郭棟,時靜,李文晉,3*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院,山西 太原 030001;2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科,天津 300070;3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科,山西 太原 030001)

對于外傷、腫瘤等疾病所引起的骨折,骨修復(fù)一直是一個極大的難題。傳統(tǒng)療法骨再生率低,也會造成慢性疼痛和感染[1]?；蛟鰪?qiáng)骨組織工程融合了基因治療與骨組織工程技術(shù)的優(yōu)點,在骨修復(fù)領(lǐng)域具有良好的前景。近年來脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)逐漸引起人們的關(guān)注,成為基因增強(qiáng)骨組織工程中更有前景的干細(xì)胞。本文就ADSCs在基因增強(qiáng)骨組織工程中的研究進(jìn)展做一綜述,為后續(xù)研究提供理論支持。

1 ADSCs與骨組織工程

骨組織工程的主要目標(biāo)是將種子細(xì)胞、生長因子、復(fù)合支架結(jié)合起來,產(chǎn)生模擬細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu),促進(jìn)組織修復(fù)和再生[2]。

1.1 ADSCs與生長因子 種子細(xì)胞的常規(guī)來源是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),但其應(yīng)用仍存在不少問題,如BMSCs提取時所帶來的痛苦、提取的干細(xì)胞產(chǎn)量低、干細(xì)胞特征的不穩(wěn)定、分化潛能發(fā)生變化、需要額外補(bǔ)充生長因子來促進(jìn)成骨以及骨折的不完全愈合等[3-5]。ADSCs來源于豐富的脂肪組織,最早由Zuk等[6]在脂肪組織的血管基質(zhì)片段中分離得到。ADSCs已證明具有多系分化能力,包括成脂肪、成軟骨、成肌和成骨譜系,已在體內(nèi)用于再生脂肪、軟骨、骨以及更復(fù)雜的組織,如牙周組織和椎間盤;還可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞,可以作為血管化骨組織工程的單細(xì)胞來源[7];它也是一種良好的基因載體細(xì)胞,易于接受基因修飾來獲得成骨誘導(dǎo)功能的定向加強(qiáng)[8]。在下頜骨缺損、顱骨缺損治療、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)以及軟骨修復(fù)等方面均取得了較為理想的進(jìn)展[9]。它的優(yōu)勢在于：(1)ADSCs占脂肪組織中有核細(xì)胞總數(shù)的5%,可以高產(chǎn)量獲得,而骨髓中的BMSCs不到0.01%;(2)ADSCs的收集程序相對簡單、無痛,且并發(fā)癥有效降低;(3)ADSCs在培養(yǎng)期間能保持較高的增殖潛能,平均群體倍增時間為2～3 d;(4)沒有遺傳改變或復(fù)制性衰老,即使是長達(dá)20代的長期培養(yǎng),也不會引起ADSCs的顯著染色體畸變,并保留其形態(tài)、免疫表型、正常分裂周期及其凋亡調(diào)節(jié)功能。冷凍保存超過10年,也不會影響它們的生存能力、分化潛能和免疫表型特征[10]。

生長因子可以誘導(dǎo)干細(xì)胞和炎癥細(xì)胞遷移到損傷部位,通過自分泌或旁分泌機(jī)制促進(jìn)骨形成,這些因子也會增加瘢痕形成,加速愈合過程。目前常用的生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)等[2]。BMP-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中最具骨誘導(dǎo)性的成員,是目前美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的第一個,也是唯一一個用作骨移植替代物的骨誘導(dǎo)生長因子,在堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OC)等成骨標(biāo)志物的表達(dá)中起關(guān)鍵作用[11],可以顯著增強(qiáng)ADSCs體內(nèi)以及體外的成骨分化能力[12]。多個生長因子也可以一起轉(zhuǎn)導(dǎo),從而協(xié)同調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白質(zhì)合成,增強(qiáng)生物活性。有學(xué)者用 IGF-1和BMP-2的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染ADSCs,發(fā)現(xiàn)IGF-1和BMP-2驅(qū)動了ADSCs的軟骨形成,促進(jìn)ADSCs分化為成熟的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞和形成軟骨結(jié)節(jié)[13]。

