曾永明，周靜萱，黃小芮，莫麗嚴，馮沁雄，欒 潔

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，廣西 南寧 530002)

板栗(學名：Castaneamollissima)，別名栗、栗子、風臘，是山毛櫸科栗屬的植物，有7～9種。目前，我國大部分板栗果園還處于粗放經(jīng)營階段，農(nóng)藥的大量施用使環(huán)境受到污染。環(huán)境中的農(nóng)藥通過食物鏈傳遞并富集，進入人體，長期食用農(nóng)殘超標的食品將造成對人體健康的危害。因此，通過板栗中農(nóng)殘污染物的監(jiān)測，對推動綠色種植板栗，保障板栗質(zhì)量安全，具有一定作用。

亞胺硫磷(phosemet)純品為白色無臭晶體，熔點72～72.7 ℃。工業(yè)品為白色或淺褐色晶體，熔點59～63 ℃，具有特殊刺激性臭味。20世紀70-80年代迅速發(fā)展起來的有機磷類殺蟲劑，化學名稱為O，O-二甲基-S-(酞酰亞胺基甲基)二硫代磷酸酯，化學式為C11H12NO4PS2，在世界各國廣泛使用。在食品安全監(jiān)測工作中，能夠準確的測量農(nóng)產(chǎn)品中亞胺硫磷含量，對維護食品安全具有重要意義。因此，目前需要依靠第三方檢測機構(gòu)的測量結(jié)果的準確性來幫助維護食品安全工作，而測量過程中人為操作因素、環(huán)境因素、標準物質(zhì)和儀器設(shè)備等方面都會對結(jié)果的不確定度造成影響[1-2]，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量的測量結(jié)果不準確。為了提高測量結(jié)果的可靠性，找出影響測量結(jié)果的最主要因素，本文參照JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[3]，采用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷的含量，通過評定不確定度的方式對測量過程中可能造成誤差的操作均進行測算，確定了影響測量結(jié)果的最主要因素以改進農(nóng)殘測量的精準性，對保障板栗質(zhì)量安全，具有一定作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1)儀器設(shè)備：MS 3 basis旋渦混合器(IKA儀器有限公司)；離心機TD5A-WS(湘儀離心機儀器有限公司)；M32自動高通量平行濃縮儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；GC-2010Plus氣相色譜儀(日本島津公司)，配備火焰光度檢測器(FPD)，色譜柱：SH-Rtx-1701(30 m×0.25 mm×0.25 μm 毛細色譜柱)。

2)測量儀器：電子天平，最大允許誤差為 ±0.5 mg；瓶口分液器，最大允許誤差為0.03%；10 mL 移液管，精度 0.02 mL；0.1～1 mL 移液槍，誤差范圍為±1%；20～200 μL 移液槍，誤差范圍為±1%；10 mL 容量瓶，精度 0.10 mL；FPD檢測器的定量允差1.9%等。

3)標準物質(zhì)：亞胺硫磷，購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科學監(jiān)測研究所，質(zhì)量濃度為 100 μg/mL，不確定度U=±3%(k=2)。

4)化學試劑：乙腈(色譜純，上海安譜公司)；丙酮(色譜純，上海安譜公司)；氯化鈉(分析純，西隴科學股份有限公司)；二級水(自制)。

5)耗材：13 mm×0.2 μm 有機濾膜(上海安譜公司)。

6)測定樣品：板栗粉，來自國家林業(yè)和草原局科技司組織的能力驗證機構(gòu)。

1.2 方法

1)標準工作溶液的配置：從冰箱取出質(zhì)量濃度為 100 μg/mL 的亞胺硫磷標準溶液，放在室溫為 25 ℃ 的實驗室回溫 4 h 后，用20～200 μL 移液槍移取 100 μL 亞胺硫磷標準溶液于 5 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 2 μg/mL 的工作標準溶液(此工作標準溶液保存在 4 ℃ 冰箱中，有效期一周)。檢測時通過稀釋在室溫為 25 ℃ 的實驗室回溫 4 h 后工作標準溶液得到0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 μg/mL 共5個梯度質(zhì)量濃度點的標準溶液。采用GC-2010Plus氣相色譜儀進行亞胺硫磷含量測定，每一濃度的標準溶液溶液分別進樣3次，得到相應(yīng)的色譜峰面積，用最小二乘法擬合得到標準曲線回歸方程。

