P.inpudicus)、冬蓀(P.dongsun)、香筆菌(P.fragrans)、重脈鬼筆(P.costatus)等[3]。冬蓀作為貴州地理標(biāo)志產(chǎn)品,是貴州特色食用菌的重要支柱,栽培面積最多為白鬼筆和冬蓀。作為典型覆土食用菌,其生長(zhǎng)受土壤類型、土壤環(huán)境、栽培模式等影響,探究不同土壤環(huán)境及栽培周期內(nèi)覆土層土壤微生物群落特征,對(duì)實(shí)現(xiàn)其保產(chǎn)增產(chǎn)、提質(zhì)增效具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成,直接或間接地參與土壤物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換等過(guò)程[4]。土壤微生物的代謝功能受土壤微生物種群、土壤動(dòng)植物以及周圍土壤環(huán)境影響[5],對(duì)土壤理化性質(zhì)、酶活、維護(hù)生態(tài)平衡發(fā)揮了巨大作用[4]。覆土食用菌的生長(zhǎng)受土壤微生物、理化性質(zhì)、酶活等影響,土壤微生物對(duì)食用菌原基的形成具有重要作用[6]。熊川等[7]研究認(rèn)為,羊肚菌菌塘土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐富性有利于羊肚菌生長(zhǎng),羊肚菌生長(zhǎng)需土壤中相關(guān)微生物或某些特殊物質(zhì)的刺激。王琳等[8]研究表明,在覆土層中添加惡臭假單胞菌,可促進(jìn)雙孢蘑菇菌絲的生長(zhǎng)和扭結(jié),產(chǎn)量提高24.9%。土壤微生物種類、數(shù)量與覆土食用菌之間必須保持動(dòng)態(tài)平衡,才有利于雙方的生長(zhǎng)。吳紅萍等[9]認(rèn)為,熟料作為竹蓀栽培料,可相對(duì)減少覆土層土壤微生物多樣性和土壤微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、水分和空間的競(jìng)爭(zhēng),為菌絲生長(zhǎng)、繁殖提供更多的營(yíng)養(yǎng)和適宜的土壤微環(huán)境。蘇德偉等[10]研究表明,覆土食用菌生長(zhǎng)能改變覆土層土壤微生物群落多樣性,竹蓀栽培不同時(shí)期土壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量依次增加,其中細(xì)菌占比達(dá)99.75%,同時(shí)也改變了土壤pH、氮、磷、鉀等含量及土壤酶活性和肥力等。詹穎馨等[11]對(duì)卵孢長(zhǎng)根菇覆土層微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究表明,覆土層真菌物種數(shù)量在采收期達(dá)最大值,細(xì)菌物種數(shù)量則隨著卵孢長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)不斷下降,而病害的發(fā)生則造成土壤微生物種類和豐度降低,土壤營(yíng)養(yǎng)元素消耗,pH降低。連作障礙普遍存在于各類作物中,也是導(dǎo)致土壤微生物多樣性變化的原因之一,呂楊蘭[12]研究表明,竹蓀連作導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量、脲酶、過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶、蛋白酶等發(fā)生變化,從而影響竹蓀正常生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】土壤微生物、理化性質(zhì)對(duì)覆土食用菌的生長(zhǎng)及子實(shí)體形成有明顯作用,但未見(jiàn)貴州冬蓀覆土微生物多樣性的相關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集貴州冬蓀主要種植地區(qū)不同土壤環(huán)境和不同生長(zhǎng)期土壤樣品,采用高通量測(cè)序技術(shù),分析不同土壤環(huán)境冬蓀覆土層土壤微生物群落組成、多樣性等結(jié)構(gòu)特征和土壤理化性質(zhì)變化,研究覆土層微生態(tài)各因素間相互關(guān)系,探究冬蓀整個(gè)生長(zhǎng)期微生物變化規(guī)律,為冬蓀高效栽培提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 冬蓀(P.dongsun)為貴州當(dāng)?shù)仄贩N,由貴州省生物研究所提供。

