王靜 喬佑杰

根據膿毒癥3.0的定義,膿毒癥是因宿主對感染反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙[1]。目前可用于膿毒癥早期診斷的資源有限。序貫器官衰竭評估(sequential organ failure assessment,SOFA)評分雖然可以幫助診斷膿毒癥,識別高死亡風險的患者,但它不是針對膿毒癥的特定工具[1]。人們一直在研究針對膿毒癥的生物標志物,希望通過它們能對膿毒癥的診斷、治療及預后評估帶來益處。目前已有100多種關于膿毒癥的生物標志物被提出[2],確定哪種標志物可能有助于優(yōu)化診斷和治療策略仍然是一個挑戰(zhàn)。本文將目前有助于膿毒癥早期診斷或對疾病嚴重程度及預后評估有潛在價值的標志物做一綜述。

1 傳統(tǒng)的與感染相關的生物標志物

1.1 降鈣素原(procalcitonin,PCT) PCT是過去10年間研究最多的與感染相關的炎性標志物,它是一種細菌感染后刺激細胞釋放出的由116 個氨基酸組成的糖蛋白。1993年Assicot等[3]發(fā)現血清中 PCT含量與感染性疾病密切相關,并提出PCT可作為人體細菌性感染的血清標志物。之后有很多對于PCT的研究,認為它是膿毒癥早期診斷的可靠生物標志物。近期一項多中心的研究,納入了266例符合膿毒癥3.0標準的患者,其中一部分患者以PCT指導抗生素治療,結果顯示與對照組相比PCT組可以減少感染的遠期后遺癥,并可顯著降低病死率[4]。

1.2 C反應蛋白(c-reactive protein,CRP) CRP是臨床最常用的膿毒癥早期診斷生物標志物之一,也是臨床廣泛使用的炎性指標。其敏感度高、但缺乏特異性。2019年發(fā)表的一篇meta 分析納入了9 項臨床研究,其中膿毒癥組 495 例患者,非膿毒癥組 873 例患者,通過評價PCT和CRP在膿毒癥診斷中的臨床價值,結果顯示:PCT 和 CRP 在成人膿毒癥診斷中具有中等程度的價值,PCT的診斷準確性和特異性高于CRP[5]。所以臨床上CRP應注意與其他標志物聯合使用和動態(tài)監(jiān)測,以提高其診斷準確性。

1.3 細胞因子 細胞因子作為參與免疫調節(jié)的組成部分,存在于所有有核細胞中。機體失控性炎性反應學說被認為是膿毒癥發(fā)病機制的重要基礎。炎性細胞過度激活并釋放大量炎性細胞因子是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。因此,細胞因子也被認為是膿毒癥的生物標志物。目前作為標志物的細胞因子,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6和IL-10等在文獻中反復被提及并相互比較,證明其在膿毒癥診斷中的優(yōu)越性。有研究者比較了膿毒癥患者以及非感染性全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)患者血清中TNF-α和IL-10水平。結果表明,膿毒癥患者血清中TNF-α和IL-10的表達水平顯著高于非感染性SIRS患者,且病情嚴重程度與TNF-α和IL-10表達水平正相關[6]。最近在一項以膿毒癥3.0為診斷標準的膿毒癥和膿毒性休克的研究中,血清IL-6區(qū)分膿毒癥與非膿毒癥的曲線下面積(AUC)為0.83-0.94(P<0.001),敏感度0.804,特異度0.889[7]。

2 與炎性反應激活和免疫失衡相關的生物標志物

2.1 鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin) 鈣衛(wèi)蛋白是中性粒細胞胞漿中含量最豐富的蛋白質之一。這種鈣結合蛋白由2個亞基S100A8和S100A9組成,廣泛分布于人體細胞、組織及體液中,是一種重要的炎性反應蛋白。當細菌感染后由中性粒細胞釋放入血,通常在數小時內隨著細菌或內毒素的反應而增加[8]。近年研究發(fā)現,在膿毒癥時,鈣衛(wèi)蛋白表達水平可明顯升高(正常人的血清鈣衛(wèi)蛋白濃度通常低于1 mg/L,發(fā)生膿毒癥時可升高100倍[9-10]。

