卿冬進(jìn),鄧國(guó)富,戴高興,潘英華,陸春菊,李經(jīng)成,周維永,陳韋韋,梁海福,陳榮林

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007;2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院,南寧 530007)

【研究意義】水稻是重要的糧食作物之一,哺育世界約50%的人口[1]。低溫脅迫可導(dǎo)致冷敏感水稻在苗期受到嚴(yán)重傷害,生長(zhǎng)速率減緩,后期則導(dǎo)致花粉不育[2-3]。廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所雜交水稻遺傳育種課題組基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白組學(xué)方法在耐冷水稻品種空育131中篩選到1個(gè)冷脅迫過(guò)程中正調(diào)控蛋白OsCML16(蛋白編號(hào)Q5ZCK5)[4],該蛋白是細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳遞相關(guān)的調(diào)控蛋白家族Calmodulin-like(CML)成員之一,但外源表達(dá)OsCML16蛋白及其生物學(xué)功能研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,利用大腸桿菌表達(dá)水稻冷脅迫響應(yīng)蛋白OsCML16,并純化該蛋白用于后續(xù)的OsCML16蛋白抗體制備,可為研究OsCML16蛋白的耐冷分子功能打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,越來(lái)越多的分子生物學(xué)研究闡述了水稻基因及蛋白在低溫脅迫下的響應(yīng)。細(xì)胞膜上溫度感應(yīng)器COLD1/RGA1復(fù)合體先接收到低溫信號(hào),然后激發(fā)鈣離子進(jìn)入細(xì)胞、產(chǎn)生活性氧、積累脫落酸和OsMKK6-OsMPK3級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致下游位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)[5-7]。Luo等[8]研究發(fā)現(xiàn),COLD1下游的維生素E—維生素K1亞網(wǎng)絡(luò)是低溫耐受性提高的核心調(diào)控位點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)一些水稻冷耐受相關(guān)調(diào)控基因,如CTB4a基因與ATP合酶AptB的一個(gè)β亞基相互作用調(diào)控水稻細(xì)胞ATP供應(yīng),增強(qiáng)水稻冷耐受性[9];粳稻栽培品種的bZIP73Jap蛋白與bZIP71蛋白相互作用調(diào)節(jié)脫落酸水平和活性氧水平能增強(qiáng)水稻對(duì)冷氣候的耐受性[10];水稻OsMADS57蛋白與OsTB1蛋白相互作用,并通過(guò)直接調(diào)控OsWRKY94激活其轉(zhuǎn)錄而啟動(dòng)低溫防御反應(yīng)[11]。Zhao等[12]利用數(shù)量性狀(QTL)定位與全基因組表達(dá)分析法在雜交水稻苗期的不同冷環(huán)境條件下鑒定出冷耐受相關(guān)基因qCTS-9。Sun等[13]利用QTL定位與混合分組分析法(BSA)在耐冷粳稻品種空育131中鑒定出1個(gè)與抗冷相關(guān)的功能基因qPSST6。CML(Calmodulin-like) 蛋白能在植物受到刺激后調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳遞,具有重要信號(hào)傳感器的作用[14]。蛋白組學(xué)技術(shù)已在水稻低溫脅迫過(guò)程挖掘其調(diào)控蛋白的研究方面得到廣泛應(yīng)用,如早期的蛋白組學(xué)采用雙向凝膠電泳(2-DE)方法分離水稻冷脅迫響應(yīng)蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜分析[15-17];用iTRAQ標(biāo)記與質(zhì)譜相結(jié)合的定量蛋白組學(xué)方法分析冷脅迫處理水稻材料,發(fā)現(xiàn)調(diào)控蛋白與光合、代謝、ATP合成、活性氧、DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄、脅迫響應(yīng)等相關(guān)[18-20]。大腸桿菌表達(dá)水稻蛋白并進(jìn)一步純化蛋白可為后續(xù)的水稻蛋白功能研究提供參考,杜巧麗等[21]克隆水稻低溫誘導(dǎo)基因OsHDAC15并在大腸桿菌中成功表達(dá),可用于基因參與蛋白修飾及其在組蛋白去乙?；饔梅矫娴难芯??！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今,尚無(wú)外源表達(dá)OsCML16蛋白及其生物學(xué)功能研究的相關(guān)報(bào)道,因此亟待開(kāi)展對(duì)該蛋白在水稻耐冷上的生物學(xué)功能研究并進(jìn)一步純化和質(zhì)譜驗(yàn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以基因重組方法構(gòu)建原核表達(dá)載體,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)OsCML16蛋白在外源表達(dá),并進(jìn)一步采用親和層析方法得到目的蛋白,為后續(xù)制備OsCML16蛋白抗體用于研究該蛋白在水稻耐冷上的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年3—8月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。耐冷粳稻品種空育131由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所保存提供。選取飽滿(mǎn)種子在清水中浸泡24 h,用毛巾保濕24 h于37 ℃下催芽,發(fā)芽良好的種子播種到土壤中,在25 ℃人工氣候箱中16 h光照和8 h黑暗交替培養(yǎng)至三葉期,液氮收集地上部分組織用于RNA提取。大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)及原核表達(dá)載體pET30a由香港科技大學(xué)生命科學(xué)院李凝教授實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑:PCR mix和DL 2000 DNA Marker均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,植物總RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京翼飛雪生物科技有限公司,限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、BamH I、T4-DNA連接和Q5高保真DNA聚合酶均購(gòu)自美國(guó)NEB公司,快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司,Ni-NTA樹(shù)脂購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 OsCML16蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用生物信息學(xué)分析和蛋白跨膜區(qū)分析軟件(TMHMM 2.0)對(duì)OsCML16蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè),確保原核表達(dá)的區(qū)域不包含跨膜區(qū)蛋白序列。