1.1.2 試劑 FastDNA?Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒(MP Biomedicals,美國(guó)),agArose瓊脂糖(biowest,西班牙),FastPfu Polymerase(TransGen,中國(guó)),AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,美國(guó)),NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒(Bioo Scientific,美國(guó)),MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒(Illumina,美國(guó)),土壤基本營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)檢測(cè)的相關(guān)試劑(分析純)均購(gòu)置于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器 Eppendorf 5424R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó)),NanoDrop2000型超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),BioTek?ELx800型酶標(biāo)儀(Biotek,美國(guó)),TL-48R型粉碎研磨儀(上海萬(wàn)柏生物科技有限公司,中國(guó)),FastPrep-24 5G型MP研磨儀(MP,美國(guó)),iCETM3500 AAS 原子吸收光譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),Kjeltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀(FOSS,丹麥)QuantusTMFluorometer型微型熒光計(jì)(Promega,美國(guó)),ABI GeneAmp?9700型PCR儀(ABI,美國(guó)),Miseq測(cè)序儀(Illumina,美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在貴州省大方縣進(jìn)行,試驗(yàn)地及土壤類型分別為林下壤土、耕地壤土和耕地沙質(zhì)土。林下壤土試驗(yàn)地海拔1766 m,種植前土壤堿解氮含量123.89 mg/kg,有效磷含量4.3 mg/kg,速效鉀含量61 mg/kg,有機(jī)質(zhì)含量122.23 g/kg,pH 4.78;耕地壤土試驗(yàn)地海拔1259 m,種植前土壤堿解氮含量76.35 mg/kg,有效磷含量31.46 mg/kg,速效鉀含量217 mg/kg,有機(jī)質(zhì)含量107.54 g/kg,pH 7.27;耕地沙質(zhì)土試驗(yàn)地為冬蓀連作第2年土壤,海拔1254 m,種植前土壤堿解氮60.50 mg/kg,有效磷97 mg/kg,速效鉀148 mg/kg,有機(jī)質(zhì)103.51 g/kg,pH 8.28。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤樣品采集 2021年3月,參考肖艷等[13]的方法將冬蓀種植于林下壤土、耕地壤土和耕地沙質(zhì)土中,試驗(yàn)地面積均為0.67 hm2。土壤樣品采集于2021年4月(即冬蓀栽培前期,E)、6月(菌絲生長(zhǎng)期,M)、9月(菌蕾生長(zhǎng)期,B)、11月(子實(shí)體生長(zhǎng)期,F)和12月(子實(shí)體衰敗期,D),每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)設(shè)置20 m×20 m樣方,5點(diǎn)取樣法取樣,去除表層土(5 cm左右),鉆取冬蓀菌絲覆土層土壤(5 cm土層)并混合,將土樣過(guò)2 mm篩網(wǎng)去雜質(zhì),分別保存于4和-80 ℃冰箱中,用于土壤理化性質(zhì)和土壤DNA測(cè)定分析。

1.3.2 土壤基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定 土壤全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、pH分別按NY/T 53—1987、GB/T 9837—1988、NY/T 87—1988、NY/T 1121.7—2014、NY/T 1849—2010、NY/T1121.6—2006、NY/T 1241—1999中的相應(yīng)方法進(jìn)行測(cè)定;土壤堿解氮按《土壤學(xué)實(shí)驗(yàn)》中的堿解擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.3.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增 根據(jù)FastDNA?Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒(MP Biomedicals,美國(guó))說(shuō)明書逐步進(jìn)行土樣微生物群落總DNA抽提,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量,使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和純度。以提取的總DNA為模板,用細(xì)菌通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT) 對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用真菌通用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)對(duì)ITS1基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min,35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后10 ℃進(jìn)行保存(PCR儀:ABIGeneAmp?9700型)。338F-806R引物PCR反應(yīng)體系為:5×FastPfu Buffer緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,FastPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。ITS1F-ITS2R引物PCR反應(yīng)體系為:10×Buffer緩沖液2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,rTaq聚合酶0.2 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