1.2 ADSCs與復(fù)合支架 支架設(shè)計目的是促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、黏附、遷移以及加速骨重塑,其必須具有生物相容性和非細(xì)胞毒性,并且具有與骨組織相似的機(jī)械和表面性質(zhì)。

在某些情況下還可以作為生長因子或抗生素的載體材料,與生長因子結(jié)合后為生長因子提供一定的機(jī)械強(qiáng)度,使生長因子持續(xù)緩釋,可增加其在生物體內(nèi)的濃度,刺激細(xì)胞的黏附[14]。支架材料多分為天然聚合物、合成聚合物和陶瓷材料三種,但均存在一定的不足,其微觀結(jié)構(gòu)的變化會影響間充質(zhì)干細(xì)胞的反應(yīng),并可能改變細(xì)胞與支架表面的黏附、細(xì)胞增殖和成骨分化。目前研究人員常將兩種或者兩種以上的材料通過物理、化學(xué)混合或改性的方式來提高其力學(xué)和生物學(xué)特性,保留其各自的優(yōu)勢,以獲得良好性能[15]。

天然聚合物具有良好的生物相容性,包含特定的分子結(jié)構(gòu)域,可在細(xì)胞發(fā)育的各階段支持和引導(dǎo)細(xì)胞分泌更多相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì),從而增強(qiáng)支架與組織的相互作用。常用的天然聚合物有多糖、膠原(collagen,Col)、海藻酸鹽(sodium alginate,Alg)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)等材料[16]。也可添加其他誘導(dǎo)劑來增強(qiáng)成骨,如Wu等[17]在HA涂層孔或富含HA的纖維蛋白水凝膠中用辛伐他汀處理ADSCs可促進(jìn)ADSCs的軟骨分化。天然聚合物與陶瓷材料相比質(zhì)地較軟,可適應(yīng)所需形狀的要求,但存在降解速率過快、機(jī)械性能交叉等問題,因此可與骨組織工程中其他更為堅固的材料聯(lián)合應(yīng)用。

合成聚合物是一種半結(jié)晶的可生物降解聚合物,屬于一種疏水性材料,其優(yōu)勢在于具有生物相容性、非細(xì)胞毒性、降解性能和可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能,常用的材料有聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]和聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)。但由于其生物活性低,影響細(xì)胞附著、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)[18]。因此有學(xué)者將多種材料聯(lián)合應(yīng)用,如通過同軸靜電紡絲制備了PLGA/PCL-BMP-2(PP-B)纖維支架,將ADSCs種植在支架上,與傳統(tǒng)的PLGA/PCL支架在支架形態(tài)和BMP-2釋放能力方面進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)復(fù)合支架顯著促進(jìn)了ADSCs的增殖和成骨分化,PP-B組次之,傳統(tǒng)的PLGA/PCL支架增殖和成骨能力最差[19]。

陶瓷材料也稱為生物吸收性材料,其最大優(yōu)勢在于生物相容性好,具有合適的剛度、優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性、耐化學(xué)腐蝕特性,可促進(jìn)生物礦化。但其脆性大,多與其他材料聯(lián)合使用,其中最常用的是β-磷酸三鈣(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)和羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)[20]。在一項BMP-2修飾的ADSCs負(fù)載于β-TCP載體植入犬尺骨缺損模型的實驗中,發(fā)現(xiàn)新形成的骨體積顯著增加,16周后缺損處的骨修復(fù)基本完成[21]。HAP也常與膠原結(jié)合,對膠原處理和BMP-2結(jié)合后的多孔HAP支架進(jìn)行表面改性后對HAP支架的整體性能沒有影響,但極大的增強(qiáng)了HAP支架的抗壓能力。HAP、改性HAP和膠原-BMP-2功能化HAP的抗壓強(qiáng)度依次遞增,膠原蛋白和BMP-2的聯(lián)合應(yīng)用效果更佳[22]。Liao等[23]通過低溫法構(gòu)建明膠/HAP/BMP-2(GNB)支架,發(fā)現(xiàn)GNB支架可以通過上調(diào)早期標(biāo)記蛋白Ⅰ型膠原蛋白和晚期標(biāo)記蛋白骨橋蛋白,使得ADSCs堿性磷酸酶活性和礦化程度的升高,達(dá)到較為理想的成骨效應(yīng)。

