王昱歡，馬曉峰，陳穎，永勝，楊惠

1 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810016；2 青海省心腦血管病?？漆t(yī)院心血管病一科

青藏高原是世界上面積最大的高原，平均海拔高度約4 900 m，長(zhǎng)期居住人口為6 000萬(wàn)～8 000萬(wàn)［1］。隨著時(shí)代發(fā)展，由工作、旅游等原因前往高原短期居住的人口逐年增多，可能表現(xiàn)出高原不適應(yīng)癥［2］。短期旅居者在海拔2 500～3 000 m即可發(fā)生身體不適，如持續(xù)運(yùn)動(dòng)或繼續(xù)登高，則進(jìn)一步引發(fā)肺組織及腦組織損傷［3］。高海拔低氧環(huán)境可誘發(fā)肺部損傷，與通氣/血流比例失調(diào)、化學(xué)感受器變化、水通道及蛋白變化、遺傳基因易感性等直接相關(guān)［4］。從組織細(xì)胞的角度考慮，上述因素直接影響了肺組織的平衡穩(wěn)態(tài)，嚴(yán)重者甚至?xí)鸱谓M織細(xì)胞死亡［5］。當(dāng)細(xì)胞受到缺氧刺激時(shí)，肺組織細(xì)胞的保護(hù)性程序被啟動(dòng)，主要包括細(xì)胞自噬及細(xì)胞凋亡，通過(guò)細(xì)胞自噬可加快細(xì)胞代謝循環(huán)、協(xié)助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境以促進(jìn)細(xì)胞存活，而通過(guò)細(xì)胞凋亡能及時(shí)主動(dòng)清除機(jī)體衰老及異常的細(xì)胞，從而維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)態(tài)［5-6］。盡管細(xì)胞自噬與凋亡在代謝途徑和形態(tài)學(xué)方面有著顯著區(qū)別，但二者之間存在著多層次、多元化的聯(lián)系，如自噬相關(guān)蛋白Beclin-1可與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合，直接調(diào)控細(xì)胞凋亡［7］。此外，自噬相關(guān)基因Atg-5、Atg-11誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可被凋亡因子Bax所抑制［7］。2021年11月—2023年1月，本研究以渭河平原和青藏高原飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，探討高原低氧環(huán)境下小鼠肺組織細(xì)胞的自噬及凋亡情況，為后續(xù)高原低氧暴露誘發(fā)肺臟疾病分子機(jī)制的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠30只，8周齡，體質(zhì)量22～24 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。主要試劑：鼠SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蘇木素、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，全蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；自噬相關(guān)因子Beclin-1、LC3B、p62以及凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，一抗稀釋液、二抗稀釋液、ECL發(fā)光顯色試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)環(huán)境干預(yù)方法 將30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為高原低氧組、對(duì)照組，每組15只。高原低氧組飼養(yǎng)于青海省果洛藏族自治州瑪多縣人民醫(yī)院（平均海拔約4 226 m），對(duì)照組飼養(yǎng)于西安市雁塔區(qū)西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（平均海拔約419 m）。小鼠飼料均為普通標(biāo)準(zhǔn)維持型飼料，飼養(yǎng)溫度26～28 ℃，相對(duì)濕度40%～60%；給予充足的水和鼠糧供小鼠自由采食、飲水，連續(xù)飼養(yǎng)21 d。淘汰咬傷、采食不正常小鼠，每組各取10只采用脊椎脫臼法處死，并迅速采集肺臟組織。

1.3 肺組織自噬體數(shù)量觀察 使用生理鹽水沖洗兩組小鼠肺組織，在預(yù)冷操作臺(tái)上，用手術(shù)刀片切成長(zhǎng)、寬、高約為1 mm的組織塊；2.5%戊二醛液固定24 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，1%鋨酸固定12 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次；梯度濃度乙醇、丙酮脫水，618環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色。采用透射電子顯微鏡觀察肺組織，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的自噬體數(shù)量，取平均值。