在一項前瞻性觀察研究中,膿毒癥患者的血清鈣衛(wèi)蛋白濃度顯著升高,較PCT濃度更敏感地區(qū)分膿毒癥患者和非膿毒癥患者。同時發(fā)現,在評估膿毒癥嚴重程度及預后方面,鈣衛(wèi)蛋白水平與30天病死率直接相關[11]。Dubois等[12]研究發(fā)現,當膿毒性休克患者SOFA評分相似時,較高的血清鈣衛(wèi)蛋白水平可提示更高的死亡風險。

2.2 血清穿透素3 (pentraxin3, PTX3) PTX3是屬于長鏈五聚蛋白亞家族的急性期蛋白,在炎性細胞因子刺激下,各類免疫細胞、內皮細胞和上皮細胞均分泌PTX3。它通過激活經典補體途徑以及促進巨噬細胞和樹突狀細胞識別病原體,在炎性反應早期發(fā)揮作用。在膿毒癥后6～8h可見PTX3水平顯著升高(>100 μg/L),而健康者體內PTX3水平幾乎檢測不到(<2 μg/L)[13]。

一項針對101例膿毒癥患者的研究,檢測膿毒癥患者發(fā)病第1天的血漿PTX3水平,并與健康組進行了比較,結果顯示,膿毒癥組的PTX3顯著增加,它預測膿毒癥休克的最高AUC為0.798(95%CI,0.666-0.921,P<0.001)[7]。另一項前瞻性單中心研究也顯示出血清PTX3水平可以確定膿毒癥的診斷,而且與疾病嚴重程度具有相關性,這項研究認為PTX3是評估膿毒癥和膿毒性休克嚴重程度的早期生物標志物[14]。

2.3 可溶性CD14亞型(soluble CD14 subtype,sCD14-ST或Presepsin) CD14是一種跨膜糖蛋白,是存在于單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞表面的受體。它是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)的成員,能夠識別革蘭陽性和革蘭陰性病原體的配體組。CD14以2種形式存在,即膜結合形式(mCD14)和可溶形式(sCD14)。sCD14具有不同的亞型,sCD14-ST亞型的N端片段稱為Presepsin[15]。健康人血液中sCD14水平低,濃度僅為微克級。當細菌、真菌等微生物感染時Presepsin血清水平急劇升高,是診斷和檢測膿毒癥的新型生物標志物之一[16]。同時在疾病嚴重程度和病死率預測中也具有一定的作用[17]。

2019年的一項系統(tǒng)回顧和meta分析,納入了19項觀察研究,共有3 012例患者,結果顯示,Presepsin的敏感性和特異性分別為0.84(95%CI,0.80-0.88)和0.73(95%CI,0.61-0.82),PCT診斷敗血癥的敏感性和特異性分別為0.80(95%CI,0.75-0.84)和0.75(95%CI,0.67-0.81)。結果顯示,Presepsin和PCT的AUC分別為0.87和0.84,在膿毒癥早期診斷方面兩者表現相當[18]。另一項納入了40例ICU患者的小型研究結果顯示,與SIRS評分或序貫器官衰竭評估快速(qSOFA)評分相比,ICU 患者的早期 Presepsin 測量在診斷膿毒癥和預測病死率方面更準確[19]。

2.4 中性粒細胞CD64(nCD64) nCD64又稱免疫球蛋白Fcγ受體1(FcR1),在單核細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞上表達,在感染發(fā)生的4～6 h內,在促炎細胞因子的作用下nCD64表達明顯上調,因此被認為是一個有價值的膿毒癥診斷生物標志物。有研究提出nCD64 是膿毒癥早期診斷的敏感而特異的檢測方法,在健康志愿者中,nCD64 在中性粒細胞上的表達水平極低,但在炎性反應或感染后顯著升高。nCD64值≥2 398分子/細胞能區(qū)分膿毒癥和非膿毒癥[20]。

在2019年對14項研究、2471例患者進行的一項meta分析中,nCD64優(yōu)于CRP和PCT診斷膿毒癥的效果[21]。最近幾項關于兒科重癥前瞻性雙盲研究結果顯示:兒科重癥監(jiān)護室患者入院時nCD64與PCT和CRP呈正相關,而且nCD64可能成為區(qū)分細菌和病毒感染的新型標志物[22]。據報道,中性粒細胞上的 nCD64表達與 SIRS 和膿毒癥的嚴重程度有關。nCD64的缺失通過下調TLR4 信號通路提高膿毒癥小鼠的存活率[23]。但是,由于nCD64需要使用流式細胞術來測量,因此在臨床中快速檢測還有一定的局限性。

