陳正軍, 丁尚麗, 呂佳佳, 楊明焱, 高 杰, 李洪玉, 羅俊俊, 袁澤利

(遵義醫(yī)科大學 藥學院,教育部基礎(chǔ)藥理重點實驗室,貴州省生物催化與手性藥物重點實驗室,貴州省醫(yī)用光學診療技術(shù)與創(chuàng)新藥物國際科技合作基地,貴州 遵義 563000)

腫瘤微環(huán)境中原癌基因在某些誘發(fā)因素作用下表達,生成結(jié)構(gòu)和功能異常的血管和淋巴管,并造成以缺氧和酸中毒為特點的新陳代謝環(huán)境[1]。腫瘤在缺氧條件下,缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)將被激活并增強有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(organic anion transporting polypeptides, OATPs)的表達,OATPs在大多數(shù)類型的癌細胞中過表達,并介導兩親性藥物或激素,甚至促進外源性底物的攝取[2]。一些兩親性分子成為缺氧條件下OATPs表達的靶向腫瘤診療試劑[3-4]。因此,設計合成具有腫瘤靶向的兩親性分子成為腫瘤診療劑開發(fā)的熱門研究方向之一。

七甲川花菁類化合物是一類兩端氮雜環(huán)中間含有多個次甲基長共軛鏈的花菁小分子,通過分子設計,已經(jīng)有眾多的兩性花菁分子被設計合成[5-7]。這類分子的吸收和發(fā)射波長處于近紅外區(qū),且摩爾吸光系數(shù)大,可有效避免生物檢測中待測物熒光背景的干擾,使其在醫(yī)學成像領(lǐng)域具有潛在的應用價值[8-10]。因而七甲川花菁類化合物已經(jīng)被廣泛用于蛋白與核酸標記、動物活體成像以及臨床造影等的生物醫(yī)藥研究[11-13]。其中,代表性分子吲哚菁綠(indocyanine green, ICG),已經(jīng)在臨床上廣泛用于心臟、肝臟和眼底血管顯影等。隨后研究發(fā)現(xiàn),ICG在含鹽的緩沖溶液中因易聚集導致熒光強度減弱,且該分子光穩(wěn)定性差而影響臨床深入應用[14-16]。為獲得生理條件下光學性能優(yōu)異的吲哚花箐染料,研究者利用ICG分子中多甲川鏈設計,在鏈中引入環(huán)烴基團,得到了穩(wěn)定性顯著提高的吲哚花箐染料IR780(圖1)。研究表明,由于環(huán)烴基使分子的剛性和空間位阻增大,不利于單線態(tài)氧的進攻,提高了IR780的光穩(wěn)定性[15-17]。然而,該分子在含鹽緩沖液中溶解度差,限制了其在生物醫(yī)藥應用研究。

圖1 ICG和IR780的結(jié)構(gòu)

為獲得水溶性好的IR780吲哚花箐染料,本文基于IR780母核,用季銨鹽在吲哚上進行取代,增強其水溶性;用芳環(huán)取代環(huán)烴基氯,增強分子剛性和空間位置,得到3個新型水溶性吲哚花箐染料分子(圖2),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HR-MS表征,并對中間體(3)及目標染料(4～6)的光譜性能進行了初步研究。

圖2 化合物4、 5和6的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilengt 400DDR型核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標,CD3OD為溶劑);TU-1901型紫外-可見吸收光譜儀;Carry Eclipse型熒光光譜儀;Aglient 6550qtof &Thermo Fisher-QE型高分辨質(zhì)譜儀。

環(huán)己酮、芳基硼酸、N,N-二甲基甲酰胺和三溴丙基三甲基溴化銨均購自上海薩恩化學技術(shù)有限公司;2,3,3-三甲基-3H-吲哚、柱層析硅膠和氧化鋁均購自上海泰坦科技股份有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 吲哚花箐染料(4～6)的合成

(1) 3-(羥基亞甲基)-2-氯環(huán)己-1-烯(1)的合成

參照文獻[18]的方法合成中間體(1)。

(2) 2,3,3-三甲基-1-[3-(三甲基-氨基)-丙基]-3H-吲哚(2)的合成

參照文獻[19]的方法合成化合物(2)。將2,3,3-三甲基-3H-吲哚(5.00g, 0.031 mol)和3-溴丙基三甲基溴化銨(12.29 g, 0.047 mol)置于含30 mL無水乙腈的100 mL圓底燒瓶,回流12 h后減壓除去溶劑,殘留液中加入20 mL去離子水,用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取,取水層于冷凍干燥機中凍干后直接使用。