1.4 肺組織Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白檢測(cè) ①采用免疫組化法：取兩組小鼠肺組織，10%甲醛溶液固定48 h，自來(lái)水過(guò)夜沖洗；脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)并冷卻至室溫，3%過(guò)氧化氫室溫避光孵育15 min，山羊血清室溫孵育15 min；以兔抗鼠Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2多克隆抗體為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，以健康C57BL/6小鼠血清為一抗空白對(duì)照，37 ℃復(fù)溫45 min；加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育15 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，烤片，光學(xué)顯微鏡鏡檢。每個(gè)樣品選取5張切片，每張免疫組化切片中隨機(jī)選取5個(gè)視野（×200），以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核染成棕黃色定義為陽(yáng)性。使用Image-Pro Plus6.0軟件分析積分光密度值（IOD）并計(jì)算面積（Area），以IOD/Area表示陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)情況。②采用Westen blotting法：取兩組小鼠肺組織，按照全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白中加入上樣緩沖液變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF濾膜上封閉，PVDF濾膜浸泡在10% TBST溶液中，置于搖床上洗膜10 min×5次。分別加入兔抗鼠Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2及內(nèi)參β-actin一抗（1∶ 2 000），4 ℃孵育過(guò)夜；10%TBST沖洗10 min×5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶ 4 000），室溫孵育90 min。10% TBST沖洗10 min×5次，加入ECL顯色液。凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，計(jì)算Beclin-1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax。

1.5 肺組織Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取兩組小鼠肺組織，參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，采用核酸蛋白分析儀測(cè)定 RNA純度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參照SYBR Green試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR檢測(cè)。以 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算Bax mRNA/Bcl-2 mRNA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺組織自噬體數(shù)量比較 高原低氧組與對(duì)照組自噬體數(shù)量分別為（4.80 ± 0.84）、（1.80 ±0.45）個(gè)，兩組比較P＜0.05。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.2 兩組肺組織Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，高原低氧組肺組織Beclin-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)，p62、Bax陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)減弱（P均＜0.05），LC3B陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)表1及OSID碼圖2。

表1 兩組肺組織Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)情況比較（）

表1 兩組肺組織Beclin-1、LC3B、p62、Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)情況比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別高原低氧組對(duì)照組Bcl-2 0.57 ± 0.06*0.19 ± 0.01 n 10 10 Beclin-1 0.71 ± 0.01*0.42 ± 0.02 LC3B 0.37 ± 0.02 0.37± 0.09 p62 0.21 ± 0.03*0.57 ± 0.03 Bax 0.34 ± 0.04*0.76 ± 0.08

2.3 兩組肺組織Beclin-1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax比較 見(jiàn)表2及OSID碼圖3。

表2 兩組肺組織Beclin-1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax比較（）

表2 兩組肺組織Beclin-1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2/Bax比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別高原低氧組對(duì)照組Bcl-2/Bax 1.18 ± 0.14*0.44 ± 0.07 n 10 10 Beclin-1 0.72 ± 0.04*0.40 ± 0.02 p62 0.41 ± 0.05*0.66 ± 0.04 LC3BⅡ/Ⅰ0.57 ± 0.05*0.37 ± 0.05

2.4 兩組肺組織Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比較 見(jiàn)表3。

表3 兩組肺組織Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量及Bax-2 mRNA/Bax mRNA比較（）

表3 兩組肺組織Beclin-1、LC3B、p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量及Bax-2 mRNA/Bax mRNA比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別高原低氧組對(duì)照組Bcl-2 mRNA/ Bax mRNA 0.59 ± 0.04*0.21 ± 0.05 n 10 10 Beclin-1 mRNA 0.72 ± 0.09*0.29 ± 0.05 LC3B mRNA 0.86 ± 0.12*0.32 ± 0.08 p62 mRNA 0.27 ± 0.08*0.87 ± 0.05

3 討論

高海拔低氧暴露會(huì)導(dǎo)致外界氧氣運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞線粒體的氧分壓下降，體內(nèi)血氧飽和度降低，從而引起機(jī)體一系列應(yīng)激反應(yīng)，甚至可能形成不可逆的臟器損傷，因此缺氧是目前高海拔地區(qū)最關(guān)注的醫(yī)療問(wèn)題之一［3］。其中，低氧引發(fā)的肺損傷是高原疾病中最為普遍的類型之一［4］。因此，進(jìn)一步研究高原肺損傷的分子機(jī)制有助于進(jìn)行針對(duì)性的預(yù)防和治療。截至目前，探討高原低氧環(huán)境下肺組織細(xì)胞自噬及凋亡的研究有很多，主要以體外培養(yǎng)細(xì)胞和高壓氧艙培養(yǎng)動(dòng)物模型的方式進(jìn)行研究，針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行真實(shí)環(huán)境的高海拔低氧環(huán)境培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)較少。本研究以渭河平原以及青藏高原飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)透射電鏡觀察肺組織自噬體數(shù)量，免疫組化法、Western blotting法及PCR法檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)因子表達(dá)；結(jié)果顯示，高原缺氧環(huán)境下的C57BL/6小鼠肺組織細(xì)胞自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增強(qiáng)。