2.5 單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP-1) MCP-1是 MCP家族中研究占比較多的成員,通常由氧化應激、細胞因子或生長因子誘導,由內皮細胞和單核細胞等細胞分泌,與趨化蛋白受體2結合后發(fā)揮不同的生理作用,如誘導淋巴細胞及自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)歸巢、遷移、激活、分化發(fā)育及炎性反應發(fā)生等。

一項研究納入了143例膿毒癥患者,結果發(fā)現,血清MCP-1水平與膿毒癥嚴重程度直接相關。MCP-1預測28天病死率(AUC 0.766)高于PCT(AUC 0.621)及SOFA評分(AUC 0.640)[24]。此外,膿毒癥患者血漿MCP-1水平與其他細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10)水平直接相關,是預測膿毒癥發(fā)展的潛在生物標志物[25-26]。許志平等[27]的研究表明,MCP-1對于膿毒癥死亡風險評估具有很好的敏感性和特異性,能夠為膿毒癥臨床評估提供更好的檢測指標。

2.6 腎上腺髓質素(adrenomedullin,ADM)和腎上腺髓質素前體(Pro-adrenomedullin ,ProADM) ADM是一種由52個氨基酸組成的肽,主要在內皮細胞和血管平滑肌細胞中產生,由多種組織分泌。ADM通過介導血管舒張,參與調節(jié)體循環(huán)。由于循環(huán)中的ADM會迅速降解并從血液中清除,因此使用標準免疫分析法不易檢測其水平。近年來研究發(fā)現,由45～92個氨基酸組成的腎上腺髓質素前體中區(qū)片段(MR-proADM)有更長的半衰期,可間接反映 ADM水平,且檢測方便,已被作為膿毒癥和膿毒性休克的生物標志物[28]。

王來等[29]對比膿毒癥患者和健康志愿者血清中的MR-proADM,結果顯示嚴重膿毒癥患者檢測MR-proADM水平非常有必要,且聯合檢測PCT水平能夠更為及時地診斷膿毒癥。另一項納入了215例患者(109例膿毒癥患者,106例膿毒性休克患者)的研究中,ADM四分位數與器官衰竭的數量以及 SOFA評分、心血管、腎臟、凝血和肝臟功能損傷相關。ADM水平也預測了30天病死率,與SOFA評分相似(AUC 0.827對0.830)?？梢?ADM可以作為膿毒癥診斷及預測膿毒癥患者的嚴重程度、器官衰竭和30天病死率的一種標志物[30]。

2.7 可溶性髓樣細胞觸發(fā)受體-1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1,sTREM-1) sTREM-1是一個表達于中性粒細胞、成熟的單核細胞、巨噬細胞表面的跨膜糖蛋白。細菌感染可增加細胞表面的sTREM-1 表達。它參與觸發(fā)IL-8、MCP-1和TNF-α的分泌,并誘導中性粒細胞脫顆粒。在Wu等[31]的meta分析中,納入了包括11項研究、1 795例患者。他們發(fā)現在膿毒癥診斷方面,sTREM-1的敏感性和特異性分別為0.79(95%CI,0.65-0.89)和0.80(95%CI,0.69-0.88)。結果表明,血漿sTREM-1在區(qū)分膿毒癥和SIRS方面具有中等的診斷性能[31]。另一項納入19 項研究、2 418例患者的meta分析中,探討了sTREM-1在疑似膿毒癥中的診斷價值。發(fā)現sTREM-1對高?；颊吣摱景Y的診斷具有中等準確性,其綜合敏感性為0.82(95%CI,0.73-0.89),特異性為0.81(95%CI,0.74-0.86)?？梢?還需要更多的大規(guī)模研究來進一步評估 sTREM-1 的診斷準確性[32]。

2.8 可溶性尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(soluble urokinase-type plasminogen activator receptor,suPAR) suPAR是一種廣泛存在于血液和體液中的膜結合受體,與某些疾病如關節(jié)炎、肝纖維化、瘧疾和細菌感染等的嚴重程度有關,所以suPAR可能作為一種感染性疾病的潛在生物標志物。其濃度與免疫系統(tǒng)的活性直接相關,包括細胞黏附、遷移、趨化性、蛋白質水解、免疫激活、組織重塑、侵襲和信號轉導等。