1.3.4 Illumina Miseq測(cè)序 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,美國(guó))純化回收產(chǎn)物,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用QuantusTMFluorometer(Promega,美國(guó))對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific,美國(guó))建庫(kù):①接頭鏈接;②使用磁珠篩選去除接頭自連片段;③利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集;④磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫(kù),將DNA樣品委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS Version 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Uparse 7.0.1090進(jìn)行OTU分析和Pan分析,聚類方式采用USEARCH7-uparse算法,OTU序列相似度為0.97,物種分類數(shù)據(jù)庫(kù)為unite 8.0/its_fungi,分類置信度為0.7。使用mothur v.1.30.2計(jì)算Shannon指數(shù),并對(duì)組間Shannon指數(shù)差異進(jìn)行t檢驗(yàn)。使用R語(yǔ)言3.3.1制作物種Venn圖、群落柱形圖、相關(guān)性Heatmap圖,使OriginPro 2021軟件繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境的理化性質(zhì)

從圖1看出,全氮、堿解氮含量耕地壤土和沙質(zhì)土呈先升后降趨勢(shì),林地壤土則呈先升后降再升的趨勢(shì),3種土壤環(huán)境中的全氮、堿解氮含量最高值均處于菌絲生長(zhǎng)期(M)和菌蕾生長(zhǎng)期(B),并以林地壤土含量最高;不同土壤環(huán)境的全鉀含量在整個(gè)生長(zhǎng)周期變化不明顯,速效鉀與全鉀含量變化趨勢(shì)無(wú)一致性,耕地壤土、林地壤土均呈先升后降趨勢(shì),耕地沙質(zhì)土則呈先升后降再升趨勢(shì),整個(gè)過(guò)程中林地壤土全鉀及速效鉀含量最低;不同土壤環(huán)境全磷含量均呈先升后降趨勢(shì),整個(gè)栽培周期內(nèi)耕地沙質(zhì)土全磷和有效磷最高,林地壤土最低;土壤有機(jī)質(zhì)含量耕地壤土和沙質(zhì)土均呈先升后降趨勢(shì),林地壤土則呈先升后降再升趨勢(shì),林地壤土和耕地壤土變化明顯,以菌絲生長(zhǎng)期(M)和菌蕾生長(zhǎng)期(B)最高;土壤pH耕地壤土呈下降趨勢(shì),耕地沙質(zhì)土呈先降后升再微降趨勢(shì),林地壤土呈先降后升再降趨勢(shì),其中,林地壤土pH偏酸性,耕地壤土中性偏酸,耕地沙質(zhì)土中性偏堿性。表明,在冬蓀菌絲生長(zhǎng)期和菌蕾生長(zhǎng)期,土壤中全氮、全磷、堿解氮,速效鉀、有效磷、有機(jī)質(zhì)均明顯增加并達(dá)最大值,全鉀則降低,pH在整個(gè)栽培周期均呈下降趨勢(shì)。

圖1 不同土壤環(huán)境及冬蓀菌絲生長(zhǎng)期內(nèi)土壤的理化性質(zhì)Fig.1 Soil physiochemical properties under different soil environment and during mycelial growth state of P.dongsun

2.2 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境中細(xì)菌和真菌物種的多樣性

對(duì)土樣中細(xì)菌和真菌進(jìn)行DNA抽取,高通量分析后獲得9367個(gè)細(xì)菌物種OTU,屬于43個(gè)門1024個(gè)屬,總序列數(shù)831 316條,各樣本序列數(shù)范圍為55 229～78 458條,序列平均長(zhǎng)度為415 bp;獲得5851個(gè)真菌物種OTU,屬于16個(gè)門891個(gè)屬,總序列數(shù)2012 901條,各樣本序列數(shù)范圍為53 244～124 196條,序列平均長(zhǎng)度為231 bp。由圖2可知,耕地壤土、耕地沙質(zhì)土的土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著高于林地壤土(P<0.05),耕地壤土與耕地沙質(zhì)土之間土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)差異不顯著,表明冬蓀栽培地內(nèi)耕地壤土和耕地沙質(zhì)土細(xì)菌多樣性高于林地壤土;3種土壤間的土壤真菌Shannon指數(shù)差異不顯著,表明不同土壤環(huán)境土壤真菌多樣性在栽培期內(nèi)無(wú)明顯差異。綜合比較,同一土壤環(huán)境中細(xì)菌多樣性高于真菌多樣性。