(3) 吲哚花箐染料中間體(3)的合成

將化合物(1)(2.50 g, 14.00 mmol)、化合物(2)(500.00 mg, 1.47 mmol)及無水乙酸鈉(500.00 mg, 6.10 mmol)置于含30 mL乙酸酐的100 mL圓底燒瓶,通氮氣保護,于90 ℃條件下反應2 h后,減壓除去溶劑,殘留物過氧化鋁柱,并用洗脫劑CH2Cl2和CH3OH(100 ∶1～100 ∶20,V∶V)進行洗脫得綠色固體,收率64%;1H NMR(400 MHz, DMSO)δ: 8.30(d,J=13.6 Hz, 2H), 7.67(m, 4H), 7.46(dd,J=13.9 Hz, 6.5 Hz, 2H), 7.32(m, 2H), 6.43(t,J=15.3 Hz, 15.3 Hz, 3H), 4.34(s, 4H), 3.78(s, 4H), 3.14(m, 18H), 2.80(s, 4H), 2.16(s, 4H), 1.84(s, 2H), 1.70(s, 12H);13C NMR(101 MHz, DMSO)δ: 172.66, 143.86, 142.28, 141.47, 129.09, 127.38, 125.69, 123.02, 112.11, 102.42, 62.60, 52.77, 49.49, 41.44, 27.99, 26.58, 21.33, 20.93; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C42H60ClN4{[M]+}218.4830, Found 218.4850。

(4) 吲哚花箐染料(4～6)的合成

在50 mL圓底燒瓶中,依次加入3(240.00 mg, 0.27 mmol)、碳酸銫(175.94 mg, 0.54 mmol)、四(三苯基膦)鈀(46.80 mg, 0.041 mmol)及2倍當量的三苯胺硼酸溶解于10 mL 20%的乙醇,氮氣保護下,80 ℃反應5 h后,減壓除去溶劑,過氧化鋁柱層析柱,并用洗脫劑CH2Cl2和CH3OH(100 ∶1～100 ∶20,V∶V)進行洗脫,得到綠色固體4,收率27%;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.24(d,J=14.0 Hz, 2H), 7.53(d,J=7.3 Hz, 4H), 7.49～7.33(m, 8H), 7.27(s, 4H), 7.15(dd,J=24.8 Hz, 14.2 Hz, 4H), 6.88(d,J=8.1 Hz, 1H), 6.77～6.67(m, 1H), 6.26(d,J=14.0 Hz, 2H), 4.27(s, 4H), 3.48(d,J=6.3 Hz, 4H), 3.21(s, 18H), 2.73(s, 4H), 2.32(s, 4H), 2.03～1.97(m, 2H), 1.76(s, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 170.9(s), 146.7(s), 141.1(s), 140.8(s), 139.9(s), 139.6(s), 131.6(s), 128.4(d,J=8.9 Hz), 127.7(s), 123.8(s), 123.1(d,J=12.4 Hz), 122.4(s), 121.3(s), 116.5(s), 109.5(s), 98.4(s), 62.2(s), 57.0(s), 51.5(s), 48.0(s), 26.4(s), 24.8(s), 20.2(s), 19.9(s); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C60H74ClN5{[M]+}288.1976, Found 288.1993。

用類似方法合成5,收率23%;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.22(d,J=14.1 Hz, 2H), 7.96(s, 1H), 7.51(d,J=7.4 Hz, 2H), 7.45～7.41(m, 4H), 7.28～7.21(m, 6H), 7.08(t,J=6.3 Hz, 3H), 7.04(dd,J=7.5 Hz, 4.0 Hz, 2H), 6.24(d,J=14.1 Hz, 2H), 4.13～4.08(m, 4H), 3.65(t,J=5.8 Hz, 4H), 3.15(s, 18H), 2.71(t,J=5.9 Hz, 4H), 2.29(d,J=7.0 Hz, 4H), 1.90(dd,J=11.9 Hz, 6.0 Hz, 2H), 1.74(s, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 170.9(s), 141.1(s), 140.8(s), 139.8(d,J=8.7 Hz), 128.3(s), 127.7(s), 127.4(s), 126.7(s), 123.8(s), 123.6(s), 123.0(s), 121.3(s), 121.0(s), 116.5(s), 112.7(s), 109.5(s), 109.3(s), 98.4(s), 63.5(s), 57.0(s), 51.4(s), 48.0(s), 26.4(s), 24.8(s), 14.2(s); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C56H69ClN4{[M]+}265.8502, Found 265.8517。

用類似方法合成6,收率15%;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δ: 8.22(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.52(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.44(s, 2H), 7.37(d,J=3.8 Hz, 4H), 7.34(s, 2H), 7.32(s, 1H), 7.30(s, 1H), 7.23(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.21～7.14(m, 2H), 6.29(d,J=14.0 Hz, 2H), 4.22(t,J=7.2 Hz, 4H), 3.32～3.28(m, 4H), 3.24(s, 2H), 3.19(s, 18H), 2.81(t,J=5.5 Hz, 4H), 2.27(s, 4H), 2.09～2.01(m, 2H), 1.19(s, 12H);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δ: 172.0(s), 162.9(s), 148.7(s), 141.8(s), 140.9(s), 140.6(s), 134.4(dd,J=10.7 Hz, 3.3 Hz), 132.0(s), 129.4(d,J=4.9 Hz), 128.7(s), 128.4(s), 127.7(s), 124.7(s), 122.0(s), 110.2(s), 99.8(s), 63.0(s), 52.3(s), 48.6(s), 40.2(s), 29.3(d,J=8.2 Hz), 26.6(s), 24.4(s), 20.7(s); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C54H70ClN5O2{[M]+}273.5171, Found 273.5187。