1.2.2CML16基因克隆 水稻總RNA提取與cDNA合成:將收集的空育131水稻組織在液氮中研磨成粉末,用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA,再以cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原核表達(dá)載體pET30a-OsCML16構(gòu)建:根據(jù)前期蛋白組學(xué)鑒定到的冷脅迫正調(diào)控蛋白OsCML16序列,在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中獲得對(duì)應(yīng)的cDNA序列,以空育131的cDNA為模板,根據(jù)pET30a載體多克隆位點(diǎn)選用BamH I和XhoI為酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)雙引物擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的OsCML16基因(OsCML16-F:5′-CGGGATCCATGTCGAACACCACCGAG-3′,OsCML16-R:5′-CCGCTC GAGCTCCGTCTTGGCCTTGT-3′)。PCR反應(yīng)體系50.0 μL:5× Q5 Reaction Buffer 10.0 μL,10 mmol dNTP Mix 1.0 μL,10 mmol/L正、反向引物(R)各1.0 μL,cDNA模板3.0 μL,Q5高保真DNA聚合酶(2 U/μL) 0.5 μL,ddH2O 33.5 μL。擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。對(duì)回收純化的目標(biāo)片段和pET30a原核表達(dá)載體分別用BamH I和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶在37 ℃水浴進(jìn)行雙酶切3 h。酶切產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,并切膠回收目的條帶。將酶切回收的目的基因片段與載體按照5∶1的物質(zhì)量比混合,加入T4-DNA連接酶和連接緩沖液,在16 ℃水浴中連接過(guò)夜。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并全部涂布于含有50.0 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,從含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上挑選單菌落,37 ℃搖菌培養(yǎng)過(guò)夜。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒,分別進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定,并取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.2.3 OsCML16蛋白可溶性表達(dá)及純化 將50 ng序列正確的重組質(zhì)粒pET30a-OsCML16置于42 ℃水浴熱激45 s后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,然后涂布到含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基上,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),挑選2～4個(gè)單克隆菌落到3 mL加抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃下200 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。取2 mL菌液按照1∶100倒入200 mL加抗生素的LB液體培養(yǎng)基,稀釋培養(yǎng)至吸光值OD600為0.6～0.8,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。4 ℃下7000 r/min離心15 min,收集菌體沉淀放置在冰上,加入40 mL裂解液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)懸浮沉淀,用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞,4 ℃下9000 r/min離心15 min,收集上清可溶性蛋白液。取10 μL上清可溶性蛋白液用10% SDS-PAGE膠分離檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況,剩余上清可溶性蛋白液用于進(jìn)一步蛋白純化。