圖2 屬分類水平下不同土壤環(huán)境細(xì)菌和真菌的Shannon指數(shù)Fig.2 Shannon index of soil bacterial community and fungal community under different soil environments at genus level

2.3 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境中細(xì)菌和真菌物種的組成

2.3.1 門水平下物種的相對(duì)豐度 由圖3可知,在細(xì)菌門水平下,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和綠彎菌門(Chloroflexi)為冬蓀栽培地覆土層的優(yōu)勢(shì)門類,其相對(duì)豐度總和在林地壤土、耕地壤土、耕地沙質(zhì)土中分別達(dá)83.80%、84.44%、80.13%。在真菌門水平下,子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)為冬蓀栽培地覆土層土壤優(yōu)勢(shì)門類,其相對(duì)豐度總和在林地壤土、耕地壤土、耕地沙質(zhì)土中分別達(dá)85.49%、91.79%和94.96%。

圖3 門水平下不同土壤環(huán)境中細(xì)菌和真菌物種群落的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial phyla and fungal phyla under different soil environment at phylum level

2.3.2 屬水平下物種的相對(duì)豐度 從圖4看出,細(xì)菌屬水平下相對(duì)豐度>1%的共有40個(gè)屬,林地壤土樣地中熱酸菌屬(Acidothermus)和norank_f_norank_o_Subgroup_2相對(duì)豐度較高,分別占該組物種總數(shù)7.60%和7.32%;耕地壤土和耕地沙質(zhì)土樣地中,norank_f_norank_o_Vicinamibacterales和norank_f_Vicinamibacteraceae屬豐度占比較高,分別占該組物種總數(shù)5.22%、3.87%和3.37%、3.62%。表明,冬蓀栽培地覆土層林地土壤和耕作土壤(包括壤土和沙質(zhì)土)細(xì)菌高豐度物種存在明顯差異。真菌屬水平下相對(duì)豐度>1%的共有38個(gè)屬,其中林地壤土樣地相對(duì)豐度居前5的分別為被孢霉屬(Mortierella)、unclassified_c_Archaeorhizomycetes、沙蜥屬(Saitozyma)、unclassified_k_Fungi和Archaeorhizomyces,分別占該組物種總數(shù)的10.42%、25.41%、11.36%、9.37%和9.97%;在耕地壤土分組中相對(duì)豐度居前3的物種分別是被孢霉屬(Mortierella)、沙蜥屬(Saitozyma)和鬼筆屬(Phallus),分別占該組物種總數(shù)14.24%、7.18%和7.37%;在耕地沙質(zhì)土分組相對(duì)豐度居前3的物種分別是被孢霉屬(Mortierella)、籃狀菌屬(Talaromyces)和鬼筆屬(Phallus),分別占該組物種總數(shù)13.61%、5.23%和5.58%。

圖4 屬水平下不同土壤環(huán)境中細(xì)菌和真菌物種的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial and fungal species under different soil environment at genus level

2.3.3 真菌和細(xì)菌的非度量多維尺度(NMDS)分析 從圖5可知,各個(gè)土壤環(huán)境中真菌和細(xì)菌樣本基本匯聚在一起,表明不同土壤環(huán)境之間物種組成差異較大,而同一樣地不同時(shí)期采集土樣也未集中,彼此之間距離較大,表明不同時(shí)期內(nèi)樣本細(xì)菌物種差異較大。細(xì)菌分組樣品之間彼此無(wú)交集,表明彼此之間無(wú)相似物種,NMDS分析的脅強(qiáng)系數(shù)stress<0.05,說(shuō)明NMDS分析對(duì)細(xì)菌分組土樣具有很好代表性。真菌分組樣品之間同一樣地不同時(shí)期采集土樣僅林地壤土樣地相對(duì)集中,耕地壤土和耕地沙質(zhì)土組內(nèi)物種差異較大,且耕地壤土與耕地沙質(zhì)土部分交叉,表明兩組間樣地真菌物種存在相似性;NMDS分析的脅強(qiáng)系數(shù)stress<0.1,說(shuō)明NMDS分析對(duì)真菌分組土樣具有較好代表性。