1.3 光學性質(zhì)研究實驗

精密稱量吲哚花箐分子(4～6),用PBS(pH=7.40, 10 mM)緩沖液配制成1 mM的儲備液,用時再以PBS緩沖液稀釋至5 μM的待測液,測定其吸收光譜和熒光發(fā)射光譜(電壓為中等,狹縫寬度均為5 nm)。單線態(tài)氧收率(ΦΔ)的測定以ICG為標準(0.80%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標吲哚花箐分子的設計合成

相較于ICG的多甲川鏈,IR780通過引入環(huán)烴基,增加了分子剛性和空間位阻,使單線態(tài)氧不易進攻,光穩(wěn)定性得以改善[14-16]。本課題組前期將IR780的環(huán)烴基氯用柔性鏈取代,吸電子基團的引入提高了IR780的光穩(wěn)定性,并能長時間在活體腫瘤組織近紅外熒光成像[20]。為獲得在含鹽緩沖液中溶解性好的水溶性吲哚花箐染料,本文一方面沿用了課題組的成功做法,用吸電子的共軛芳環(huán)取代環(huán)烴基氯來增加分子的剛性和空間位阻。另一方面在吲哚N上引入季胺鹽以增強分子的水溶性,設計合成了3個結(jié)構(gòu)新穎的水溶性吲哚花箐染料,并用1H NMR、13C NMR和HR-MS對3個目標分子的結(jié)構(gòu)進行了表征,確證為預期目標分子結(jié)構(gòu)。

2.2 光譜性質(zhì)

(1) 光譜性能

中間體3及3個吲哚花箐染料分子的吸收光譜和熒光光譜如圖3所示。由圖3(a)可以看出,合成得到的3個吲哚花箐染料分子的最大吸收峰均在752 nm,較中間體3藍移26 nm,這可能是由于芳環(huán)的引入,使分子剛性增強、空間位阻變大,整個分子大π鍵的電子云流動性減弱,增加了分子激化所需要的能量,吸收光量子發(fā)生了藍移,產(chǎn)生淺色效應[14]。同時,3個吲哚花箐染料分子摩爾吸光吸收分別為:16.64×104L·mol-1·cm-1(4)、 8.70×104L·mol-1·cm-1(5)和14.14×104L·mol-1·cm-1(6),表明3個目標染料分子在最大波長均具有強的光吸收性能。從結(jié)構(gòu)來看,4和6的摩爾吸光系數(shù)顯著強于5,這是由于4和6中基團的吸電子效應強于5[21]。

λ/nm

由圖3(b)可以看出,中間體3的熒光發(fā)射峰位于800 nm,經(jīng)修飾后分別藍移至781 nm(4)、 775 nm(5)和778 nm(6),均分別藍移了12 nm。從結(jié)構(gòu)來看,4和6是由于1個芳環(huán)與環(huán)烴基偶聯(lián),其熒光量子效率差別不大,5因由剛性和位阻較大的蒽環(huán)直接相連,吸電子的蒽環(huán)與母核共軛結(jié)構(gòu)不在1個平面,使整個分子的剛性減弱,不利于核外電子以光的形式釋放能量,使其熒光發(fā)射強度顯著降低[22]。4和6在近紅外區(qū)均具有較強的熒光發(fā)射強度,可作為新型光敏劑的熒光成像應用于腫瘤的診斷或介導手術(shù)切除腫瘤[23]。

(2) 單線態(tài)氧收率的測定

本實驗以1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為單線態(tài)氧捕獲劑,用ICG為標準,分別測定中間體3、 IR780及3個吲哚花箐染料分子在760 nm激光燈照射下和羅丹明B(RB)在532 nm激光燈照射下分解DPBF性能,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,中間體3、 IR780和3個吲哚花箐染料分子的單線態(tài)氧收率分別為0.42%(3)、 0.45%(IR780)、 0.67%(4)、 0.37%(5)和0.52%(6),表明在環(huán)烴基中位引入芳環(huán)可提高其單線態(tài)氧收率,并且引入給電子能力較強的三苯胺基團可以提高該類化合物的單線態(tài)氧收率。高的單線態(tài)氧收率是光敏劑作為光動力治療的主要指標,4和6具有的高單線態(tài)氧產(chǎn)生率,可作為光動力治療的新型潛在光敏劑[15]。

Time/s

本文通過引入剛性結(jié)構(gòu)、增強空間位阻及柔性季胺鹽增強水溶性,設計合成了3個新型水溶性吲哚花箐染料分子(4～6),并對其進行了結(jié)構(gòu)表征和光譜性能研究。結(jié)果表明:3個吲哚花箐染料分子均具有良好的水溶性和處于近紅外區(qū)的吸收和發(fā)射性能,4和6因其高的單線態(tài)氧收率和強的熒光強度,可作為新型光敏劑應用于腫瘤光動力治療和熒光成像診斷研究,為開發(fā)具有實際應用價值的吲哚花箐染料提供了一定的參考價值。