劉 盼，崔艷雨，岳 琳，商書波，王愛麗

(德州學(xué)院，德州市食品加工高濃度有機(jī)廢水處理及資源化利用工程實(shí)驗(yàn)室，德州市環(huán)境友好功能材料工程研究中心，山東 德州 253023)

菹草是一種特殊的冬春季生活型沉水植物，莖葉比較發(fā)達(dá)，有較大的比表面積，能有效去除水中的污染物[1-3]。當(dāng)菹草衰亡沉積到水底時(shí)，被微生物分解，消耗溶解氧并向水中釋放一些污染物，造成水體二次污染[4-6]。有研究表明，菹草中含有豐富的黃酮和多酚類化合物[7]。黃酮和多酚類化合物，作為具有生物活性和醫(yī)療功能的天然化學(xué)產(chǎn)物，具有清除人體內(nèi)多余的自由基、減緩衰老、增強(qiáng)人體免疫力等功效[8-9]。

關(guān)于菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取，已有一定的研究，不同的提取溶劑和提取方法對(duì)黃酮和多酚類化合物的提取率影響較大。例如，蔡榮榮等[7]采用90%的乙醇提取菹草中的黃酮和多酚類化合物，用石油醚和乙酸乙酯對(duì)提取物進(jìn)行萃取。近年來，低共熔溶劑(DESs)已被用于天然產(chǎn)物中活性成分的提取(如黃酮、皂苷、多糖、生物堿、醌類、酚酸、揮發(fā)油等)、分離、色譜分析等。低共熔溶劑(DESs)是由氫鍵受體與氫鍵供體通過氫鍵結(jié)合形成的一種低共熔混合物，具有低熔點(diǎn)、低成本、低毒性、易制備、可生物降解、溶解性能好[10-11]等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，被認(rèn)為是一種新型的綠色溶劑。有研究表明，DESs不僅能增加生物活性成分的溶解性，還對(duì)不穩(wěn)定生物活性成分具有良好的增穩(wěn)作用[12-13]。本文選用綠色高效的天然低共熔溶劑對(duì)菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物進(jìn)行提取，開發(fā)菹草新的應(yīng)用價(jià)值，不僅可以減少環(huán)境污染，還可以實(shí)現(xiàn)生物資源的再利用，達(dá)到以廢治廢的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1)菹草，采于山東省德州市岔河，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用清水洗凈，去除雜質(zhì)，低溫烘干后粉碎為粉末狀，置于陰涼干燥處備用。

2)DESs的合成。按照1∶2的物質(zhì)的量比稱取 27.926 g 氯化膽堿(作為氫鍵受體)和 24.8 g 乙二醇(氫鍵供體)，放入燒杯中；利用磁力攪拌器攪拌，控制油浴溫度 80 ℃，加熱 1 h ，直至形成均一透明的液體[14]。臨用前，分別將DESs與水按照一定體積比配制的含水量為0(純DESs)、30%、40%、50%、60%、80%、90%和100%的DESs(純水)。

1.2 儀器和試劑

循環(huán)水真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；集熱式型恒溫加熱磁力攪拌器(85-2，菏澤市鑫源儀器儀表有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(752型，上海菁華科技儀器有限公司)；粉碎機(jī)(XTP-100型，浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100型，上海愛朗儀器有限公司)。

氯化膽堿、乙二醇、沒食子酸、葡萄糖、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、氫氧化鈉、乙酸乙酯、苯酚、濃硫酸、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純?cè)噭?；福林酚為生物試劑?/p>

1.3 有效成分的提取

稱取8份 1.0 g 干燥的菹草粉末，量取8份 10 mL 不同含水率的DESs，分別混合。將混合物置于 50 mL 的圓底燒瓶中，控制油浴溫度60～65 ℃，用磁力加熱攪拌器加熱攪拌 1 h 。提取完畢后，抽濾，得到8份提取液，記錄每份提取液的體積。

1.4 有效成分的測(cè)定

1.4.1 黃酮類化合物的測(cè)定

黃酮類化合物的測(cè)定參考劉景煜的方法[15]。分別取 1.00 mL 提取液，稀釋10倍。各取 1.00 mL 稀釋液到 10 mL 比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液 0.30 mL，搖勻，放置 6 min；加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，放置 6 min；加 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 4.00 mL，再用無水乙醇稀釋至刻度，放置 15 min 后；以去離子水作參比，在 510 nm 處測(cè)定其吸光度。

