陳靜，田偉平，韋小白

上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，上海 200040

肺癌是全球腫瘤相關死亡的主要原因，由于其臨床癥狀不明顯，75%的患者確診時已處于中晚期，喪失了手術治療最佳時機［1］。在過去的30年里，由于肺癌的高復發(fā)率及高侵襲性，導致患者的5年生存率仍只有18%［2］。隨著近年來中醫(yī)藥研發(fā)工程的興起，臨床研究者逐漸將重點放在中藥方面。研究表明，中藥可減輕化學藥物的毒性，增強放化療敏感性，減少腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移［3］。黃芪總皂苷具有抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，而含有黃芪藥物的一些中藥復方在改善腫瘤患者的生活質(zhì)量、減輕化療藥物的血液學毒性及肝功能損害等方面均具有重要作用［4］。炎癥是腫瘤發(fā)生的原因之一，巨噬細胞極化是進入炎癥微環(huán)境的切入點，黃芪總皂苷可通過阻斷肺癌相關巨噬細胞的M2極化，從而抑制肺癌細胞生長、侵襲、遷移和血管生成能力［5］。除了誘導免疫細胞極化，黃芪總皂苷是否還可以通過其他途徑發(fā)揮作用，目前仍不是十分清楚。2021年10月—2022年10月，本研究觀察了黃芪總皂苷對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探究其相關分子機制是否與缺氧誘導因子1α（HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路有關，為黃芪總皂苷在肺癌治療中的應用提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人肺腺癌細胞株A549購自上海酶研生物科技有限公司。藥物：黃芪總皂苷購自上海一飛生物科技有限公司，純度99.1%。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，標準胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，表皮生長因子受體（EGFR）、VEGF抗體均購自英國Abcam公司，HIF-1α抗體購自美國CST公司，辣根過氧酶標記的二抗購自北京中杉金橋科技有限公司。

1.2 細胞分組處理 將肺腺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細胞長滿培養(yǎng)瓶80%時用胰蛋白酶消化、計數(shù)、傳代。將肺腺癌A549細胞分為黃芪總皂苷高、中、低劑量組和對照組，分別加入濃度為200、100、50 μmol/L的黃芪總皂苷和等體積的二甲基亞砜（DMSO）。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的肺腺癌A549細胞，以1×105/mL接種于96孔板，設3個復孔，參照“1.2”進行分組處理。各組培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（A對照孔-A實驗）/A對照孔×100%。

1.4 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。使用馬克筆在6孔板的背面均勻作一平行直線，每孔5條。每孔加入各組分組處理后培養(yǎng)24 h的細胞懸液2 mL（包含約5×105個細胞），待細胞鋪滿孔底后，用槍頭作一垂直于馬克筆橫線的劃痕，PBS漂洗后加入細胞培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照，記為0 h劃痕寬度。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照，記為24 h劃痕寬度。計算各組細胞遷移距離，細胞遷移距離=0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度。

1.5 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取各組分組處理后培養(yǎng)24 h的細胞，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，去上清，加PBS重懸。用PBS將細胞沖洗2次，1 200 r/min離心5 min，去上清。上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，嚴格參照AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。

1.6 細胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組分組處理后培養(yǎng)96 h的細胞，PBS沖洗后加入細胞裂解液，冰浴20 min，12 000 r /min離心15 min，取上清液，采用Bradford法測定蛋白含量。100 ℃變性10 min，每孔加等量蛋白樣品進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉1 h。分別加入HIF-1α、VEGF、EGFR及內(nèi)參GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000及1∶10 000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次，加入二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次。ECL室溫反應5 min后曝光，Syngene凝膠成像儀掃描。采用GeneSnap光密度軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用K-S正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布時以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布時以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率、細胞遷移距離及細胞凋亡率比較 黃芪總皂苷高、中、低劑量組和對照組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率依次降低，細胞遷移距離依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1及OSID碼圖1。

圖1 各組細胞VEGF、HIF-1α、EGFR蛋白表達條帶圖（Westen blotting法）

表1 各組細胞增殖抑制率、細胞遷移距離及細胞凋亡率比較（）

表1 各組細胞增殖抑制率、細胞遷移距離及細胞凋亡率比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，#P＜0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

組別黃芪總皂苷高劑量組黃芪總皂苷中劑量組黃芪總皂苷低劑量組對照組細胞凋亡率（%）39.62 ± 2.23*#△28.12 ± 0.74*#11.05 ± 0.12*4.02 ± 0.13細胞增殖抑制率（%）68.74 ± 3.18*#△49.16 ± 4.43*#26.32 ± 5.94*9.34 ± 5.38細胞遷移距離（μm）0.298 ± 0.015*#△0.461 ± 0.027*#0.618 ± 0.034*0.773 ± 0.042

