張 彬,陸 華,宋娜麗,王世春,劉 奇,吳春曦,易中梅△

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科/中國(guó)人民解放軍重慶血站,重慶 400038;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院輸血科 400010)

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)在治療難愈合性創(chuàng)面、關(guān)節(jié)損傷及皮膚年輕化等應(yīng)用醫(yī)學(xué)的效果優(yōu)勢(shì),讓PRP的制備技術(shù)也得到飛速發(fā)展[1-2]。目前PRP分為手工分離制備和血細(xì)胞分離機(jī)采集(機(jī)采),機(jī)采回收率穩(wěn)定,但需患者有足夠的血容量及良好的心肺功能,在采集過(guò)程中,能夠耐受短時(shí)間內(nèi)≥400 mL血液短暫離體。體重較輕的患者血容量較少、年紀(jì)較大的患者心功能對(duì)失血的耐受性差,采集風(fēng)險(xiǎn)較大。對(duì)于低體重又需用自體PRP的患者,小劑量全血白膜法血袋制備技術(shù)顯得尤為重要。全血來(lái)源現(xiàn)有制備劑量200、300、400 mL,采血袋制備PRP均有相關(guān)制備技術(shù)的報(bào)道[3-5],為了彌補(bǔ)更小劑量全血采血袋制備PRP的研究空白,本課題組對(duì)50、100 mL全血不同制備參數(shù)下獲得PRP回收率進(jìn)行了比較分析,旨在確定該條件下制備PRP的最佳方法,更好地滿足臨床需求,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集相同來(lái)源的全血50、100 mL各75袋。儀器和試劑:一次性使用塑料四聯(lián)采血袋(批號(hào)210818,四川南格爾公司),50、100 mL轉(zhuǎn)移袋(批號(hào)210401、210402,四川南格爾公司),大容量低溫離心機(jī)(型號(hào)6000i,德國(guó)Thermo公司),Hemax330血球計(jì)數(shù)儀(山東煙臺(tái)),CM735A采血秤(韓國(guó)森通公司),SE250熱合機(jī)(韓國(guó)森通公司),分光光度計(jì)(型號(hào)UNIC7200,上海尤尼柯公司)。本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)[倫理批件號(hào):(A)KY2021057]。

1.2 方法

1.2.1分組

將相同來(lái)源的全血50、100 mL各75袋根據(jù)離心時(shí)間(9、11、13、15、17 min)分為5組,每組15例,手工分離白膜,比較白膜層血小板回收率。將白膜10 mL×60袋、20 mL×70袋根據(jù)離心時(shí)間(9、13、17 min)分為3組,分離PRP,在20 mL白膜70 g離心力時(shí)增加1組21 min離心時(shí)間,分組增加為4組,每組均為10例,比較PRP血小板回收率;同時(shí)檢測(cè)并比較在該條件下PRP血小板低滲休克反應(yīng)(hypotonic shock response,HSR)比率,每組各6例。

1.2.2確定離心力

第1次離心:根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期制備濃縮血小板的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)(1 875 g,22 ℃,15 min)[6],離心時(shí)間及溫度不變,均使用100 mL轉(zhuǎn)移袋,倍比下降整數(shù)設(shè)置離心力梯度,依次為940、470、240 g。肉眼觀察白膜層的緊實(shí)度適宜:全血取出時(shí),白膜層無(wú)渾濁,分離時(shí)白膜層上浮無(wú)附壁。50、100 mL全血分別確定離心力為470、940 g。第2次離心:參照參數(shù)(70～100 g,22 ℃,10 min)[7-8],離心時(shí)間及溫度不變,均使用50 mL轉(zhuǎn)移袋,設(shè)置離心力梯度為100、70 g,肉眼觀察紅細(xì)胞下沉的緊實(shí)度適宜,10、20 mL白膜分別確定離心力為70、100 g。