2)供試品溶液的制備：本次實驗的樣品為已粉碎的板栗樣品，并由國家林草局組織的能力驗證機構(gòu)加入亞胺硫磷農(nóng)藥。

準確稱取板栗樣品和空白樣品各 2 g(精確到 0.01 g)于 50 mL 離心管中，加入 5 mL 蒸餾水渦旋 1 min 復(fù)原至板栗鮮樣狀態(tài)，靜止 30 min 使板栗充分浸潤，然后加入 20 mL 的乙腈和3～5 g 氯化鈉，用渦旋混合器進行渦旋 2 min，采用TD5A-WS離心機 4000 r/min 離心 5 min。用 10 mL 移液管吸取 10 mL 上層乙腈溶液到 15 mL 離心管中，調(diào)節(jié)M32自動高通量平行濃縮儀水浴溫度不大于 40 ℃，氮氣流量為 40 kPa 吹至近干，加入 1 mL 丙酮，在渦旋混合器渦旋 1 min，過 0.2 μm 有機濾膜，裝瓶上機測定。

3)氣相色譜條件：毛細管色譜柱：SH-Rtx-1701 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；設(shè)定升溫程序如下：初始溫度 200 ℃，以 5 ℃/min 速度升至 220 ℃，不保持，再以 40 ℃/min 升至 280 ℃，保持 6 min；進樣體積：1 μL；進樣口溫度：250 ℃；不分流進樣；FPD檢測器溫度：280 ℃，氫氣流量：62.5 mL/min，空氣流量：90 mL/min；氮氣流量：40 mL/min；柱流量：2 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學模型的建立

分別稱取10組試樣，進行平行試驗，外標法定性和定量，試樣中農(nóng)藥殘留量計算公式如下：

(1)

式中：w為試樣中農(nóng)藥殘留量質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；ρ為標準溶液中農(nóng)藥的質(zhì)量濃度，mg/L；A為樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；As為農(nóng)藥標準溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；V1為提取溶劑總體積，mL；V2為吸取出用于檢測的提取溶液的體積，mL；V3為樣品溶液定容體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

2.2 測定不確定度分量來源分析

根據(jù)測量過程和公式(1)，板栗中亞胺硫磷含量測定不確定度的來源如下：

1)配制標準溶液時引入的不確定度U1，rel，包括標準物質(zhì)純度引入的不確定度U1，標準工作溶液稀釋過程中移液器引入的不確定度U2，容量瓶容量引入的不確定度U3，定容時人為讀數(shù)誤差引入的不確定度U4，定容時溫度變化引入的不確定度U5[4-7]；

2)標準曲線引入的不確定度U2，rel[8]；

3)稱樣時電子天平引入的不確定度U3，rel；

4)添加萃取溶劑時瓶口分液器引入的不確定度U4，rel；

5)移取萃取溶液時 10 mL 刻度吸管引入的不確定度U5，rel；

6)樣品定容時 1 mL 移液槍引入的不確定度U6，rel；

7)氣相色譜儀自動進樣引入的不確定度U7，rel；

8)FPD檢測器響應(yīng)值引入的不確定度U8，rel；

9)重復(fù)測量的相對不確定度U9，rel(A類)。

試驗所用試劑均為色譜純，因而空白樣品測定所致的測定不確定度影響很小，可忽略不計。

2.3 各不確定度的評定

2.3.1 配制標準溶液時引入的不確定度U1，rel

1)標準物質(zhì)純度引入的不確定度U1[9-10]

2)標準工作液稀釋過程中移液槍引入的不確定度U2

3)標準溶液定容過程中容量瓶容量引入的不確定度U3

4)定容時讀數(shù)誤差引入的相對不確定度U4

定容時人為讀數(shù)誤差引入的不確定度可根據(jù)重復(fù)讀取實驗數(shù)據(jù)進行計算。表1為 10 mL 容量瓶重復(fù)6次定容實驗結(jié)果，根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)計算得：

(2)

