胡潛岳, 唐 婕, 方 毅, 劉春儀, 陳正平,*

(1. 南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 211166; 2. 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214063)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)是許多神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點(diǎn),如帕金森病(PD)[1]、精神分裂癥[2]和抑郁癥[3]等。腦內(nèi)DAT數(shù)量的變化可以間接反映腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變化。為了使DAT可視化,研究者已經(jīng)開發(fā)了各種成像技術(shù),如正電子發(fā)射斷層掃描(PET)是一種無創(chuàng)的成像技術(shù),具有靈敏度高,特異性強(qiáng)及安全性好的優(yōu)點(diǎn)。而研發(fā)正電子核素(如11C、18F)標(biāo)記的靶向DAT的分子探針進(jìn)行PET成像有助于對(duì)相關(guān)疾病的診斷、療效監(jiān)測(cè)和疾病機(jī)理研究。

目前,大量11C或18F標(biāo)記的放射性探針已被開發(fā)用于PET成像[4]。與11C標(biāo)記的探針相比,18F標(biāo)記的探針具有更低的正電子能量和合適的半衰期,是廣泛用于PET成像的正電子核素。靶向DAT的探針[18F]FP-CIT是目前國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用最廣泛的18F標(biāo)記的正電子探針,因具有半衰期適宜、親和力和特異性高等優(yōu)點(diǎn),被用于PD和多種與多巴胺能神經(jīng)變性相關(guān)的成像,在臨床中應(yīng)用廣泛[5]。然而,[18F]FP-CIT在體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶的作用下,N-氟丙基易代謝脫烷基而產(chǎn)生[18F]氟烷基代謝物,這些放射性代謝產(chǎn)物能夠進(jìn)腦,從而影響PET成像的準(zhǔn)確性[6]。因此,開發(fā)出體內(nèi)穩(wěn)定性高、DAT靶向性好的PET探針,將有助于PET技術(shù)對(duì)腦內(nèi)DAT進(jìn)行精準(zhǔn)成像和定量分析,從而更有利于對(duì)DAT相關(guān)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

將藥物易代謝物部位的C—H用C—D取代從而制得氘代藥物,能夠降低藥物在體內(nèi)的代謝速度,提高體內(nèi)穩(wěn)定性,改善藥代動(dòng)力學(xué)。氘代技術(shù)已在某些藥物(例如Austedo)取得了成功的應(yīng)用[7]。在放射性藥物領(lǐng)域,已有文獻(xiàn)報(bào)道了幾個(gè)成功的氘代探針[8-10]?；诖?本研究利用氘代策略,設(shè)計(jì)并合成了一種[18F]FP-CIT的氘代結(jié)構(gòu)[18F]FP-CIT-d6([18F]7),預(yù)期新氘代探針[18F]7在保持DAT靶向性的同時(shí),還能減緩探針的體內(nèi)代謝速度,減少放射性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,從而提高PET顯像的準(zhǔn)確性。化學(xué)合成方法為:利用丙二酸二乙酯(化合物1)在重水中通過氘氫交換得到化合物2,用氘代氫化鋁鋰還原化合物2得到氘代丙二醇(化合物3),化合物3再經(jīng)過磺?；频没撬狨?化合物4),化合物4和四丁基氟化銨(TBAF)發(fā)生親核取代反應(yīng)得到化合物5,化合物5與化合物6反應(yīng)得到非放射性靶向DAT的化合物FP-CIT-d6(7);化合物3經(jīng)磺?；磻?yīng)后得到化合物8,化合物8與化合物6進(jìn)行親核取代反應(yīng)得到化合物9,再與甲基磺酸酐發(fā)生磺?；磻?yīng)得到標(biāo)記前體化合物10。采用質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜和氟譜對(duì)合成的中間體、非放射性化合物與標(biāo)記前體化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。利用前體化合物10與18F-在堿性環(huán)境中進(jìn)行一步法標(biāo)記得到放射性探針[18F]FP-CIT-d6([18F]7);利用放射性HPLC測(cè)定了其放射性化學(xué)純度,并驗(yàn)證放射性探針的結(jié)構(gòu)。本文還測(cè)定了探針[18F]7在磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清(FBS)中的體外穩(wěn)定性,用搖瓶法測(cè)定了[18F]7脂水分配系數(shù)(LogP),為探針后續(xù)體內(nèi)生物活性研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Avance III 400MHz型核磁共振儀(溶劑:氘代氯仿,CDCl3;內(nèi)標(biāo)物:四甲基硅烷,TMS);SQ Detector 2型電子噴霧離子質(zhì)譜儀;住友H7型回旋加速器;Waters 1525 Binary型高效液相色譜儀;Waters 1525 Plus Binary型半制備型高效液相色譜儀;Waters 2998型雙通道紫外可見光檢測(cè)器;Gabi Nova型放射檢測(cè)器。