圖5 不同土壤環(huán)境中細(xì)菌和真菌屬分類水平的非度量多維尺度分析Fig.5 NMDS analysis of bacterial genus and fungal genus under different soil environment

2.3.4 主要真菌和細(xì)菌物種的差異性 細(xì)菌。對(duì)林地壤土、耕地壤土、耕地沙質(zhì)土土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬進(jìn)行組間差異分析,前10個(gè)屬的物種豐度在不同分組處理之間呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異(Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn))(圖6-a)。在前10個(gè)屬中,除熱酸菌屬(Acidothermus)和慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)外,其他種類暫無(wú)明確分類地位,因此考察這2個(gè)屬在3個(gè)分組之間的差異性。從圖6-b看出,林地壤土中熱酸菌屬(Acidothermus)豐度明顯高于耕地壤土和耕地沙質(zhì)土(P<0.01),耕地壤土與耕地沙質(zhì)土之間差異不明顯;從圖6-c看出,林地壤土中慢生根瘤菌屬(Bradyhizobium)豐度明顯高于耕地沙質(zhì)土(P<0.01)和耕地壤土(P<0.05),耕地壤土與耕地沙質(zhì)土之間物種差異極顯著(P<0.01)。

*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01),下同。* and * * indicate significant difference and extremely significant difference at P< 0.05 and P< 0.01 level, respectively.The same as below.圖6 不同土壤環(huán)境中細(xì)菌屬主要物種的差異顯著性Fig.6 Significant difference of main species of soil bacterial under different soil environment

真菌。從圖7-a看出,林地壤土、耕地壤土、耕地沙質(zhì)土真菌優(yōu)勢(shì)屬前10個(gè)屬物種豐度在不同分組處理之間有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。前10個(gè)屬物種中,除沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、鐮刀菌屬(Fusarium)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、Gibellulopsis、和赤霉菌屬(Gibberella)外,其他種類暫無(wú)明確分類地位,研究主要考察冬蓀栽培與覆土層微生物多樣性之間的關(guān)系,因此主要分析沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、鐮刀菌屬(Fusarium)及鬼筆屬(Phallus)在3個(gè)分組之間的物種豐度差異。從圖7-b看出,林地壤土與耕地沙質(zhì)土間沙蜥屬(Saitozyma)豐度差異顯著(P<0.05),耕地壤土與耕地沙質(zhì)土之間差異不顯著;從圖7-c看出,林地壤土中Archaeorhizomyces豐度明顯高于耕地壤土、耕地沙質(zhì)土(P<0.01),耕地壤土與耕地沙質(zhì)土之間差異不明顯;從圖7-d看出,耕地沙質(zhì)土中鐮刀菌屬(Fusarium)豐度顯著高于林地壤土,耕地壤土(P<0.05)、林地壤土與耕地壤土差異不明顯,耕地壤土與耕地沙質(zhì)土之間鐮刀菌屬(Fusarium)豐度差異顯著,從圖7-e看出,3個(gè)土壤環(huán)境覆土層鬼筆屬(Phallus)豐度差異不明顯。

圖7 不同組處理土壤真菌屬主要物種差異顯著性Fig.7 Significant difference of main species of soil fungal under different treatments