取1 mL的Ni-NTA樹(shù)脂加入15 mL空柱中,加入5 mL裂解液到層析柱中平衡樹(shù)脂,將蛋白裂解液加入層析柱中,收集川流液。用5 mL清洗緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑,pH 8.0) 去除非特異結(jié)合樹(shù)脂蛋白,最后用洗脫液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L 咪唑,pH 8.0) 洗脫目標(biāo)蛋白,并用SDS-PAGE膠洗脫結(jié)果。

1.2.4 純化OsCML16蛋白質(zhì)譜鑒定 采用切膠方法將SDS-PAGE膠中的目標(biāo)蛋白收集到1.5 mL管中,參考Li等[22]的膠內(nèi)胰酶消化方法收集蛋白多肽,然后將蛋白多肽溶入0.1%甲酸,并用蛋白質(zhì)譜儀器(Triple TOF5600,SCIEX) 進(jìn)行蛋白定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsCML16蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

為確認(rèn)包含181個(gè)氨基酸的水稻OsCML16蛋白能否在大腸桿菌中表達(dá),首先采用蛋白跨膜區(qū)分析軟件(TMHMM 2.0)對(duì)OsCML16蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。預(yù)測(cè)結(jié)果表明,OsCML16蛋白內(nèi)沒(méi)有包含跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖1)。因此,OsCML16蛋白全長(zhǎng)序列可用于設(shè)計(jì)原核表達(dá)并有可能獲得相應(yīng)的蛋白。

圖1 OsCML16蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of transmembrane region of OsCML16 protein

2.2 pET30a-OsCML16原核表達(dá)載體設(shè)計(jì)

根據(jù)對(duì)OsCML16蛋白跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果,將OsCML16蛋白全長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的基因序列用于構(gòu)建pET30a-OsCML16原核表達(dá)載體。首先,對(duì)OsCML16基因CDS序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,與表達(dá)載體pET30a的多克隆位點(diǎn)比較,發(fā)現(xiàn)OsCML16基因不包含BamH I和XhoI酶切位點(diǎn),因此這2個(gè)酶切位點(diǎn)可用于pET30a-OsCML16原核表達(dá)載體構(gòu)建。BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)的外端均可表達(dá)6× His標(biāo)簽蛋白,便于后續(xù)蛋白純化。設(shè)計(jì)的原核表達(dá)載體命名為pET30a-OsMCL16,共包含5931個(gè)堿基(圖2)。

圖2 pET30a-OsCML16重組質(zhì)粒Fig.2 Recombinant plasmid pET30a-OsCML16

2.3 pET30a-OsCML16原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

首先在耐冷水稻品種空育131中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,用于克隆OsMCL16基因。提取到的水稻總RNA經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量,其RNA凝膠電泳圖上可見(jiàn)28S 和18S RNA條帶清晰(圖3-A),表明提取到的RNA質(zhì)量較好,無(wú)明顯降解,可用于反轉(zhuǎn)錄cDNA。因此,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄并獲得對(duì)應(yīng)的cDNA 樣品用于OsCML16基因擴(kuò)增。以cDNA 為模板,OsCML16-F為正向引物,OsCML16-R為反向引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增OsMCL16基因CDS。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖3-B所示,擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的基因片段條帶,大小約300 bp。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,用BamH I和XhoI酶對(duì)純化產(chǎn)物和pET30a載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切,然后將酶切產(chǎn)物與酶切的pET30a載體用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選單菌落接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h,提取質(zhì)粒用于PCR擴(kuò)增,以BamH I和XhoI雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。從圖3-C中可看出,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因片段約300 bp,與用于克隆的PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物的基因片段大小一致。最后采用DNA測(cè)序方法驗(yàn)證了插入基因的序列完全正確,可用于目的蛋白表達(dá)。