丙二酸二乙酯(化合物1)、重水(D2O)、氘代氫化鋁鋰(LiAlD4)、對(duì)甲苯磺酰氯(TsCl)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶(Py)、四丁基氟化銨(TBAF)、甲基磺酸酐(Ms2O)、 2-甲基-2-丁醇(TAA)均購(gòu)自安耐吉化學(xué)試劑有限公司;乙醚(分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、四氫呋喃(THF)、甲苯(PhMe,分析純)、二氯甲烷(CH2Cl2,分析純)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(CH3CN,色譜純)、甲醇(色譜純)、三乙胺(TEA,色譜純)、三氟乙酸(TFA,色譜純)均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司;2β-甲酯基-3β-(4-碘苯基)去甲基托烷(化合物6)參照文獻(xiàn)[11-12]自制。

1.2 合成

非放射性化合物7和標(biāo)記前體化合物10的合成路線如圖1～2所示。

圖2 標(biāo)記前體化合物10的合成路線

(1) 化合物2的合成

化合物2參照文獻(xiàn)[13]步驟合成,在丙二酸二乙酯(化合物1, 1.60 g, 10.00 mmol)的D2O(20.0 mL)加入無水碳酸鉀(K2CO3, 0.14 g, 1.00 mmol),反應(yīng)液在室溫下攪拌24 h,反應(yīng)結(jié)束后用乙醚萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,除去溶劑后得到1.26 g化合物2:無色透明液體,產(chǎn)率78%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 4.13(q,J=7.2 Hz, 4H), 1.21(t,J=7.2 Hz, 6H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 166.48, 61.30, 41.06(quint.,JC,D=20.1 Hz), 13.92; ESI-MSm/z: Calcd for C7H10D2NaO4{[M+Na]+} 185.08, found 185.24。

(2) 化合物3的合成

化合物2(1.94 g, 11.97 mmol)的3 mol/L THF溶液在0 ℃下,緩慢滴加到1.0 mol/L LiAlD4(0.60 g, 14.36 mmol)的THF溶液中,反應(yīng)液加熱回流8 h,室溫下攪拌過夜。緩慢滴加1.2 mol/L氫氧化鈉的D2O(0.20 mmol)溶液,過濾沉淀,乙醚洗滌,濾液除去溶劑后得到0.49 g淡黃色油狀液體化合物3,產(chǎn)率47%。

(3) 化合物4的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法合成化合物4。將化合物3(0.67 g, 8.22 mmol)、 DMAP(0.10 g, 0.82 mmol)和TEA(3.30 g, 32.80 mmol)溶于CH2Cl2(10.0 mL)中,在0 ℃下滴加TsCl(3.84 g,20.22 mmol)的CH2Cl2(30.0 mL)溶液,反應(yīng)液升至室溫?cái)嚢?4 h,加飽和NaCl溶液(20.0 mL)淬滅反應(yīng),CH2Cl2(2×20.0 mL)萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,過濾除去溶劑后得到白色固體,在90 ℃下用乙醇重結(jié)晶,得到化合物4:白色固體1.34 g,產(chǎn)率42%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.3 Hz, 4H), 7.35(d,J=8.0 Hz, 4H), 2.46(s, 6H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 145.09, 132.62, 129.98, 127.88, 21.66; ESI-MSm/z: Calcd for C17H14D6O6NaS2{[M+Na]+} 413.10, found 413.38。

