李倫，段建，幸文利

遂寧市中心醫(yī)院腦血管疾病科，四川遂寧 629000

動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）具有高病死率、高致殘率等特點(diǎn)，即使成功施行顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞術(shù)，仍有部分患者尤其是老年患者會出現(xiàn)腫瘤破裂再出血，甚至死亡［1-2］。因此，探索能評估老年動脈瘤性SAH患者預(yù)后的相關(guān)因素對于臨床確定防治措施及提高患者生存率具有重要意義。近年來新發(fā)現(xiàn)的微小RNA（miRNA）可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，參與腦梗死、SAH等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展［3-4］。miR-124是成人及胚胎腦組織中表達(dá)最豐富的miRNA，可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化等途徑參與腦缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展［5］。miR-27a-3p主要分布于消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)，其表達(dá)在高血壓腦出血患者中呈下降趨勢［6］。但目前關(guān)于血清miR-124、miR-27a-3p水平與老年SAH經(jīng)顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞術(shù)治療患者預(yù)后的關(guān)系鮮見報道。為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合動脈瘤性SAH診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，結(jié)合顱腦CT及MRI檢查確診；②年齡≥60歲；③成功施行顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性感染；②合并嚴(yán)重心肝腎疾??；③存在出血傾向及凝血機(jī)制異常，或近期服用抗血小板藥及抗凝藥；④有心腦血管意外家族史；⑤顱內(nèi)血腫明顯需行開顱手術(shù)。選取2019年1月—2022年6月我院收治并符合上述標(biāo)準(zhǔn)的老年動脈瘤性SAH顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞術(shù)后患者200例，根據(jù)其術(shù)后28 d生存情況［8］分為生存組182例和死亡組18例。生存組男92例、女90例，年齡（70.51 ± 4.46）歲，破裂動脈瘤直徑：≤5 mm 70例、＞5～15 mm 98例、＞15～25 mm 14例，發(fā)病至入院時間：≤6 h 136例，＞6～24 h 46例，F(xiàn)isher分級：1級29例、2級51例、3級84例、4級18例，Hunt-Hess分級：Ⅰ級35例、Ⅱ級56例、Ⅲ級61例、Ⅳ級30例，合并高脂血癥28例、糖尿病20例、高血壓26例，吸煙史56例。死亡組男9例、女9例，年齡（71.13 ± 4.05）歲，破裂動脈瘤直徑：≤5 mm 7例、＞5～15 mm 10例、＞15～25 mm 1例，發(fā)病至入院時間：≤6 h 11例，＞6～24 h 7例，F(xiàn)isher分級：1級3例、2級5例、3級8例、4級2例，Hunt-Hess分級：Ⅰ級4例、Ⅱ級6例、Ⅲ級7例、Ⅳ級1例，合并高脂血癥3例、糖尿病4例、高血壓3例，吸煙史6例。兩組上述資料均具有可比性（P均＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 血清miR-124、miR-27a-3p檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。兩組于術(shù)前及術(shù)后3、7 d抽取外周靜脈血3 mL，室溫靜置30 min，待血樣凝結(jié)后，1 200 r/min離心15 min，取上清液。滴加焦炭酸二乙酯，-20 ℃冰箱保存待測。滴加TRIzol試劑提取總RNA，通過NanoDROP?ND-1000測定RNA濃度及純度合格。取1 μL RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，共40個循環(huán)［9］。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-124、miR-27a-3p相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，兩組間比較采用t檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料采用Ridit檢驗。繪制術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p預(yù)測患者死亡的受試者工作特征（ROC）曲線，計算曲線下面積（AUC）、截斷值、敏感度及特異度，并分析AUC較大時的血清miR-124、miR-27a-3p聯(lián)合預(yù)測患者死亡的價值。根據(jù)術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p預(yù)測患者死亡的截斷值，繪制不同血清miR-124、miR-27a-3p水平患者的生存曲線，并比較其28 d生存率。以患者是否死亡為因變量，以術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p為自變量，進(jìn)行影響患者死亡的多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時間點(diǎn)血清miR-124、miR-27a-3p水平比較 與術(shù)前比較，兩組術(shù)后3、7 d血清miR-124水平均升高、miR-27a-3p水平均降低，且死亡組變化更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組不同時間點(diǎn)血清miR-124、miR-27a-3p水平比較（）