2.4 不同生長(zhǎng)期內(nèi)微生物物種的多樣性變化

2.4.1 土壤微生物物種Shannon指數(shù) 由圖8可知,冬蓀栽培地中,不同土壤環(huán)境中細(xì)菌Shannon指數(shù)高于真菌Shannon指數(shù),表明土壤中細(xì)菌多樣性高于真菌多樣性。從不同生長(zhǎng)期看,不同土壤環(huán)境中真菌Shannon指數(shù)均呈先降后升的趨勢(shì),但各自變化趨勢(shì)有差異;細(xì)菌Shannon指數(shù)耕地壤土和耕地沙質(zhì)土呈先升后降趨勢(shì),林地壤土呈先降后升的趨勢(shì)。表明,冬蓀菌絲不同生長(zhǎng)期內(nèi)林地壤土微生物多樣性變化明顯,微生物多樣性低于耕地壤土和耕地沙質(zhì)土。

圖8 不同冬蓀生長(zhǎng)期土壤細(xì)菌和真菌物種Shannon指數(shù)Fig.8 The Shannon index of soil bacterial species and fungal species in different growth periods of P.dongsun

2.4.2 土壤微生物共有物種的豐度差異 從圖9看出,冬蓀栽培不同生長(zhǎng)期內(nèi)土壤環(huán)境中細(xì)菌和真菌共有物種前10屬豐度有明顯差異。林地壤土細(xì)菌菌絲生長(zhǎng)期(M)熱酸菌屬(Acidothermus)物種豐度最高,占組內(nèi)10.07%;耕地壤土細(xì)菌norank_f_norank_o_Vicinamibacterales物種豐度占比相對(duì)較高,以栽培前期(E)物種豐度最高;耕地沙質(zhì)土細(xì)菌子實(shí)體衰敗期(D)norank_f_norank_o_Vicinamibacterales物種豐度最高,占組內(nèi)的9.3%。林地壤土真菌菌蕾生長(zhǎng)期(B)以u(píng)nclassified_c_Archaeorhizomycetes物種豐度最高,占組內(nèi)的48.05%,其次是菌絲生長(zhǎng)期(M),物種豐度達(dá)25.4%;鬼筆屬(Phallus)隨著栽培時(shí)間的增加,物種濃度逐漸增加,子實(shí)體采收期(F)物種豐度占組內(nèi)2.78%;耕地壤土真菌子實(shí)體生長(zhǎng)期(F)鬼筆屬(Phallus)物種豐度最高,占組內(nèi)的28.54%,其次是子實(shí)體衰敗期(D),物種豐度達(dá)18.4%,從整個(gè)生長(zhǎng)周期看,鬼筆屬(Phallus)物種豐度呈先升后降趨勢(shì);耕地沙質(zhì)土真菌子實(shí)體生長(zhǎng)期(F)籃狀菌屬(Talaromyces)物種豐度最大,達(dá)30.85%,被孢霉屬(Mortierella)物種豐度在整個(gè)生長(zhǎng)周期中占比相對(duì)較高,分別為24.82%(E)、17.14%(M)、9.85%(B)、2.36%(F)、13.76%(D);從整個(gè)生長(zhǎng)周期看,鬼筆屬(Phallus)物種豐度呈先升后降趨勢(shì),菌蕾生長(zhǎng)期(B)物種豐度最大,占11.18%。

圖9 不同冬蓀生長(zhǎng)期土壤微生物共有物種屬水平下的特種豐度Fig.9 The abundance of soil microbes from shared species of P.dongsun at genus level

2.5 冬蓀栽培不同土壤環(huán)境微生物群落和物種與土壤營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性