(4) 化合物5的合成

將化合物4(0.67 g, 1.70 mmol)溶于CH3CN(8.0 mL)中,滴加TBAF(3.0 mL),加熱至90 ℃反應(yīng)2 h,除去溶劑后,利用硅膠柱層析(正己烷 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V)分離純化得到0.20 g化合物5:無色透明液體,產(chǎn)率50%,1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.82～7.77(m, 2H), 7.36(d,J=7.6 Hz, 2H), 2.45(s, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 144.99, 132.86(d,JC,F=3.02 Hz), 129.95, 127.89, 78.8(m,JC,D=24.16 Hz), 65.51(m,JC,D=6.04 Hz), 29.05(quint,JC,D=19.63 Hz), 21.64;19F NMR(376 MHz, CDCl3)δ: -223.29; GC-MSm/z: Calcd for C7H7D6FO3S 238.09, found 238.1。

(5) 化合物7的合成

將化合物5(0.24 g, 1.01 mmol)、化合物6(0.31g, 0.82 mmol)、 TEA(0.8 mL)溶于30.0 mL甲苯中,在115 ℃下反應(yīng)4 h,除去溶劑后通過柱層析(乙醚 ∶正己烷 ∶三乙胺=10.0 ∶7.0 ∶0.1,V∶V∶V)分離純化得到0.19 g化合物7:白色固體,產(chǎn)率53%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.57(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.00(d,J=8.1 Hz, 2H), 3.66(d,J=3.9 Hz, 1H), 3.49(s, 4H), 3.01～2.73(m, 2H), 2.52(t,J=10.9 Hz, 1H), 2.15～1.91(m, 2H), 1.78～1.57(m, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 171.76, 143.03, 136.88, 129.49, 91.02, 63.12, 61.32, 52.67, 50.97, 33.89, 33.86, 26.03, 25.93;19F NMR(376 MHz, CDCl3)δ: -222.84; ESI-MSm/z: Calcd for C18H18D6FINO2{[M+H]+} 438.12, found 438.39。

(6) 化合物8的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道的方法合成化合物8。在0 ℃下,向化合物3(0.50 g, 6.00 mmol)的CH2Cl2(3.0 mL)溶液滴加TsCl(1.26 g, 6.60 mmol)和吡啶(0.5 mL, 6.60 mmol)的CH2Cl2(3.0 mL)溶液,反應(yīng)液升至室溫?cái)嚢? h,加飽和NaCl溶液(30.0 mL)淬滅反應(yīng),CH2Cl2(3×30.0 mL)萃取,有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥,過濾除去溶劑后通過硅膠柱層析(正己烷 ∶乙酸乙酯=50 ∶50,V∶V)純化,得到0.75 g化合物8:無色透明油狀液體,產(chǎn)率53%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33(d,J=8.0 Hz, 2H), 2.61(dd,J=7.9 Hz, 4.4 Hz, 1H), 2.41(s, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 144.98, 132.78, 129.95, 127.80, 67.03(quint.,JC,D=23.2 Hz), 57.28(quint.,JC,D=22.1 Hz), 32.52(quint.,JC,D=19.5 Hz), 21.60; ESI-MSm/z: Calcd for C10H9D6O4S {[M+H]+}237.11, found 237.06。

