程璐瑤 陳肖學(xué) 張穎君 黃永林 朱國(guó)磊 李娜 趙平

摘 要：? 為挖掘古樹大理茶優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌間座殼屬菌株Diaporthe tectonigena的化學(xué)成分，該研究采用硅膠、大孔吸附樹脂Diaion HP20、葡聚糖凝膠LH-20等柱層析方法，對(duì)該菌株的大米固態(tài)發(fā)酵提取物進(jìn)行分離純化，并通過(guò)HRMS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC和COSY等波譜分析，對(duì)所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明：（1）從該菌株大米固態(tài)發(fā)酵提取物中分離得到4個(gè)化合物，其中新化合物1鑒定為四氫-β-咔啉二酮哌嗪類生物堿，命名為tectonicgenazine A。（2）3個(gè)已知化合物分別鑒定為trans-cyclo-（D-tryptophanyl-L-tyrosyl）（2）、1H-吲哚-3-羧酸-2，3-二羥基丙酯（3）和N-羥乙基-2-乙酰基吡咯（4），其中化合物3為首次從自然界中分離所得。

關(guān)鍵詞： 大理茶， 內(nèi)生真菌， 間座殼屬， 固態(tài)發(fā)酵， 二酮哌嗪

中圖分類號(hào)：? Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）07-1252-06

收稿日期：? 2022-08-05

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（32060107， 32060327）； 云南省教育廳科學(xué)研究基金（2021Y215）。

第一作者： 程璐瑤（1999-），碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)，（E-mail）1579193972@qq.com。

通信作者：? 趙平，博士，研究員，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)，（E-mail）hypzhao2022@163.com。

Isolation and identification of a new tetrahydro-β-

carboline diketopiperazine from a predominant

endophytic fungus in ancient Camellia taliensis

CHENG Luyao1， CHEN Xiaoxue1， ZHANG Yingjun2， HUANG Yonglin3，

ZHU Guolei1， LI Na2， ZHAO Ping1*

（ 1. Key Laboratory of State Forestry and Grassland Administration on Highly-Efficient Utilization of Forestry Biomass Resources in Southwest

China， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China; 2. State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West

China， Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650201， China; 3. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals

Research and Utilization， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：? To investigate the chemical constituents of Diaporthe tectonigena， a predominant endophytic fungus in the ancient tea tree of Camellia taliensis， the rice solid-state fermentation extract was isolated and purified by silica gel， Diaion HP20 and Sephadex LH-20 column chromatographies， and the chemical structures were elucidated by extensive HRMS， 1H-NMR， 13C-NMR， HSQC， HMBC and COSY? spectroscopic analyses. The results were as follows： （1） Four compounds were isolated from the rice solid-state fermentation extract of Diaporthe tectonigena， including a new tetrahydro-β-carboline diketopiperazine alkaloid named tectonicgenazine A （1）. （2） Three known compounds， trans-cyclo-（D-tryptophanyl-L-tyrosyl） （2）， 1H-indole-3-carboxylic acid-2，3-dihydroxypropyl ester （3） and N-hydroxyethyl-2-acetylpyrrole （4） were obtained and identified， and Compound 3 was isolated from nature for the first time.

Key words： Camellia taliensis， endophytic fungus， Diaporthe， solid-state fermentation， diketopiperazine

云南省野生茶樹資源種類繁多，被世界公認(rèn)為茶樹的原產(chǎn)地和起源中心，其中大理茶（Camellia taliensis）主要分布于云南西部和西南部，是云南省野生茶樹資源中分布最廣、面積最大、適應(yīng)性最強(qiáng)的一個(gè)茶樹種群資源（侯寬昭，1998；段志芬等，2019；王新超等，2022；唐小艷等，2022）。作為栽培茶樹的重要野生近緣植物，大理茶具有進(jìn)化上原始、抗逆性強(qiáng)、含有特異生化成分等特性，是極為寶貴的茶樹遺傳資源，對(duì)于茶樹品種的遺傳改良等具有重要意義（楊盛美等，2020；李榮姣等，2020）。云南省鳳慶縣小灣鎮(zhèn)香竹箐1號(hào)古茶樹“錦秀茶祖”是優(yōu)質(zhì)的大理茶資源，被認(rèn)為是世界上現(xiàn)存最古老、最粗大的栽培型古茶樹（楊崇仁等，2021）?！板\秀茶祖”至今常年枝繁葉茂，提示其體內(nèi)可能擁有較為完備的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)性發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)源自“錦秀茶祖”健康枝葉的內(nèi)生真菌群落表現(xiàn)出較高的物種豐富度、多樣性和均勻度，且大多數(shù)內(nèi)生真菌普遍具有較強(qiáng)的植物病原真菌拮抗活性（陳肖學(xué)，2019；Chen et al.， 2019；陳建英等，2020），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)間座殼菌科（Diaporthaceae）間座殼屬（Diaporthe）真菌D. tectonigena為“錦秀茶祖”枝條中的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌之一（陳肖學(xué)，2019；Chen et al.， 2019）。