1.4.2 多糖類化合物的測(cè)定

多糖類化合物的測(cè)定參考周偉娥的方法[16]。分別取 1.00 mL 提取后的樣品，稀釋50倍。取稀釋后的 2.00 mL 樣品置于 10 mL 比色管，另取 2.00 mL 去離子水作空白對(duì)照。向上述各試管中加入 1.00 mL 6%苯酚溶液，搖勻；滴加 5.00 mL 濃硫酸后加水至 10 mL，搖勻；靜置 15 min；以去離子水作參比，于 490 nm 處測(cè)定吸光度。

1.4.3 多酚類化合物的測(cè)定

多酚類化合物的測(cè)定參考陳曉明的方法[17]。分別取 1.00 mL 稀釋10倍后的樣品到 10 mL 比色管中，加入 1.00 mL 50%的FC(福林酚)溶液和 2.00 mL 15%碳酸鈉溶液；用超純水定容至刻度線，充分混勻后，室溫下避光放置 1 h；以蒸餾水作參比，在 760 nm 處測(cè)定其吸光度。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DESs樣品中溶劑干擾多酚的測(cè)定，采取如下方法消除干擾：分別取 1.00 mL 樣品放入圓底燒瓶中，分3次加入 6.00 mL 乙酸乙酯進(jìn)行萃取；然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。旋干液體后用 6.00 mL 蒸餾水沖洗燒瓶，再用蒸餾水定容至 10 mL，重復(fù)上述步驟。

多酚在溶液中是解離狀態(tài)和分子狀態(tài)并存，并且溶液pH的大小會(huì)影響多酚的存在形態(tài)，進(jìn)而影響多酚萃取效率[18-19]。實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了pH的影響，先用pH試紙測(cè)定含DESs樣品的pH；如果樣品pH小于等于4，則不再調(diào)pH；如果樣品pH大于4，需用硫酸調(diào)節(jié)pH為4，其余步驟同上。

1.4.4 提取率的計(jì)算

根據(jù)公式(1)計(jì)算菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取率。

(1)

式中：T為菹草中黃酮、多酚和多糖類化合物的提取率；X為稀釋樣品中黃酮、多酚和多糖類化合物的質(zhì)量濃度(mg/mL)；D為稀釋倍數(shù)；V為菹草樣品抽濾體積(mL)；m為菹草樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮、多糖、多酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

黃酮、多糖和多酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

表1 黃酮、多糖和多酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 DESs含水量對(duì)黃酮化合物提取效果的影響

黃酮普遍存在于各種植物和水果中，能夠加快血液循環(huán)速率，降低膽固醇和心腦血管疾病的發(fā)病率。DESs含水量對(duì)菹草黃酮提取效果的影響見圖1。

圖1 不同含水量的低共熔溶劑對(duì)菹草中黃酮類化合物提取效果的影響

由圖1可知，隨著DESs中含水量的增加，DESs對(duì)菹草中黃酮類化合物的提取效率先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取溶劑含水量為40%時(shí)，提取效率最高為1.718%。當(dāng)提取溶劑含水率低于40%時(shí)，可能是因?yàn)镈ESs的黏度變大，導(dǎo)致組分流動(dòng)性弱，分子難以擴(kuò)散，提取后樣品難以過濾，因此提取效果不佳。當(dāng)提取溶劑含水量超過40%時(shí)，隨著含水量的增大，DESs的優(yōu)勢(shì)減弱，溶劑主要呈現(xiàn)水的性質(zhì)?；谙嗨葡嗳茉?，黃酮作為有機(jī)組分，在水中溶解度較低，因此提取效率最低。

本實(shí)驗(yàn)在含水量為40%的DESs的提取菹草中黃酮類化合物的提取效率為1.718%，即含量為 17.18 mg/g。張?jiān)汽惖萚20]測(cè)得山東產(chǎn)半枝蓮中黃酮類化合物(野黃岑苷和木犀草素)含量為 12.331 mg/g，唐森等[21]的研究中得到刀豆殼中總黃酮最大提取量為 2.330 mg/g。相比半枝蓮和刀豆殼中的黃酮類化合物，菹草中的黃酮類化合物含量較高，可研究開發(fā)菹草的藥用功能。

不同的提取溶劑對(duì)菹草中黃酮類化合物的提取效率不同。例如，蔡榮榮等[7]以90%的乙醇為溶劑，分別用石油醚和乙酸乙酯對(duì)菹草中的黃酮類化合物進(jìn)行萃取，測(cè)得菹草中總黃酮含量分別為0.1235%和0.0760%，明顯低于本實(shí)驗(yàn)中含水量40%的DESs 作為提取溶劑時(shí)的提取率。