M:DL2000 DNA Marker; A:RNA質(zhì)量檢測(cè);B:OsCML16基因擴(kuò)增,其中,1為PCR產(chǎn)物;C:重組質(zhì)粒PCR和酶切檢測(cè),其中,2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,3為pET30a載體陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,4為重組質(zhì)粒的BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物,5為pET30a載體的BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物。M:DL2000 DNA Marker;A: RNA quality test; B: Amplification of the OsCML16 gene, 1 represented PCR product; C: PCR and enzyme digestion validation of the recombinant plasmid, 2 represented PCR product, 3 represented PCR product from the negative control of pET30a vector, 4 represented BamH I and Xho I digestion product of the recombinant plasmid, 5 represented BamH I and Xho I digestion product of the negative control of pET30a vector.圖3 OsCML16基因擴(kuò)增、重組質(zhì)粒PCR和酶切檢測(cè)Fig.3 Amplification products of OsCML16,PCR and enzyme digestion validation of the recombinant plasmid

2.4 OsCML16蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

以測(cè)序正確的原核表達(dá)載體pET30a-OsCML16轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,在攜帶卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選取陽(yáng)性克隆單菌落,接種到3 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,放入37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。吸取2 mL菌液接種到200 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),放入37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)至吸光值OD600為0.6～0.8。加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,然后放入28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),誘導(dǎo)4 h后將菌液分裝到50 mL離心管中,4 ℃離心收集菌體,加入40 mL裂解液,用槍頭吸打重懸菌體,在冰浴中用超聲波破碎細(xì)胞5 s,間隔5 s,共破碎30 min;在4 ℃條件下,9000 r/min離心15 min,收集上清可溶性蛋白液和沉淀。取10 μL上清可溶性蛋白液并加入10 μL 2×蛋白上樣緩沖液,在100 ℃ 水中煮5 min,用于10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

上清蛋白與Ni-NTA樹(shù)脂結(jié)合,用包含250 mmol/L洗脫緩沖液洗脫His6-OsCML16-His6融合蛋白,安裝1.5 mL收集管,按照每管1 mL的量共收集7管洗脫His6-OsCML16-His6融合蛋白。然后取10 μL穿流液和10 μL各管洗脫液用于10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。從圖4可知,His6-OsCML16-His6融合蛋白可在大腸桿菌中表達(dá),蛋白分子量約為30 kD,且為可溶性蛋白,超聲波破碎后存在上清液中,上清液中的蛋白從Ni-NTA樹(shù)脂洗脫后,獲得了純化的濃縮His6-OsCML16-His6融合蛋白,其中第2～4 mL洗脫液的融合蛋白含量較高。

M:預(yù)染蛋白marker;S:超聲波破碎的蛋白上清液;F:過(guò)柱后流穿液;E1～E7:洗脫液管1～7。M: Prestained protein marker; S: Protein supernatant after sonication; F: Flow through; E1-E7: Elution fraction 1-7.圖4 SDS-PAGE凝膠電泳鑒定His6-OsCML16-His6融合表達(dá)蛋白的純化結(jié)果Fig.4 The purification result validation of His6-OsCML16-His6 fusion expressed protein using SDS-PAGE gel electroporesis

2.5 OsCML16蛋白質(zhì)譜驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證純化獲得的蛋白序列是否正確,將純化后的融合蛋白His6-OsCML16-His6經(jīng)過(guò)SDS-PAGE膠分離,并從膠中切取出來(lái),采用膠內(nèi)胰酶消化方法處理,并獲得蛋白多肽樣品,最后用蛋白質(zhì)譜方法對(duì)多肽樣品進(jìn)行定性分析。通過(guò)蛋白質(zhì)譜儀分析得到的多肽序列與水稻蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,搜索肽段對(duì)應(yīng)的蛋白編號(hào)。蛋白定性分析發(fā)現(xiàn)有肽段與水稻數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白匹配,從圖5可看出,在純化獲得的蛋白中鑒定到3條肽段序列(MPQQQQVERPTALAPADAEIER、ITAAELGKVLGR和AAFDVYDVDGDGR)是屬于水稻OsCML16蛋白,結(jié)果表明外源表達(dá)及純化獲得的蛋白即為OsCML16蛋白。