已有研究表明，間座殼屬真菌在世界范圍內(nèi)分布廣泛（楊琴，2019；龍慧，2020），從該屬真菌中已發(fā)現(xiàn)有聚酮類、生物堿類、萜類、蒽醌類等結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，它們具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗高脂血癥等生物活性（蔡佳等，2021；Nagarajan et al.， 2021；Sun et al.， 2021；Xu et al.， 2021）。此外，該屬真菌還可用于瑞香科（Thymelaeaceae）土沉香（Aquilaria sinensis）木材的菌紋形成（何海珊等，2019）。2017年，Diaporthe tectonigena首次從泰國(guó)北部的柚木（Tectona grandis）（Doilom et al.， 2017）中分離得到，并鑒定為新種，隨后高雅慧等（2017）、Zhao等（2022）先后從大豆（Glycine max）及云南產(chǎn)小葉茶（Camellia sinensis var. sinensis）中分離得到。目前為止，關(guān)于該內(nèi)生真菌Diaporthe tectonigena的研究主要集中于種類鑒定，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用硅膠、大孔吸附樹脂Diaion HP20、葡聚糖凝膠LH-20等柱層析方法，結(jié)合MS和NMR波譜技術(shù)手段，對(duì)香竹箐1號(hào)古樹大理茶“錦秀茶祖”健康枝條中優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌D. tectonigena大米固態(tài)發(fā)酵提取物中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，以期為該菌株活性天然產(chǎn)物的進(jìn)一步挖掘和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試內(nèi)生真菌菌株分離自云南省鳳慶縣小灣鎮(zhèn)香竹箐1號(hào)古樹大理茶健康無(wú)癥狀的幼嫩枝條，經(jīng)形態(tài)鑒別和分子生物學(xué)鑒定為間座殼菌科間座殼屬Diaporthe tectonigena（Chen et al.， 2019），凍存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

試劑：甲醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，中國(guó)）、氯仿（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，中國(guó)）、乙酸乙酯（云南汕滇藥業(yè)有限公司，中國(guó)），以上試劑均為化學(xué)純；Diaion HP20（Mitsubishi Chemical Corporation）；200～300目柱層析硅膠（青島海洋化工有限公司，中國(guó)）；Sephadex LH-20（GE Healthcare，美國(guó)）。儀器：Bruker DRX-400和Burker DRX-500超導(dǎo)核磁共振儀（Bruker公司，德國(guó)）；API QSTAR Pular-1質(zhì)譜儀（Applied Biosystems，美國(guó)）；Agilent G6230 TOF 質(zhì)譜儀（Applied Agilent Technologies，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó)）；HVE-50KB高壓蒸汽滅菌鍋（華粵行儀器有限公司，中國(guó)）；PQX-308D多段可編程人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司，中國(guó)）；CP224C型電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司，中國(guó)］；超純水儀（Merck Millipore，德國(guó)）；電熱恒溫水浴鍋（山西省水文醫(yī)療器械廠，中國(guó)）；N-1001型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械有限公司，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將菌株Diaporthe tectonigena接到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，用滅菌后的打孔器切取菌餅接入100 mL PDB培養(yǎng)基置于搖床上，在27 ℃、140 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d。吸取5 mL發(fā)酵液加至250 mL發(fā)酵瓶中，每瓶大米固體培養(yǎng)基（大米30 g，蒸餾水45 mL）合計(jì)16 kg于27 ℃條件下靜止培養(yǎng)40 d。將已發(fā)酵的大米發(fā)酵物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)容器中，用適量乙酸乙酯浸泡并超聲輔助提取5次，合并濾液，濃縮得到乙酸乙酯提取物（297.82 g）；濾渣用適量甲醇浸提3次，合并濾液濃縮得到甲醇提取物（2 029.14 g）。

乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析（63 cm×9.5 cm），用石油醚∶乙酸乙酯（80∶1→1∶1）、氯仿∶甲醇（80∶1→0∶1）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測(cè)合并相同組分，得到Fr.1～Fr.16。Fr.15（19.87 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱（50 cm×8 cm）層析，以100%甲醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，合并后得到3個(gè)組分（Fr.15-1～Fr.15-3）。Fr.15-2（15.25 g）經(jīng)硅膠柱（50 cm×4.8 cm）層析，用氯仿∶甲醇∶水（60∶1∶0→8∶2∶0.2）進(jìn)行洗脫，合并得到8個(gè)組分（Fr.15-2-1～Fr.15-2-8）。Fr.15-2-2（2.28 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱（45 cm×4 cm）層析，用100%甲醇洗脫，得到化合物1（9.0 mg）。組分Fr.15-2-4（6.90 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱（55 cm×4 cm）層析，用100%甲醇洗脫，得到化合物2（11.0 mg）和3（13.0 mg）。

甲醇部分經(jīng)Diaion HP20柱（60 cm×7.5 cm）層析，水洗除雜后依次用40%、60%、80%、100%甲醇進(jìn)行洗脫，合并得到4個(gè)組分（Fr.1～Fr.4）。Fr.1經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，用100%甲醇洗脫，得到3個(gè)組分（Fr.1-1～Fr.1-3）。其中Fr.1-2（9.39 g）經(jīng)硅膠柱（50 cm×4 cm）層析，用氯仿∶甲醇（30∶1、20∶1）和100%甲醇梯度洗脫，得到化合物4（5.0 mg）。

2 結(jié)果與分析

從內(nèi)生真菌Diaporthe tectonigena大米固態(tài)發(fā)酵提取物中分離得到4個(gè)化合物，經(jīng)1D-NMR、2D-NMR和HRMS分析，化合物1鑒定為新的四氫-β-咔啉二酮哌嗪，3個(gè)已知化合物分別鑒定為trans-cyclo-（D-tryptophanyl-L-tyrosyl）（2）（Ivanova et al.， 2013）、1H-吲哚-3-羧酸-2，3-二羥基丙酯（1H-indole-3-carboxylic acid-2，3-dihydroxypropyl ester）（3）（Suvorov & Golubev， 1967）和N-羥乙基-2-乙?；量∟-hydroxyethyl-2-acetylpyrrole）（4）（Zou et al.， 2013）。

化合物1為無(wú)定形白色粉末，ESI+-MS質(zhì)譜顯示其準(zhǔn)分子離子峰m/z 382? ［M+Na］+，HR-ESI+-MS質(zhì)譜顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z 382.152 7? ［M+Na］+ （calcd， 382.152 6）。經(jīng)13C-NMR和 DEPT分析，化合物1中22個(gè)碳信號(hào)，其中包括1個(gè)伯碳（CH3）、2個(gè)仲碳（CH2）、12個(gè)叔碳（CH）、7個(gè)季碳（C），推測(cè)化合物1的分子量為359，分子式為C22H21N3O2，不飽和度為14。

1H-NMR譜顯示，化合物1含有1個(gè)1，2-二取代苯 ［δ： 7.16（1H，d，J = 7.8 Hz，H-12）， 6.95（1H，t，J = 7.0 Hz，H-13）， 7.08（1H，m，H-14）， 7.25（1H，d，J = 8.1 Hz，H-15）］和1個(gè)A2B2偶合系統(tǒng)的單取代苯質(zhì)子信號(hào) ［δ： 7.08（5H，m，H-18，19，20，21，22）］，3個(gè)次甲基質(zhì)子信號(hào) ［δ： 5.74（1H，dd，J = 7.0，3.8 Hz，H-3），4.45（1H，t，J = 3.8 Hz，H-6）， 4.11（1H，dd，J = 11.8，4.1 Hz，H-9）］，2個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào) ［δ： 2.70（2H，dd，J = 14.8，4.2 Hz，H-10），2.97（2H，dd，J = 13.9，4.9 Hz，H-16）］，1個(gè)與叔碳相連的甲基質(zhì)子信號(hào) ［δ： 1.48（3H，d，J = 6.9 Hz，H-1′）］。13C-NMR譜除顯示除兩組苯環(huán)碳信號(hào)外，還顯示有2個(gè)羰基季碳 ［δ： 164.5（C-5），167.9（C-8）］，2個(gè)雙鍵季碳 ［δ： 132.5（C-2），105.2（C-11）］，3個(gè)叔碳 ［δ： 45.8（C-3），56.1（C-6）， 52.2（C-9）］，2個(gè)仲碳 ［δ： 25.9（C-10），39.6（C-16）］和1個(gè)甲基碳信號(hào)δC 17.5（C-1′）。通過(guò)HSQC和1H-1H COSY譜分析，將化合物1的質(zhì)子信號(hào)與碳信號(hào)進(jìn)行一一歸屬（表1），進(jìn)一步確定了結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)1，2-二取代苯環(huán)和1個(gè)單取代苯環(huán)，并觀察到δH 4.11/δC 52.2（CH-9）與δH 2.70/δC 25.9（CH2-10）相連， δH 4.45/δC 56.1（CH-6）與δH 2.97/δC 39.6（CH2-16）相連，δH 5.74/δC 45.8（CH-3）與δH 1.48/δC 17.5（CH3-1′）相連（圖2），推測(cè)化合物1含有二酮哌嗪結(jié)構(gòu)。