1.2.3制備PRP

將50、100 mL全血進(jìn)行第1次離心,分別按照470、940 g,(22±2)℃,9、11、13、15、17 min離心,分離白膜層為10、20 mL,分離后靜置1 h,震搖30 min,測(cè)量白膜層血小板計(jì)數(shù),計(jì)算白膜層血小板回收率。將白膜10、20 mL分別以70、100 g,(22±2)℃,9、13、17、21 min(僅在70 g比較)進(jìn)行第2次輕離心,分離PRP,靜置1 h,震搖30 min,檢測(cè)血小板計(jì)數(shù),計(jì)算PRP血小板回收率。

1.2.4測(cè)定HSR比率

PRP用自身貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)稀釋至血小板 200×109/L～400×109/L,與PPP、蒸餾水均置于37 ℃保溫,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)pH 7.4,PPP與PBS按2∶1的體積比混合調(diào)零,PRP與PBS 按2∶1的體積比混合作為對(duì)照管,PRP與蒸餾水按2∶1的體積比混合作為樣品管,在610 nm處讀取樣品最小吸光度(A)值及15 min時(shí)A值,并按下列公式計(jì)算HSR比率:

1.2.5觀察指標(biāo)

全血白膜層血小板回收率、白膜層PRP血小板回收率、PRP HSR比率。

1.2.6標(biāo)本留取

白膜混勻后留取0.5 mL,測(cè)定血小板計(jì)數(shù);PRP留取4～7 mL,進(jìn)行血小板計(jì)數(shù),再檢測(cè)HSR比率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同離心時(shí)間白膜層血小板回收率比較

50 mL全血在470 g離心11～17 min白膜層血小板回收率處于較高水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 mL全血在940 g離心11～15 min白膜層血小板回收率處于較高水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種劑量白膜層血小板回收率可在離心11 min時(shí)即達(dá)到較高水平,見表1。

表1 不同離心時(shí)間白膜層血小板回收率比較

2.2 不同離心時(shí)間PRP血小板回收率比較

10 mL白膜在70 g、離心13 min PRP血小板回收率最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);20 mL白膜在100 g、離心13 min PRP血小板回收率最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 不同離心時(shí)間PRP血小板回收率比較

2.3 不同離心時(shí)間PRP HSR比率比較

10 mL白膜在70 g、離心13 min及100 g、離心9 min PRP HSR比率最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);20 mL白膜在70 g、離心17 min及100 g、離心13 min PRP HSR比率最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 不同離心時(shí)間PRP HSR比率比較

3 討 論

血小板制劑用于臨床非輸注性(局部)治療或輸注性(全身)治療,均是全血來(lái)源的血小板濃縮物,制備技術(shù)及臨床需求既有重疊又存在較大區(qū)別(為了方便論述,文中PRP僅指非輸注性血小板制劑),如兩者血袋白膜法制備的技術(shù)原理完全相同,但50、100 mL全血提取的血小板終產(chǎn)品由于劑量小(10～20 mL),輸注后不能達(dá)到治療效果,既無(wú)臨床需求,也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的制備參數(shù)報(bào)道,但作為PRP進(jìn)行局部治療有廣闊的應(yīng)用空間,相應(yīng)的制備參數(shù)也需研究確定并完善發(fā)展。PRP含有大量的生長(zhǎng)因子及纖維蛋白,對(duì)創(chuàng)面及損傷的修復(fù)有極大優(yōu)勢(shì)[7,9-10]。小劑量全血制備PRP適合低體重及創(chuàng)面小的患者,因容量小,手工分離制備技術(shù)更加精細(xì);且相關(guān)研究較少,可借鑒的經(jīng)驗(yàn)不足;較標(biāo)準(zhǔn)量全血(200、300、400 mL)制備PRP更加困難。文獻(xiàn)報(bào)道小劑量全血多采用離心管制備,制備過(guò)程開放環(huán)節(jié)有污染的風(fēng)險(xiǎn)[8];或是套裝制備,需要現(xiàn)場(chǎng)采集,立即制備,盡快使用,且不可儲(chǔ)存,在使用時(shí)間上受到制約。小劑量全血采血袋制備PRP技術(shù)全程封閉,無(wú)菌接駁分裝備用,既規(guī)避了開放環(huán)節(jié)風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生,又可儲(chǔ)存,可靈活地調(diào)整使用時(shí)間。