2.2 各組細胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達量比較 黃芪總皂苷高、中、低劑量組和對照組細胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表2及圖1。

表2 各組細胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達量比較（）

表2 各組細胞HIF-1α、VEGF及EGFR蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與黃芪總皂苷低劑量組比較，#P＜0.05；與黃芪總皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

EGFR 0.48 ± 0.42*#△0.64 ± 0.59*#0.72 ± 0.31*0.83 ± 0.23組別黃芪總皂苷高劑量組黃芪總皂苷中劑量組黃芪總皂苷低劑量組對照組HIF-1α 0.19 ± 0.85*#△0.27 ± 0.08*#0.37 ± 0.18*0.46 ± 0.34 VEGF 0.23 ± 0.19*#△0.39 ± 0.34*#0.51 ± 0.24*0.61 ± 0.12

3 討論

黃芪總皂苷是從中草藥黃芪中純化而來，其性質(zhì)甘甜溫和，參與肺和脾的經(jīng)絡調(diào)節(jié)，具有調(diào)理脾胃、補血益氣、防治風寒等功效，對增強人體免疫功能具有顯著療效。同時，黃芪總皂苷也可通過調(diào)節(jié)各種免疫信號傳導通路蛋白和因子，參與抗炎和保護神經(jīng)細胞活性等過程［6-7］。研究顯示，黃芪總皂苷可通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路的傳導，抑制相關編碼基因表達，進而降低腫瘤細胞VEGF蛋白表達，抑制腫瘤組織新生血管生成和腫瘤遠處轉(zhuǎn)移［8］。本研究結果顯示，黃芪總皂苷對肺腺癌A549細胞增殖具有明顯抑制作用，隨著黃芪總皂苷藥物濃度的升高，其增殖抑制作用和促凋亡能力增強；經(jīng)過不同濃度黃芪總皂苷處理過的肺癌細胞遷移能力降低，隨著黃芪總皂苷藥物濃度的升高，其遷移能力逐漸降低；這提示黃芪總皂苷可降低肺腺癌細胞的增殖、遷移能力，并誘導其凋亡，且濃度越高效果越明顯。這與既往研究證實黃芪總皂苷能夠抑制人乳腺癌細胞增殖和侵襲能力［9］的結論一致。

轉(zhuǎn)移是腫瘤相關死亡的主要原因，而新生血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機制之一。血管是介導遠端轉(zhuǎn)移的重要結構，參與加速腫瘤生長、維持腫瘤微環(huán)境、提供生長和侵襲信號、促進腫瘤轉(zhuǎn)移等多種過程，并可引起腫瘤相關的全身性疾?。?0］。HIF-1α是細胞缺氧時形成的缺氧誘導因子，在腫瘤血管新生過程中處于重要地位，當細胞外環(huán)境出現(xiàn)缺氧或細胞代謝率過高導致相對缺氧時，可以激活組織及細胞大量表達HIF-1α［11］。HIF-1α的活性水平與腫瘤發(fā)生、血管生成和轉(zhuǎn)移相關。同時，HIF-1α位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，而這些信號通路是分子信號網(wǎng)絡的核心，控制著許多細胞的生長、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達HIF-1α［12-13］。VEGF是一類結構和功能相關的蛋白分子，其靶基因VEGF-A在轉(zhuǎn)錄水平上主要受HIF-1α的調(diào)控，可通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖而促進腫瘤血管生成［14］。EGFR信號蛋白作為HIF-1α/VEGF信號通路的上游調(diào)控因子，參與了腫瘤血管生成。研究表明，在EGFR突變的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞中，可以以缺氧獨立的方式上調(diào)HIF-1α，從而誘導VEGF表達，而當EGFR信號通路被抑制時VEGF下調(diào)，這提示EGFR的激活可能驅(qū)動VEGF表達［15］。HIF-1α/VEGF是腫瘤血管生成的重要信號通路，EGFR信號蛋白參與了該信號通路的傳導及調(diào)節(jié)。本研究結果顯示，黃芪總皂苷干預后肺腺癌A549細胞HIF-1α、VEGF和EGFR蛋白表達均降低，提示黃芪總皂苷對肺腺癌A549細胞發(fā)揮抗腫瘤作用可能是通過使HIF-1α/VEGF信號通路失活來實現(xiàn)的。

綜上所述，黃芪總皂苷可降低肺腺癌細胞的增殖、遷移能力，并誘導其凋亡，其機制可能與抑制HIF-1α/VEGF信號通路有關。至于黃芪總皂苷調(diào)控腫瘤細胞生物學行為的過程中是否有其他作用機制尚未可知，需進一步實驗證實。