化合物1的HMBC譜顯示δH 1.48（H-1′）與δC 132.5（C-2），δH 5.74（H-3）與δC 132.5（C-2）、δC 164.5（C-5）、δC 52.2（C-9）和δC 105. 2（C-11）之間的相關(guān)，δH 4.45（H-6）與δC 164.5（C-5）、δC 167.9（C-8）之間的相關(guān)，δH 4.11（H-9）與δC 45.8（C-3）、δC 164.5（C-5）、δC 167.9（C-8）和δC 105.2（C-11）之間的相關(guān)，δH 2.70（H-10）與δC 132.5（C-2）、δC 105.2（C-11）和δC 126.0（C-11a）之間的相關(guān)（圖2），進(jìn)一步證明化合物1具有四氫-β-咔啉二酮哌嗪類的結(jié)構(gòu)單元。δH 2.97（H-16）與δC 56.1（C-6）、δC 134.9（C-17）、δC 130.0（C-18，C-22）之間的HMBC相關(guān)，表明單取代苯通過(guò)16位的亞甲基與二酮哌嗪骨架的C-6位相連。ROESY譜進(jìn)一步顯示δH 5.74（H-3）/δH 4.11（H-9）/δH 2.97（H-16）、δ 1.48（CH3-1′）/δH 4.45（H-6）之間的NOE相關(guān)（圖2），表明H-3、H-9和H-16處于二酮哌嗪環(huán)的同一側(cè)，而CH3-1′和H-6位于該環(huán)的另一側(cè)，由此表明H-3、H-6和H-9的相對(duì)構(gòu)型分別為3α、6β和9α。經(jīng)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定化合物1為新化合物，命名為tectonicgenazine A，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

3 討論與結(jié)論

本研究從香竹箐1號(hào)古樹大理茶“錦秀茶祖”健康枝條中優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌Diaporthe tectonigena的大米固態(tài)發(fā)酵提取物中分離鑒定出1個(gè)新四氫-β-咔啉二酮哌嗪類生物堿tectonicgenazine A（1）和trans-cyclo-（D-tryptophanyl-L-tyrosyl）（2）、1H-吲哚-3-羧酸-2，3-二羥基丙酯（3）、N-羥乙基-2-乙?；量?）3個(gè)已知化合物，4個(gè)化合物均為首次從該菌株中分離得到，為該菌株活性天然產(chǎn)物的進(jìn)一步挖掘和開發(fā)利用提供了參考?；衔?于2013年首次從玫瑰小雙孢菌青銅亞種（Microbispora rosea subsp. aerata）中分離所得（Ivanova et al.， 2013），隨后，劉震等（2018）從蘿藦科（Asclepiadaceae）娃兒藤屬（Tylophora）植物娃兒藤（T. floribunda）內(nèi)生真菌Diaporthe sp.的乙酸乙酯提取物中亦分離得到?；衔?為首次從自然界中分離所得，是1個(gè)新的天然產(chǎn)物，早在1967年其作為合成吲哚甘油酯類化合物的中間體曾被報(bào)道過(guò)（Suvorov & Golubev， 1967）?；衔?于2013年首次從大戟科（Euphorbiaceae）守宮木屬（Sauropus）植物龍脷葉（S. spatulifolius）中分離得到（Zou et al.， 2013），此前其在一些海洋吡咯的合成中作為中間體曾被報(bào)道（Jefford et al.， 1994）。四氫-β-咔啉二酮哌嗪類化合物作為特殊吲哚生物堿廣泛存在于自然界中，具有抗腫瘤、抗菌等多種生物活性，并且β-咔啉類生物堿由于其具有數(shù)量多、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，已然成為咔啉類生物堿中研究最為深入的一類，二酮哌嗪結(jié)構(gòu)則在藥物化學(xué)中作為重要的藥效基團(tuán)而受到廣泛關(guān)注（馬養(yǎng)民等，2012；羅俊，2017；賈斌等，2018；丁娜，2021）。而新化合物tectonicgenazine A（1）是否也具有類似的生物活性還有待進(jìn)一步證實(shí)，且Diaporthe tectonigena菌株中其他未知的二酮哌嗪類似物值得進(jìn)一步深入挖掘。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴 鄧斯麗）