表1 兩組不同時間點(diǎn)血清miR-124、miR-27a-3p水平比較（）

注：與同組術(shù)前比較，*P＜0.05；與死亡組同時間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

n miR-124組別生存組術(shù)前術(shù)后3 d術(shù)后7 d死亡組術(shù)前術(shù)后3 d術(shù)后7 d miR-27a-3p 182 6.67 ± 2.01 7.58 ± 2.27*#8.51 ± 2.55*#0.11 ± 0.04 0.09 ± 0.03*#0.07 ± 0.02*#18 0.12 ± 0.03 0.06 ± 0.01*0.05 ± 0.01*6.48 ± 2.22 9.85 ± 2.96*11.06 ± 3.32*

2.2 血清miR-124、miR-27a-3p預(yù)測患者死亡的ROC曲線分析結(jié)果 術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p預(yù)測患者死亡的ROC曲線分析結(jié)果見表2及OSID碼圖1、2。術(shù)后3 d血清miR-124、miR-27a-3p預(yù)測患者死亡的AUC均小于術(shù)后7 d，術(shù)后7 d血清miR-124、miR-27a-3p聯(lián)合預(yù)測患者死亡的AUC為0.906（95%CI：0.834～0.954），敏感度及特異度分別為94.44%、76.67%，見OSID碼圖3。

表2 術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p預(yù)測患者死亡的ROC曲線分析結(jié)果

2.3 不同血清miR-124、miR-27a-3p水平患者的28 d生存率比較 以表2中ROC曲線分析結(jié)果的截斷值進(jìn)行分組，術(shù)后3、7 d血清miR-124分別＞9.47、＞10.31者為高?；颊撸╪=57、55），其余為低?；颊撸╪=51、53）。術(shù)后3、7 d血清miR-27a-3p分別≤0.07、≤0.06者為高?；颊撸╪=52、58），其余為低?；颊撸╪=56、50）。生存曲線分析結(jié)果顯示，術(shù)后3 d miR-124、miR-27a-3p高?；颊?8 d生存率與低?；颊弑容^差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；術(shù)后7 d miR-124、miR-27a-3p高?；颊?8 d生存率均低于低?；颊撸≒均＜0.05）。見OSID碼圖4～7。

2.4 術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p與患者死亡的關(guān)系 術(shù)后3、7 d miR-124水平升高、miR-27a-3p水平降低均是患者死亡的獨(dú)立影響因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 術(shù)后3、7 d血清miR-124、miR-27a-3p影響患者死亡的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，SAH發(fā)病率占腦血管病的12%～20%，其中80%左右為腦動脈瘤破裂所致［10］。對于老年動脈瘤性SAH患者而言，顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞術(shù)是最為有效的治療手段，然而動脈瘤所致原發(fā)性腦損傷及繼發(fā)性病理生理改變會對患者的預(yù)后產(chǎn)生消極影響。目前國內(nèi)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)對于老年動脈瘤性SAH的鑒別診斷多依賴于影像學(xué)手段，雖具有一定價值，但缺乏客觀有效的評價指標(biāo)，且無法判斷患者預(yù)后恢復(fù)情況，故尋找有效的生物標(biāo)志物對于評估老年動脈瘤性SAH的預(yù)后尤為重要。