2.3 DESs含水量對(duì)多糖類化合物提取效果的影響

不同含水量的DESs對(duì)菹草多糖類化合物提取效果見圖2。

圖2 不同含水量的低共熔溶劑對(duì)菹草中多糖類化合物提取效果的影響

由圖2看出，隨著DESs中含水量的增加，DESs菹草中多糖類化合物的提取效率先升高后降低：

1)純DESs(0含水量的DESs)對(duì)多糖類化合物的提取效率最低，可能是因?yàn)榧僁ESs為透明膠狀液體，DESs含量高時(shí)黏度較大，分子擴(kuò)散弱。

2)隨著含水量的增加，DESs黏度降低，樣品在溶液中分散度增大，相應(yīng)的接觸面積也增大，使得菹草樣品能得到充分的溶解融合，從而DESs溶劑對(duì)菹草中的多糖類化合物提取率呈上升趨勢(shì)。當(dāng) DESs的含水量為80%～90%時(shí)，對(duì)多糖類化合物的提取率高達(dá)1.976%。

3)100%含水量即純水對(duì)菹草中多糖類化合物的提取較低，可能是因?yàn)槎嗵穷惢衔锎蟛糠质谴蠓肿踊衔?，在水中的溶解度有限?/p>

因此提取多糖類化合物宜采用含水量為80%～90%的DESs溶劑。本實(shí)驗(yàn)中菹草的多糖含量為1.976%，徐輝等[22]測(cè)得烏龍頭的粗多糖含量為 3.4 g/kg，海力茜·陶爾大洪等[23]測(cè)得蕪菁多糖平均含量為8.99%。相比烏龍頭和蕪菁，菹草中多糖含量較少。

2.4 DESs含水量和提取溶液pH對(duì)多酚類化合物提取效果的影響

由于測(cè)定多酚類化合物時(shí)，提取溶劑DESs對(duì)測(cè)定有干擾，為避免此干擾，采取了萃取的方法。萃取時(shí)，多酚類化合物為分子狀態(tài)時(shí)萃取效果較好。為使多酚類化合物以分子態(tài)為主，應(yīng)使溶液保持弱酸性，因此在萃取前先用硫酸調(diào)節(jié)溶液pH為4[18-19]，同時(shí)做未調(diào)pH組進(jìn)行比較。由于含水量為90%的DES樣品液和含水量為0的DESs(即純DESs)樣品液pH為4，符合弱酸性的條件，因此沒有再調(diào)pH。

不同含水量的低共熔溶劑和提取溶液pH對(duì)菹草多酚類化合物提取效果的影響如圖3所示。

圖3 不同含水量的低共熔溶劑和提取溶液pH對(duì)菹草中多酚類化合物提取效果的影響

由圖3看出，含水量60%的 DESs和含水量80%的DESs對(duì)菹草中多酚類化合物的提取效率較高。提取多酚類化合物萃取前對(duì)溶液pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)提取效率影響較大。調(diào)節(jié)pH的提取效率明顯高于未調(diào)節(jié)pH的，其中含水量為80%的 DESs調(diào)節(jié)pH的提取率是未調(diào)節(jié)pH的7.53倍。再一次證實(shí)了pH對(duì)多酚類化合物存在形態(tài)的影響。

3 結(jié)論

采用不同含水量的DESs對(duì)菹草中的黃酮、多糖和多酚類化合物在油浴溫度為 60 ℃，加熱回流提取 1 h 時(shí)，得到如下結(jié)論：

1)隨著DESs中含水量的增加，DESs菹草中黃酮類化合物的提取效率先升高后降低；當(dāng)提取溶劑為含水量40%的DESs時(shí)，提取效率最高，為1.718%。

2)隨著DESs中含水量的增加，多糖類化合物的提取效率先升高后降低；含水量為80%的 DESs對(duì)多糖類化合物的提取率最高，提取率為1.976%。

3)提取多酚類化合物萃取前對(duì)溶液pH進(jìn)行調(diào)節(jié)對(duì)提取效率影響較大；調(diào)節(jié)pH的提取效率明顯高于未調(diào)節(jié)pH的，其中含水量為80%的 DESs調(diào)節(jié)pH的提取率是未調(diào)節(jié)pH的7.53倍。

4)測(cè)得菹草中黃酮類化合物含量較高，多糖和多酚類化合物含量較低，可進(jìn)一步開發(fā)菹草藥用價(jià)值。