圖5 質(zhì)譜分析鑒定的多肽二級(jí)圖譜Fig.5 Secondary spectrum of polypeptides identified by mass spectrometry

3 討 論

水稻有32個(gè)CML家族成員,CMLs在細(xì)胞內(nèi)與Ca2+結(jié)合引起自身構(gòu)象變化,結(jié)合下游靶蛋白,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)起調(diào)控作用[23]。CaM、CML和CDPK等鈣感受器蛋白在傳遞低溫引起的Ca2+信號(hào)過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并參與植物對(duì)低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程的調(diào)控[24]。在基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白組學(xué)方法挖掘耐冷粳稻品種空育131在低溫處理過(guò)程的調(diào)控蛋白中,發(fā)現(xiàn)OsCML16蛋白上調(diào)表達(dá)[21],該蛋白的低溫誘導(dǎo)表達(dá)可能參與水稻對(duì)冷脅迫的響應(yīng)。因此,克隆OsCML16基因并獲得純化的外源表達(dá)可溶性O(shè)sCML16蛋白,對(duì)進(jìn)一步制備和純化抗體及探究蛋白的生物學(xué)功能具有重要意義。

本研究根據(jù)pET30a表達(dá)載體和OsCML16基因序列,選擇限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和XhoI對(duì)pET30a載體和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行雙酶切,未產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端,能防止載體和插入片段自連,確保成功獲得序列正確的重組質(zhì)粒,并將構(gòu)建好的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株;OsCML16基因插入pET30a載體后,通過(guò)PCR和雙酶切鑒定,目的片段大小約300 bp,與基因的理論大小543 bp存在差異,但在進(jìn)一步的基因測(cè)序中發(fā)現(xiàn)DNA序列與理論序列完全一致,可能是由于DNA Marker在凝膠電泳分離上存在差異導(dǎo)致大小不一致。目前,在外源表達(dá)蛋白的方法中,原核表達(dá)蛋白是最常用且耗時(shí)最短的一種體外表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌因具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)操作容易、轉(zhuǎn)化效率高和繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)而成為較廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)[25]。本研究中,采用pET30a表達(dá)載體構(gòu)建了攜帶組氨酸標(biāo)簽的OsCML16融合蛋白表達(dá)載體,并成功表達(dá)、純化獲得了目的蛋白;蛋白抗體制備試驗(yàn)通常需要可溶性蛋白,本研究為了獲得可溶性目的蛋白,采用28 ℃條件誘導(dǎo)表達(dá),于誘導(dǎo)4 h后用裂解液溶解菌體,并直接使用超聲波破碎,離心獲得的上清液迅速采用親和層析方法純化其中的融合表達(dá)蛋白,獲得的可溶性蛋白可直接用于后續(xù)的抗體制備及抗體純化研究。

本研究中,純化獲得的融合表達(dá)蛋白His6-OsCML16-His6經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)其蛋白分子量約30 kD,與理論值25.7 kD相近,而且純化后的蛋白大部分是目標(biāo)蛋白,其他雜蛋白含量較少,表明親和層析方法可成功獲得體外表達(dá)的OsCML16蛋白;為進(jìn)一步確定蛋白的序列是否正確,采用蛋白質(zhì)譜儀對(duì)純化蛋白進(jìn)行序列分析,與水稻數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白比較,檢測(cè)到的3條多肽有較高的離子強(qiáng)度,屬于OsCML16蛋白,進(jìn)一步驗(yàn)證了外源表達(dá)的目標(biāo)蛋白與水稻OsCML16蛋白序列一致。因此,本研究在體外表達(dá)并純化的OsCML16蛋白可為后續(xù)進(jìn)行蛋白功能研究打下基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

采用原核表達(dá)方法將水稻冷脅迫響應(yīng)基因OsCML16在大腸桿菌中表達(dá),運(yùn)用親和層析技術(shù)根據(jù)融合蛋白攜帶組氨酸標(biāo)簽純化獲得融合表達(dá)蛋白His6-OsCML16-His6,并以蛋白質(zhì)譜技術(shù)驗(yàn)證該蛋白的序列完全正確,后續(xù)可將水稻OsCML16蛋白用于抗體制備及蛋白功能研究。