一項納入17項研究的Meta分析顯示,suPAR對細菌感染或全身炎性反應具有中度診斷價值,AUC為0.83[33]。另一項對涉及30項研究,6 906例患者系統(tǒng)回顧和Meta分析中,suPAR和PCT對膿毒癥的診斷準確性相似。suPAR診斷膿毒癥的總敏感性為0.76(95%CI,0.63-0.86),特異性為0.78。此外,區(qū)分膿毒癥和SIRS的AUC為0.81(95%CI,0.77-0.84),敏感性為0.67(95%CI,0.58-0.76)和特異性為0.82(95%CI,0.73-0.88)[34]?？梢妔uPAR敏感性不強,需要進一步研究以評估suPAR與其他生物標志物結合使用是否能提高診斷效果。

2.9 Toll樣受體(toll-like receptor,TLR4) TLR4可以識別細胞表面的脂多糖(lipopo-lysaccharide,LPS)、病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)及其他損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP),引發(fā)下游信號級聯反應,誘導產生TNF-α、 IL-6、IL-12等炎癥因子進行防御。

研究發(fā)現當膿毒癥患者體內TLR2、TLR4等TLRs表達急劇增加,并激活NK-κB,使炎性因子大量釋放時,可誘發(fā)重癥膿毒癥[35]。盡管缺乏大規(guī)模的研究證明TLR4與PCT和CRP等生物標志物在膿毒癥診斷中的相關性,但最近的一項研究結果總結了通過TLR4表達作為評估膿毒癥嚴重程度的生物標志物的可能性(P<0.05)[36]。

2.10 程序性死亡-1(programmed death-1 ,PD-1)受體 PD-1最初是從凋亡的小鼠T細胞雜交瘤中克隆而來,屬于CD28免疫球蛋白超家族成員,主要表達于活化的T細胞、B細胞和NK細胞表面?？烧T導共抑制細胞表面蛋白,對建立免疫耐受非常重要。PD-1存在2種已知配體,即PD-L1和PD-L2,二者均通過競爭與PD-1結合。PD-L1是PD-1主要的結合配體。

之前的研究表明,嚴重膿毒癥和膿毒性休克患者表現出PD-1更高的表達[37]。在最近的一項前瞻性觀察中,納入114例患者進行分析,四種信號分子(PD-1、CD28、PD-L1和CD86)的NK細胞表達程度與SOFA評分直接相關[38]。在膿毒癥等高抗原負荷的環(huán)境下,PD-1/PD-L1的異常上調會引起固有和適應性免疫系統(tǒng)紊亂,造成多器官功能衰竭甚至死亡。PD-1作為一種新的預后生物標志物的能力可能進一步增強膿毒癥患者SOFA評分的預測能力。

2.11 可溶性腫瘤壞死因子1型受體(soluble tumor necrosis factor-1 receptor,sTNFR1) 膿毒癥時, TNF釋放增多,2種TNF膜結合受體TNFR1和TNFR2被釋放到循環(huán)中以調節(jié)炎癥反應。這些受體進一步裂解,產生可溶性片段,分別為sTNFR1和sTNFR2,這些片段與TNF結合并抑制其活性。

一項關于膿毒癥免疫反應的臨床研究納入了163例重癥患者,評估了與TLR4信號通路相關的促炎和抗炎細胞因子的變化。發(fā)現sTNFR1濃度可有效區(qū)分感染及其他導致 ICU 住院的原因。與在 ICU 接受治療的其他患者相比,sTNFR1在膿毒癥患者組中觀察到更高的濃度。除了膿毒癥的診斷價值外,這種蛋白質似乎還具有評估預后的價值。在死亡的患者組中也顯示出更高的濃度[39]。

3 與器官功能障礙相關的新型生物標志物

3.1 血管生成素-1(Angiopoietin-1,Ang-1)和血管生成素-2(Angiopoietin 2,Ang-2) Ang 存在2種常見的亞型Ang1及Ang2,二者均以酪氨酸激酶受體Tie 作為受體。二者可競爭性的與Tie-2受體結合。Ang1和Tie2的結合主要起到穩(wěn)定血管屏障的作用,而Ang2和Tie2的結合則介導了血管內皮屏障的破壞,參與膿毒癥毛細血管滲漏的發(fā)生,這是器官功能障礙的主要機制之一[40]。Ang-2 主要由激活的內皮細胞分泌。在靜止的內皮細胞中Ang-2 幾乎不表達。膿毒癥時在各種毒素和炎癥介質的刺激下, Ang-2從內皮細胞中迅速釋放出來。導致血管滲漏,刺激細胞遷移到周圍組織,觸發(fā)炎性反應和凝血途徑的激活,最終導致器官功能障礙[41]。