miRNA屬于高度保守的非編碼小RNA，可通過促進(jìn)mRNA降解、抑制mRNA翻譯等途徑參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，基因表達(dá)調(diào)控多發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)；新近研究顯示，血清、腦脊液等細(xì)胞外液中存在穩(wěn)定miRNA，并發(fā)現(xiàn)腦出血患者外周血與病灶組織存在幾乎平行的miRNA表達(dá)譜［11］。miR-124屬于腦組織特異性miRNA，最早發(fā)現(xiàn)于小鼠腦組織，隨后發(fā)現(xiàn)其在果蠅、非洲爪蟾、人體大腦中均呈動態(tài)變化，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、損傷、修復(fù)等生理病理過程中起著重要作用，有可能成為藥物治療的作用靶點(diǎn)之一［12］。近年來越來越多的研究表明，miR-124水平變化與缺血性腦損傷有關(guān)［13-14］。體外實驗發(fā)現(xiàn)，miR-124在大鼠腦組織缺血半影區(qū)的表達(dá)明顯高于非缺血區(qū)，考慮原因與其可抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)［15］。馮錦麗等［16］認(rèn)為，血清miR-124與急性缺血性腦梗死患者梗死面積密切相關(guān)。楊劍宏［17］研究指出，血清miR-124在急性腦出血患者中呈高表達(dá)，特別是預(yù)后不良患者。但目前尚未見血清miR-124與動脈瘤性SAH、高血壓腦出血等缺血性腦損傷疾病患者預(yù)后的關(guān)系。故本研究嘗試分析其與動脈瘤性SAH術(shù)后患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示生存組術(shù)后3、7 d的血清miR-124水平均低于死亡組，提示血清miR-124水平升高可能與患者預(yù)后不良有關(guān)。推測原因，可能是miR-124可調(diào)節(jié)下游靶基因Rho蛋白二磷酸鳥苷解離抑制因子（RhoGDIA），抑制血管內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖，損傷血管壁，引發(fā)腦出血；同時miR-124可下調(diào)神經(jīng)元RhoG表達(dá)，中斷ELMO/Dock180/Rac1信號通路，阻礙神經(jīng)突向外生長，減少軸突及樹突分支，增加腦出血量，加劇神經(jīng)功能損傷，導(dǎo)致疾病惡化，甚至死亡［18］。

miR-27a是基因間miRNA，在多種細(xì)胞及血管豐富的組織中均有表達(dá)，可參與血管生成、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝等病理生理過程。既往關(guān)于miR-27a的研究多集中于腫瘤，近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a可通過上調(diào)腦組織Toll樣受體4（TLR4）、p38蛋白磷酸化、釋放炎癥因子等，加劇腦缺血小鼠的腦組織損傷［19］。張秀萍等［20］指出，miR-27a可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因、凋亡基因參與腦缺血損傷的病理生理過程。miR-27a-3p是miR-27a的剪切成熟體之一，包含B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2基因Bcl-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（BCLAF1）及Bcl-2結(jié)合成分3（BBC3）等靶基因，且兩者均與凋亡基因Bcl-2密切相關(guān)。值得注意的是，腦出血疾病會增加Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而引起繼發(fā)性腦損傷，若未及時診治可加劇疾病進(jìn)展，導(dǎo)致患者死亡［21］。但miR-27a-3p能否通過靶基因調(diào)控Bcl-2表達(dá)尚不得知。本研究結(jié)果顯示，生存組術(shù)后3、7 d的血清miR-27a-3p水平均低高于死亡組，提示血清miR-27a-3p水平降低可能與患者預(yù)后不良有關(guān)。分析原因，可能是miR-27a-3p下調(diào)可增加BCLAF1、BBC3等靶基因表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2基因的促凋亡作用，加劇動脈瘤性SAH術(shù)后患者的繼發(fā)性腦損傷，從而造成病情惡化［22］。

本研究進(jìn)一步采取ROC及生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-124、miR-27a-3p對老年動脈瘤性SAH術(shù)后患者死亡的預(yù)測價值較高，特別是術(shù)后7 d的血清miR-124和miR-27a-3p，二者聯(lián)合預(yù)測患者死亡的AUC為0.906，高于兩項指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測的AUC。本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示，術(shù)后3、7 d miR-124水平升高、miR-27a-3p水平降低是患者死亡的獨(dú)立影響因素。

綜上所述，老年動脈瘤性SAH經(jīng)顱內(nèi)動脈瘤介入栓塞術(shù)患者術(shù)后血清miR-124水平升高、miR-27a-3p水平降低，且死亡患者變化更明顯，二者聯(lián)合檢測有助于評估患者的生存情況。因此，做好老年動脈瘤性SAH術(shù)后miR-124、miR-27a-3p的監(jiān)測工作，對預(yù)測預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療均具有重要意義。