表1 10 mL容量瓶重復(fù)定容實驗結(jié)果

5)定容時溫度引起體積變化引入的不確定度U5

擬合以上5項得出配制標準溶液時引入的不確定度為：

=0.0074

2.3.2 標準曲線引入的不確定度U2，rel

本實驗經(jīng)過初篩，確定配置5個梯度質(zhì)量濃度點的亞胺硫磷標準溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 μg/mL。采用GC-2010Plus氣相色譜儀進行亞胺硫磷含量測定，每一濃度的標準溶液分別進樣3次，得到相應(yīng)的色譜峰面積[2](n=15，詳見表2)。

用最小二乘法擬合得到線性回歸方程為Y=380335.51015x-3192.569488，r2=0.999[10-11]。同時對板栗樣品溶液中亞胺硫磷的濃度重復(fù)測定3次，由線性回歸方程計算得樣品溶液的質(zhì)量濃度分別為0.13、0.14、0.14 mg/kg，平均值為 0.14 mg/kg，則用標準曲線求得樣品溶液濃度引入的相對不確定度按式 (3)計算：

(3)

U2，rel=0.024

2.3.3 樣品稱量時天平引入的相對不確定度U3，rel

2.3.4 添加萃取溶劑時瓶口分液器引入的不確定度U4，rel

2.3.5 移取萃取溶液時 10 mL 刻度吸管引入的不確定度U5，rel

1)移液管體積刻度的不確定度

2)液體充滿至移液管刻度線的估讀誤差

3)溫度變化引入體積變化的標準不確定度

合成以上3項得出 10 mL 分刻度吸管不確定度為：

2.3.6 樣品定容時 1 mL 移液槍引入的不確定度U6，rel

2.3.7 氣相色譜儀自動進樣引入的不確定度U8，rel

2.3.8 FPD檢測器響應(yīng)值引入的不確定度U8，rel

氣相色譜儀靈敏度較高，故儀器穩(wěn)定性及測定值分散性是FPD檢測器測量不確定度的主要來源。采用標準工作溶液連續(xù)測定8次，測得質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)見表3，以質(zhì)量濃度值的分散性計算相對不確定度：

表3 標準工作溶液重復(fù)測定實驗結(jié)果

(4)

2.3.9 重復(fù)測量的相對不確定度U9，rel(A類)

測量板栗樣品中亞胺硫磷質(zhì)量分數(shù)，共進行了10次平行試驗，結(jié)果見表4。

表4 平行試驗結(jié)果值

U9=S(c)=0.0067 mg/kg

3 不確定度的合成與擴展

3.1 合成相對標準不確定度

標準不確定度分量來源、量值、貢獻率見表5。

表5 標準不確定度分量匯總

利用U1，rel～U10，rel不確定度分量結(jié)算結(jié)果計算合成相對不確定度[16]，得：

本實驗測得板栗樣品中亞胺硫磷質(zhì)量分數(shù)為 0.14 mg/kg，合成標準不確定度為：

Uc(rel)=Urel×x=0.054×0.14 mg/kg=0.0076 mg/kg

由表5可知，測量板栗中亞胺硫磷質(zhì)量分數(shù)過程中，不確定度的來源影響大小為重復(fù)測量>標準工作曲線>標準溶液配置>FPD檢測器 >10 mL 分刻度吸管。其中，重復(fù)測量、標準工作曲線、標準溶液配置、FPD檢測器和 10 mL 分刻度吸管引入的不確定度較大，貢獻率達54.70%、27.35%、8.43%、5.24和3.53%。

3.2 擴展不確定度

取95%的置信概率，包含因子k=2，則擴展不確定度U(x)=k×Uc(rel)=0.015 mg/kg，因此，采用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷質(zhì)量分數(shù)，當測量的數(shù)據(jù)為 0.14 mg/kg 時，測量的結(jié)果表示為(0.14±0.015)mg/kg，k=2。