(7) 化合物9的合成

將化合物6(0.07 g, 0.20 mmol)、化合物8(0.04 g, 0.15 mmol)、 TEA(15 μL)溶于CH3CN(3.0 mL)中,于80 ℃加熱回流4 h,除去溶劑后,加CH2Cl2(5.0 mL)溶解殘余物,再用5%氫氧化鈉(5.0 mL)洗滌,收集有機(jī)相,除去溶劑后干燥得到0.05 g化合物9:淡黃色油狀液體,產(chǎn)率69%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.55(d,J=8.3 Hz, 2H), 6.96(d,J=6.5 Hz, 2H), 4.73(s, 1H), 3.61(d,J=17.8 Hz, 2H), 3.49(dd,J=3.4 Hz, 1.6 Hz, 3H), 2.97(dd,J=12.9, 5.0 Hz, 1H), 2.89(s, 1H), 2.51(t,J=12.7 Hz, 1H), 2.17～1.98(m, 2H), 1.78～1.57(m, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 172.08, 142.28, 136.98, 129.46, 91.31, 64.65, 59.32, 52.98, 51.39, 33.87, 33.61, 26.36, 24.91; ESI-MSm/z: Calcd for C18H19D6INO3{[M+H]+} 436.13, found 436.43。

(8) 化合物10的合成

將化合物9(0.05 mg, 0.10 mmol)溶解在CH2Cl2(0.5 mL)中,加入甲基磺酸酐(0.04 g, 0.23 mmol)。攪拌24 h后,用高效液相色譜監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完全后加入2.0 mL乙醚沉淀,除去分離出的懸濁液,殘余物用1.0 mL的CH2Cl2溶解,再次加入乙醚,重復(fù)洗滌3次。將殘余物真空干燥,得到0.04 g甲磺酸鹽前體化合物10:白色固體,產(chǎn)率72%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.77(s, 1H), 7.64(d,J=7.9 Hz, 2H), 6.96(d,J=8.0 Hz, 2H), 4.32(s, 2H), 3.51～3.36(m, 4H), 3.17(s, 3H), 3.08(d,J=6.3 Hz, 1H), 2.86(s, 4H), 2.59(s, 1H), 2.44(s, 1H), 2.28～2.07(m, 2H), 1.96(d,J=14.7 Hz, 1H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 173.99, 137.84, 137.78, 129.45, 93.29, 63.60, 62.24, 52.68, 49.06, 39.39, 37.24, 34.16, 31.84, 24.47, 23.56; ESI-MSm/z: Calcd for C19H20D6INO5S {[M+H]+} 514.10, found 514.29。標(biāo)記前體化合物10的高效液相色譜和質(zhì)譜如圖3所示。根據(jù)圖4中標(biāo)記前體化合物10的核磁共振氫譜所知,δ值為8.77(s,1H), 3.17(s, 3H)處的信號(hào)峰為甲磺酸鹽上的氫;圖5中核磁共振碳譜δ值為39.39處的信號(hào)峰對(duì)應(yīng)甲磺酸鹽上的碳。

m/z

δ

δ

1.3 探針[18F]7的放射性合成

探針[18F]7的放射性合成路線如圖6所示?；匦铀倨鳟a(chǎn)生18F離子經(jīng)氮?dú)鈧鬏敱晃皆陉庪x子交換柱(QMA)上,用1.1 mL淋洗液(含15 mg K222和3 mg K2CO3的10%乙腈水溶液)洗脫18F離子至反應(yīng)管中,乙腈干燥2次后,加入4 mg標(biāo)記前體化合物10(溶解于100 μL CH3CN和1.0 mL TAA中),100 ℃反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后采用半制備型HPLC分離,液相條件為甲醇∶水∶三乙胺=75.0 ∶25.0 ∶0.1(V∶V∶V),接峰組分用水稀釋,通過C18柱吸附標(biāo)記探針[18F]7,洗去多余的18F離子,再用2.0 mL乙醇淋洗進(jìn)西林瓶,即得純化后探針[18F]7的乙醇溶液。取探針[18F]7(10 μCi, 5 μL)與化合物7(5 μL)共進(jìn)樣,用配備放射性檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器的HPLC分析其結(jié)構(gòu)和放射性化學(xué)純度。