2.5.1 土壤微生物群落與土壤營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性 考察土壤理化性質(zhì)與土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系,為確定共線性較小的環(huán)境因子,分別對(duì)細(xì)菌物種和真菌物種進(jìn)行VIF方差膨脹因子分析,基于篩選出的主要土壤營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行RDA/CCA分析。RDA分析(圖10-a)表明,pH、TP、TK與耕地沙質(zhì)土細(xì)菌群落組成呈正相關(guān),AK、TK與耕地壤土細(xì)菌群落組成呈正相關(guān),OM與林地壤土細(xì)菌群落多樣性呈正相關(guān);TP、TK、AK、AP、pH間呈正相關(guān),與OM之間呈負(fù)相關(guān),pH對(duì)耕地沙質(zhì)土細(xì)菌群落組成影響最大。CCA分析結(jié)果(圖10-b)表明,TK與耕地壤土真菌群落組成呈正相關(guān),AP、TP、AK與耕地沙質(zhì)土真菌群落組成呈正相關(guān),OM與林地壤土真菌群落組成呈正相關(guān);AP、TP、AK、TK間呈正相關(guān),與OM之間呈負(fù)相關(guān),TK對(duì)耕地壤土真菌群落組成影響最大;環(huán)境因子對(duì)土壤中鬼筆屬物種豐度的影響以土壤全鉀最大,且呈正相關(guān)。

2.5.2 土壤微生物物種與土壤營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性 由圖11-a可知,不同土壤環(huán)境中的理化性質(zhì)指標(biāo)均與相對(duì)基因豐度排名前10的細(xì)菌屬有相關(guān)性,其中有機(jī)質(zhì)與黃桿菌科(Xanthobacteraceae)中無(wú)分類屬呈正相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為57.86%;與芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae中無(wú)分類的屬呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);pH、TP、AP與慢生根瘤菌屬(Rhizobium)、黃桿菌科(Xanthobacteraceae)、熱酸菌屬(Acidothermus)及IMCC2625目、AD3綱、Subgroup_2目、Elsterales目中無(wú)分類的屬呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)65.36～98.21%;pH、TP、AP、TK、AK與Vicinamibacteraceae中無(wú)分類屬呈正相關(guān)(P<0.05)。從圖11-b可知,OM與子囊菌門中不能注釋屬呈正相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)54.64%;TP、AP與沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces及古根菌綱、真菌界中不能注釋屬呈正相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)69.90%～91.10%;5個(gè)土壤理化因子與鬼筆屬物種豐度有一定正相關(guān)向,但不顯著,表明理化因子對(duì)鬼筆屬(Phallus)影響不明顯。

圖11 不同土壤環(huán)境微生物物種與土壤營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性HeatmapFig.11 Heatmap of the correlation between soil microbes and soil nutrients under different soil environment

3 討 論

土壤微生物多樣性與一系列生態(tài)系統(tǒng)功能(如養(yǎng)分循環(huán)、分解和植物生產(chǎn)力)變化呈正相關(guān),是土壤微生物種群、土壤動(dòng)植物以及周圍土壤環(huán)境生態(tài)相互作用的結(jié)果[5],土壤中微生物多樣性的變化影響土壤環(huán)境中其他微生物群落結(jié)構(gòu)、自身理化性質(zhì)及相關(guān)酶活性變化[4]。本研究中,在冬蓀菌絲生長(zhǎng)期和菌蕾生長(zhǎng)期,土壤中堿解氮、速效磷、有機(jī)質(zhì)含量明顯增加,速效養(yǎng)分含量提升,肥力提高,與白瑩等[15-16]研究結(jié)果一致;全氮、全磷、有效磷亦明顯增加,pH在整個(gè)栽培周期均呈下降趨勢(shì),這與蘇德偉等[10]的研究一致,但本研究發(fā)現(xiàn),不同土壤環(huán)境pH不同,林地壤土偏酸性,耕地壤土中性偏酸,耕地沙質(zhì)土中性偏堿性,其差異應(yīng)該來(lái)源土壤環(huán)境的不同。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),有機(jī)質(zhì)與林地壤土微生物呈正相關(guān),但與鬼筆屬物種變化呈負(fù)相關(guān),全磷、全鉀、速效鉀則與鬼筆屬(Phallus)物種豐度呈正相關(guān),但不顯著,表明全磷、全鉀、速效鉀對(duì)鬼筆屬(Phallus)(冬蓀)菌絲的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。