4 結(jié)論與討論

4.1 標準物質(zhì)的使用

檢驗用的標準物質(zhì)或標準溶液的準確性直接影響到定量結(jié)果的準確性和可靠性。標準物質(zhì)的溯源性至關(guān)重要，實驗應(yīng)使用有證的標準物質(zhì)。本試驗為農(nóng)藥殘留的能力驗證活動，對于標準溶液的要求相對來說是比較高的，具體有以下幾個方面：一是農(nóng)殘標液應(yīng)該購買新生產(chǎn)的標液，因為農(nóng)藥具有不穩(wěn)定性、在光、熱影響下容易發(fā)生分解及轉(zhuǎn)化；二是農(nóng)殘標液應(yīng)在符合標液證書的保存條件下進行保存；三是農(nóng)殘的標液不確定度相對來說比較大。因此最好采用液標和固體標準物質(zhì)的配制溶液進行比較，以確保其可靠性；四是配制農(nóng)殘標準溶液時要注意介質(zhì)的使用。根據(jù)母液與農(nóng)藥的溶解性、樣品檢驗標準方法中的提取液及定容上機的溶劑來進行選擇。

4.2 樣品的保存和前處理

一是農(nóng)藥殘留量本身含量比較低，而且農(nóng)藥具有不穩(wěn)定的特性，因此實驗室在接到樣品后應(yīng)立即進行實驗，無法馬上進行實驗的應(yīng)將樣品處于(0～4)℃冷藏箱中避光保存；二是由于樣品是經(jīng)過冷藏的，在進行實驗之前最好將樣品放置至室溫后再進行稱樣，否則易吸收空氣中的水分造成稱量誤差；三是樣品的前處理要根據(jù)檢驗方法選擇合適的有機溶劑，提取方式、時間應(yīng)按照檢驗方法的要求嚴格進行，否則會出現(xiàn)提取不完全的情況；四是由于板栗樣品中的成分比較復(fù)雜、樣品中的色素及脂類成分都可能影響實驗結(jié)果。所以最好對提取液進行有效的凈化處理，而且要進行多次洗脫，使目標組分全部轉(zhuǎn)移到提取溶液中，避免組分的損失。

4.3 儀器設(shè)備

一是農(nóng)殘分析對于儀器的要求比較高，實驗前應(yīng)該對儀器的進樣針、氣路、色譜柱、檢測器等進行清洗及凈化，使樣品分析過程中不受污染。二是分析檢測時分析儀器要確保處于穩(wěn)定狀態(tài)，參數(shù)設(shè)置及分析條件優(yōu)化到最佳狀態(tài)。實驗室應(yīng)根據(jù)所用儀器型號將儀器調(diào)整至最佳狀態(tài)。三是為了避免系統(tǒng)誤差，條件允許的情況下，可以用多臺儀器進行結(jié)果比較，而且要注意進樣過程中試劑的揮發(fā)對結(jié)果造成的影響。

4.4 檢驗人員

一是檢驗人員在實驗前應(yīng)熟悉檢驗方法標準，掌握檢測方法基本原理，實驗過程要求做到操作規(guī)范、熟練嚴格按檢測方法的要求對樣品中的目標組分進行檢測；二是檢驗人員應(yīng)熟知保證結(jié)果準確性的驗證方法，比如通過進行加標實驗，將加標實際結(jié)果與理論結(jié)果相比較，如果出現(xiàn)回收率過高或過低的情況應(yīng)及時進行原因分析并糾正；三是檢測人員應(yīng)考慮農(nóng)殘的檢測中各種因素的影響，比如樣品中的基質(zhì)效應(yīng)對農(nóng)殘結(jié)果影響是很大的。因此應(yīng)該通過基質(zhì)曲線加標的方式將這個影響降低到最小。

因此，用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷農(nóng)藥過程中應(yīng)選用有證的標準物質(zhì)，精度較好的量器，規(guī)范移液管和容量瓶的操作，確保配置標準工作溶液濃度的準確性；選擇擬合線性高的工作曲線進行校準；規(guī)范樣品的保存和前處理步驟；對分析儀器進行日常維護和按時檢定；加強檢驗人員的檢測技術(shù)培訓，適當增加平行樣來降低不確定度，提高檢測結(jié)果的準確性。

本試驗采用氣相色譜法測定板栗中亞胺硫磷濃度，測量不確定度主要來源于重復(fù)測量、標準工作曲線、標準溶液配置、FPD檢測器和 10 mL 分刻度吸管，貢獻率分別為54.70%、27.35%、8.43%、5.24和3.53%，其中重復(fù)測量引入的不確定對測量結(jié)果的影響最大。