圖6 探針[18F]7的放射合成路線

1.4 探針[18F]7的體外穩(wěn)定性測(cè)定

采用放射性HPLC測(cè)定體外穩(wěn)定性。取適量探針分別與PBS(pH 7.4)和FBS在37 ℃下孵育不同時(shí)間(0, 1, 2, 4, 6 h)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣稀釋至濃度為100 μCi/mL,取10 μL進(jìn)樣,利用放射性HPLC分析放射性化學(xué)純度。HPLC條件為甲醇 ∶水 ∶三氟乙酸=40.0 ∶60.0 ∶0.1(V∶V∶V)。

1.5 探針[18F]7的脂水分配系數(shù)測(cè)定

取探針(1 μCi)加入到含有正辛醇(3.0 mL)和PBS(3.0 mL, pH 7.4)的離心管中,室溫下渦旋振蕩5 min,離心(4000 r/min,5 min)后分別取正辛醇(1.0 mL)和PBS(1.0 mL)于γ計(jì)數(shù)管中測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(CPM),取1.0 mL正辛醇相加入到含正辛醇(2.0 mL)和PBS(3.0 mL)的離心管中。重復(fù)上述操作5次,根據(jù)公式LogP=Log(CPM正辛醇/CPMPBS)計(jì)算得到探針的脂水分配系數(shù),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)記前體化合物10的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

標(biāo)記前體化合物10通過質(zhì)譜和高效液相色譜進(jìn)行初步表征,結(jié)果如圖3所示,HPLC保留時(shí)間為16 min,純度大于99%,質(zhì)譜峰分子量514.29對(duì)應(yīng){[M+H]+}的分子離子峰。通過1H NMR和13C NMR進(jìn)一步證明了標(biāo)記前體化合物10的結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖4～5所示。

2.2 探針[18F]7的放射性化學(xué)分析

采用前體化合物10進(jìn)行一步法18F標(biāo)記,經(jīng)過半制備和C18純化得到探針[18F]7。探針[18F]7與化合物7共進(jìn)樣,結(jié)果如圖7所示,探針[18F]7的保留時(shí)間與非放射性對(duì)照化合物7保留時(shí)間一致且探針結(jié)構(gòu)正確,放射性化學(xué)性純度大于99%,放射性化學(xué)產(chǎn)率為5%。該標(biāo)記方法可應(yīng)用于市售的18F多功能合成模塊進(jìn)行一步法自動(dòng)化標(biāo)記,有利于臨床上放射性藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用。

Time/min

2.3 探針[18F]7的體外穩(wěn)定性

良好的探針體外穩(wěn)定性有利于體內(nèi)生物學(xué)活性的研究,探針[18F]7體外穩(wěn)定性結(jié)果如圖8所示,探針[18F]7在PBS和FBS中6 h內(nèi)僅有1個(gè)明顯的色譜主產(chǎn)品峰,未見其它放射性雜質(zhì),表明探針[18F]7在PBS和FBS中有較好的穩(wěn)定性,有利于探針進(jìn)一步的體內(nèi)生物學(xué)研究。

Time/min

2.4 探針[18F]7的脂水分配系數(shù)

腦顯像探針的親脂性是保證藥物透過血腦屏障的重要因素之一,研究表明,脂水分配系數(shù)系數(shù)在1.0～3.5之間[15],易于透過血腦屏障。本文研制的探針[18F]7的LogP值為2.15±0.17,表明探針[18F]7親酯性較好,有透過血腦屏障的潛力。

本文采用氘代合成策略實(shí)現(xiàn)了一種DAT探針[18F]FP-CIT的氘代結(jié)構(gòu)[18F]FP-CIT-d6([18F]7)的合成。首先合成非放射性對(duì)照化合物7和標(biāo)記前體化合物10,再利用18F親核取代法標(biāo)記制備了高純度的放射性探針[18F]7。體外理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明:探針具有較好的體外穩(wěn)定性和親酯性。簡(jiǎn)便的標(biāo)記方法和良好的理化性質(zhì),為探針[18F]7進(jìn)一步的體內(nèi)生物活性研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。