凋亡與自噬存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，細(xì)胞凋亡過(guò)程中通常伴隨著細(xì)胞自噬，甚至自噬可通過(guò)負(fù)調(diào)控凋亡對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用［7-8］。自噬可通過(guò)降解蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，然而過(guò)度自噬則會(huì)引起凋亡或自噬性死亡［7，9］。在缺氧條件的誘導(dǎo)下，細(xì)胞自噬被激活，將細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、RNA、糖原、破損細(xì)胞器等大量降解，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)循環(huán)利用，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，以保證細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新需求［8］。同時(shí)，受缺氧程度及個(gè)體缺氧耐受能力的影響，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡產(chǎn)生應(yīng)答，即細(xì)胞凋亡或壞死［9］。

Beclin-1磷酸化后作為PI3K復(fù)合物的整體支架，可促進(jìn)自噬蛋白定位到自噬泡，其增多表示自噬增強(qiáng)。LC3B參與自噬體膜的形成，是自噬標(biāo)記物。p62 是自噬體與底物之間的適配蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過(guò)程。在自噬過(guò)程中，LC3BⅡ升高的同時(shí)p62降低，這表明自噬流通暢、自噬增強(qiáng)。Bcl-2與Bax共屬一個(gè)家族，通過(guò)控制線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)凋亡激活物。Bax二聚體增加膜通透性，Bcl-2與Bax形成的異聚體降低膜通透性。Bcl-2升高和Bax降低表明細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，Bcl-2/Bax越大表明抗凋亡能力及細(xì)胞自噬越強(qiáng)。本研究透射電鏡觀察結(jié)果顯示，高原低氧組肺組織平均每視野下自噬體數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，肺組織自噬因子LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1表達(dá)增加，并且抗凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax升高。由此結(jié)果推測(cè)，受高原缺氧刺激的影響，小鼠肺組織細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞自噬被激活，細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、RNA、糖原、破損細(xì)胞器等大量降解，以保證細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器更新需求。此外，為了維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的抗凋亡程序產(chǎn)生應(yīng)答。

研究表明，自噬與凋亡之間有著許多共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中一種途徑為低氧激活缺氧誘導(dǎo)因子1觸發(fā)BNIP3，BNIP3破壞Bcl-2/Beclin-1復(fù)合體，從而釋放游離的Beclin-1，形成VPS34/Beclin-1復(fù)合體，最終激活自噬和抗凋亡過(guò)程［9-10］。另外一種途徑為缺氧應(yīng)激激活的蛋白激酶C（PKC）激活JNK1，破壞Bcl-2/Beclin-1復(fù)合體，最終促進(jìn)自噬和抗凋亡過(guò)程［11］。此外，缺氧造成的能源消耗促使LKB1、CaMKKβ、TAK1引起AMP依賴性蛋白激酶（AMPK）磷酸化，進(jìn)一步引起下游TSCI/TSC2磷酸化，導(dǎo)致mTORC1失活，誘導(dǎo)自噬過(guò)程［12］?？傊毖鯛顟B(tài)下的自噬及凋亡調(diào)控是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，其調(diào)控機(jī)制亟待進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，高原低氧環(huán)境下的小鼠肺組織自噬及抗凋亡能力均存在一定程度的增強(qiáng)。青藏高原特殊的環(huán)境因素可能會(huì)刺激小鼠產(chǎn)生應(yīng)激、缺氧等病理生理過(guò)程，進(jìn)而提高其肺組織的自我修復(fù)和抗損傷能力。本研究揭示了高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠肺組織自噬及凋亡能力的影響，為高原缺氧環(huán)境下的適應(yīng)性機(jī)制研究提供了重要參考依據(jù)。本研究的不足之處在于僅采用了小鼠模型進(jìn)行研究，因此結(jié)果未必完全適用于人，且本研究未進(jìn)一步探究高原低氧環(huán)境對(duì)生物體其他組織器官的影響。未來(lái)可進(jìn)一步研究高原低氧環(huán)境對(duì)不同生物的不同組織器官的影響，為開發(fā)高原低氧環(huán)境下肺損傷的預(yù)防和治療策略提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論支持。