在多項膿毒癥的臨床研究中,高水平的Ang2和低水平的Ang-1或高Ang-2/Ang-1和低Ang-1/Ang-2比率與膿毒癥的器官功能障礙和不良臨床結局相關,包括預測急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的嚴重程度等[25,40,42]。

3.2 基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs) 基質金屬蛋白酶是一個大家族,因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。MMPs和金屬蛋白酶組織抑制劑(metalloproteinases,TIMPs)是調節(jié)損傷后傷口愈合的關鍵介質[43]。

Hoffmann等[44]為了研究嚴重膿毒癥患者的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和IL-6血漿水平及其與預后的關系,納入了37例嚴重膿毒癥患者和37例健康志愿者,并通過ELISA方法測定了MMPs水平。結果表明,與健康對照組相比,膿毒癥患者的MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和IL-6水平顯著升高(P<0.001)。在另一項單中心納入48例膿毒癥及膿毒癥休克患者的前瞻性研究顯示,入院時的MMP-3和住院前72 h內IL-6的變化可以為膿毒癥患者提供預后的評估[45]。當然,這還需要的進一步的研究來確定這些細胞因子作為衡量膿毒癥嚴重程度和預測死亡率的效用。

3.3 MicroRNA (miRNA) miRNAs是一組由20～24個核苷酸組成的RNA分子,通過裂解或是抑制mRNA的翻譯,起到調控蛋白表達的作用。miRNA是宿主對感染反應的關鍵介質,可在轉錄后調節(jié)多達60% 的蛋白質編碼基因的表達。它主要通過調節(jié)參與免疫途徑的蛋白質表達來發(fā)揮作用。

蔡華忠等[46]檢測88例膿毒癥患者血清,發(fā)現血清miR-155-5p 和miR-133a-3p 在膿毒癥心肌損傷中的表達增高,且其特異性與敏感性均高于血清腦鈉肽和肌鈣蛋白。一項關于膿毒癥大鼠模型的研究顯示,當膿毒癥腎損傷時,血清中miR-21-3p的表達顯著增加[47]。目前已經描述了50多種不同細菌和病毒感染的宿主—病原體相互作用的miRNA特征。通過多項研究篩選出的對膿毒癥具有診斷價值的miRNAs包括miR-25、miR-122、miR-133a、miR-146和miR-4772等多個相關標志物,但是目前尚無針對膿毒癥診斷的特異性miRNAs標志物[48]。建議多種生物標志物聯合使用的模式可能更值得研究和推薦[49]。

3.4 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA ,lncRNAs) lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。能與DNA、RNA 和蛋白結合,參與調控基因的表達,在機體的生長發(fā)育和細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮作用[50-51]。盡管許多與炎性疾病(包括膿毒癥)相關的非編碼RNA已被確認,但它們的功能和機制尚不完全清楚,且存在爭議。

轉移相關肺腺癌轉錄本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是具有保守特點的非編碼RNA,早期可作為肺癌轉移的預后標志物。目前越來越多的證據表明,MALAT1 是炎性細胞產生的重要調節(jié)因子,可作用于不同的miRNA,調節(jié)不同靶基因,進而調控炎性反應和免疫反應,在炎癥性疾病中受到廣泛關注[52]。一項對120例膿毒癥患者的前瞻性隊列研究顯示,MALAT1(AUC 0.910)比APACHE II評分(AUC 0.868)和乳酸水平(AUC 0.868)更準確地診斷膿毒癥,預測28天生存率[53]。由于lncRNA 臨床應用的研究較少,若lncRNA和miRNA 成為膿毒癥診斷的新型標志物還需進行大規(guī)模的臨床研究深入探討。

4 小 結

雖然目前已經確定了許多與膿毒癥相關的生物標志物。然而,很多標志物在膿毒癥中的確切作用尚未十分明確。為了提高膿毒癥診斷治療的準確性和高效性,仍需更多的研究來了解這些生物標志物在體內的作用機制,從而明確生物標志物對膿毒癥診斷、治療及預后評估的價值。將患者臨床特征與生物標志物相結合進行早期診斷和風險評估將是膿毒癥診斷的未來方向。