外源微生物對(duì)土壤本底微生物多樣性有明顯影響,可改變其群落結(jié)構(gòu)及其生長(zhǎng)軌跡,且與外源微生物的種類和數(shù)量呈正相關(guān)[17]。在冬蓀栽培樣地內(nèi),耕地(壤土和沙質(zhì)土)細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著高于林地壤土,真菌Shannon指數(shù)差異不顯著,但從趨勢(shì)上看,林地壤土真菌Shannon指數(shù)依然最低,表明冬蓀栽培林地壤土微生物多樣性低于耕地。從冬蓀栽培周期看,在菌絲生長(zhǎng)期至子實(shí)體生長(zhǎng)期,耕地土壤(壤土和沙質(zhì)土)中細(xì)菌Shannon指數(shù)明顯增加,真菌Shannon指數(shù)明顯降低,與前人研究結(jié)果相似。如添加枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、伯克氏菌、氧化節(jié)桿菌、耳葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌等處理后,土壤細(xì)菌多樣性明顯提高[10, 15, 18-20],而真菌多樣性降低[21]。詹穎馨等[11]則發(fā)現(xiàn),細(xì)菌物種數(shù)量隨著長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)不斷下降,推測(cè)為栽培或添加物種種類不同,導(dǎo)致土壤微生物多樣性變化。本研究發(fā)現(xiàn),林地壤土中細(xì)菌和真菌多樣性呈先降后升的趨勢(shì),與耕地土壤環(huán)境變化趨勢(shì)不一致,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

對(duì)不同土壤環(huán)境冬蓀覆土層微生物主要細(xì)菌物種進(jìn)行分析,林地壤土細(xì)菌主要物種為熱酸菌屬(Acidothermus),耕地壤土為Vicinamibacterales目,耕地沙質(zhì)土為Vicinamibacteraceae科,屬水平下真菌主要有沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces、鐮刀菌屬(Fusarium)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、Gibellulopsis和赤霉菌屬(Gibberella)。針對(duì)具有明確分類地位細(xì)菌和真菌物種豐度進(jìn)行差異性分析,林地壤土覆土層中熱酸菌屬(Acidothermus)、沙蜥屬(Saitozyma)、Archaeorhizomyces豐度高,差異顯著,耕地沙質(zhì)土中鐮刀菌屬豐度高,差異顯著,3種土壤環(huán)境覆土層鬼筆屬豐度差異不明顯。熱酸菌屬(Acidothermus)、Archaeorhizomyces以及慢生根瘤菌(Bradyhizobium)均與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)。熱酸菌屬(Acidothermus)是分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源的細(xì)菌,占細(xì)菌總量的20%左右[22],Archaeorhizomyces是常見(jiàn)陸生好氣真菌[23],在土壤真菌群落中占比約30%[24],其隨水分和孔隙度變化常表現(xiàn)出較高的敏感度[25],慢生根瘤菌(Bradyhizobium)則具有固氮作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn),耕地沙質(zhì)土中鐮刀菌屬(Fusarium)物種豐度顯著增加,而鐮刀菌被認(rèn)為是一類重要植物病原菌類群,具有隨著栽植代數(shù)增加而顯著增加的趨勢(shì)[27-28],本研究結(jié)果與之一致。

4 結(jié) 論

冬蓀覆土層內(nèi)變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門,子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)為優(yōu)勢(shì)真菌門,且栽培期內(nèi)細(xì)菌多樣性增加,真菌多樣性減少。在林地壤土、耕地壤土和耕地沙質(zhì)土3種不同環(huán)境中,林地壤土細(xì)菌多樣性低于耕地壤土和耕地沙質(zhì)土,真菌多樣性不顯著;屬水平下,熱酸菌屬、Archaeorhizomyces、慢生根瘤菌是林地壤土優(yōu)勢(shì)屬,鐮刀菌屬是耕地壤土連作優(yōu)勢(shì)屬,均與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)。相關(guān)分析表明,全磷、全鉀、速效鉀與鬼筆屬(冬蓀)物種豐度呈正相關(guān),但不顯著,全磷、全鉀、速效鉀對(duì)鬼筆屬(冬蓀)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。