50、100 mL全血第1次離心后收集白膜為10、20 mL(定量),血小板回收率(變量)最高的數(shù)據(jù)反映的是最佳離心條件。本研究顯示,使用采血袋制備小劑量全血,50、100 mL全血470、940 g,(22±2)℃,離心11 min時(shí),全血白膜層血小板回收率即達(dá)到較高水平。與文獻(xiàn)報(bào)道400 mL全血四聯(lián)采血袋制備的白膜層血小板回收率(87.0%)相比較[11],本研究白膜層血小板回收率略低,因本實(shí)驗(yàn)使用的全血?jiǎng)┝啃?如果血袋的整個(gè)制備流程血小板耗損量相同,由于全血?jiǎng)┝啃《膿p占比更高,白膜層血小板回收率則會(huì)較低。該報(bào)道還闡述了改變制備血袋的結(jié)構(gòu),可減少血小板損失,明顯提高回收率,所以改變血袋結(jié)構(gòu)可成為提升小劑量全血白膜層回收率的研究方向之一。本研究顯示,10、20 mL白膜在70、100 g,(22±2)℃,離心13 min PRP血小板回收率最高。與本課題組前期研究的400 mL全血6聯(lián)袋制備濃縮血小板回收率(68.7%)相比,離心溫度無(wú)改變,但本研究得到的PRP血小板回收率較高[12],說(shuō)明50、100 mL全血第2次(即對(duì)白膜層的離心)離心力及離心時(shí)間均是更加適宜的離心參數(shù)。

HSR是通過(guò)在體外低滲休克環(huán)境中,血小板膨脹后再恢復(fù)正常體積的能力來(lái)反映血小板體內(nèi)存活率,是評(píng)價(jià)血小板功能的體外指標(biāo),HSR比率越高,血小板活性恢復(fù)越好[13]。本研究顯示,100 mL全血制備的PRP第2次離心為70 g、離心17 min時(shí),HSR比率為(59.53±6.60)%,繼續(xù)延長(zhǎng)離心時(shí)間到21 min也不會(huì)導(dǎo)致HSR比率下降,即體內(nèi)存活無(wú)明顯下降,與離心100 g相比,離心13 min HSR比率為(45.74±3.28)%,說(shuō)明離心力越輕,HSR比率越高,血小板損傷越小。離心70 g、13 min時(shí),HSR比率最低[(34.72±4.47)%)],離心力最輕,HSR比率卻最低。分析認(rèn)為,雖然HSR受PRP溫度、存放時(shí)間等因素影響,但因各組的條件一致,不是差異產(chǎn)生的決定性條件[14-16]。此外,PRP中混雜的紅細(xì)胞較多,在HSR實(shí)驗(yàn)中添加蒸餾水的環(huán)節(jié)造成細(xì)胞部分溶血,影響透光度導(dǎo)致離心時(shí)間更長(zhǎng)時(shí)HSR比率更低,而非PRP中血小板功能受到影響[14]。同時(shí)表明,檢測(cè)HSR比率時(shí),紅細(xì)胞應(yīng)盡可能去除完全,否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在100 g、離心13 min時(shí),HSR比率為(59.39±4.10)%,與70 g、離心17～21 min相當(dāng),隨著離心時(shí)間延長(zhǎng),HSR比率下降,說(shuō)明離心時(shí)間越短,HSR比率越高,血小板損傷越小[17]。本著提升工作效率的原則,相同的HSR比率選取用時(shí)最短的參數(shù),綜合PRP回收率,100 mL全血制備PRP,第2次離心的優(yōu)選參數(shù)為100 g、(22±2)℃、13 min。同理50 mL全血制備PRP,第2次離心優(yōu)選參數(shù)為70 g、(22±2)℃、13 min。

綜上所述,50、100 mL全血白膜法采血袋制備PRP能夠獲得理想的回收率,在其他離心條件相同的情況下,第1次離心力分別為470、940 g,離心11 min,第2次離心力分別為70、100 g,離心13 min,回收率最佳。該方法是標(biāo)準(zhǔn)劑量全血(200、300、400 mL)制備PRP的補(bǔ)充方法。