2 ADSCs與基因治療

基因治療分為體內(nèi)法和體外法,體外法的原理是通過外源性基因轉(zhuǎn)染從機(jī)體上分離出靶細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng),然后再轉(zhuǎn)移到缺損部位進(jìn)行骨誘導(dǎo)修復(fù);體內(nèi)法的原理是將目的基因注入機(jī)體,使其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。兩種方法均可持續(xù)輸送少量、生理性強(qiáng)的BMP-2,大大減少所需的BMP-2數(shù)量,為機(jī)體提供持久的骨再生刺激,將不良反應(yīng)的發(fā)生率降到最低[24]。目前常用的基因?qū)胼d體包括病毒載體和非病毒載體兩大類,病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒(lentiviru,Lv)、腺病毒(adenovirus,Ad)、腺相關(guān)病毒等;非病毒載體如脂質(zhì)體、陽離子多聚物、殼聚糖、無機(jī)納米粒子等[25]。

Ad具有易制備、高滴度、感染效率高、宿主細(xì)胞范圍廣、不整合至宿主細(xì)胞染色體內(nèi)、在表達(dá)時間上具有自限性、遺傳毒性低等優(yōu)點,已經(jīng)成為臨床試驗中使用率最高的一種病毒載體,占病毒載體的30.2%[26]。Dragoo等[27]首次報道了Ad介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染人類ADSCs后,體外細(xì)胞外基質(zhì)中有大量鈣的沉積;在一項治療大鼠頂骨缺損的實驗中,其成骨效率也優(yōu)于單獨應(yīng)用ADSCs[28]。

Lv具有無毒,不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng),所能插入的目的基因片段容量大,能感染分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞和終末分化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞和肝細(xì)胞等),也能夠整合于宿主細(xì)胞基因組,理論上實現(xiàn)目的基因永久表達(dá)等優(yōu)點[29],已成為當(dāng)前基因傳遞載體研究的熱點。Virk等[30]發(fā)現(xiàn)與Ad轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMP-2轉(zhuǎn)移相比,Lv轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMP-2顯示了更好的骨修復(fù)趨勢。通過Lv產(chǎn)生BMP-2的BMSC在體外具有誘導(dǎo)長期蛋白質(zhì)生成的能力,并在體內(nèi)產(chǎn)生大量的新骨形成。Bougioukli等[31]首次報導(dǎo)了對BMSCs和ADSCs在Lv兩步轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(two-step transcriptional amplification system,TSTA)轉(zhuǎn)染BMP-2(Lv-TSTA-BMP-2)成骨的研究,發(fā)現(xiàn)兩者均可快速誘導(dǎo)成骨分化,但ADSCs效果更佳。與BMSCs相比,大多數(shù)培養(yǎng)的ADSCs共同表達(dá)正確的CD標(biāo)記物,ADSCs產(chǎn)生的BMP-2幾乎是BMSCs的3倍。此實驗也證實了年齡與人體脂肪抽吸物組織的細(xì)胞產(chǎn)量之間沒有關(guān)聯(lián),脂肪組織分離的細(xì)胞在所有傳代中都具有更快的細(xì)胞生長和更高的細(xì)胞產(chǎn)量。也有學(xué)者將分別轉(zhuǎn)染Lv-BMP-2和Lv-BMP-7的ADSCs單獨或聯(lián)合植入β-TCP支架上進(jìn)行體外培養(yǎng),然后將ADSCs/β-TCP構(gòu)建物植入大鼠股骨缺損中6周。結(jié)果表明BMP-2和BMP-7基因共轉(zhuǎn)染組在體內(nèi)比BMP-2組和BMP-7組顯著提高了新骨形成效率[32]。

殼聚糖作為一種非病毒基因載體,具有良好的生物相容性和生物可降解性,是一種安全、易于構(gòu)建的高分子,可以保護(hù)DNA免受降解[33]。有學(xué)者評估了Lv與BMP-2/FGF-2雙基因系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染的ADSCs的體外成骨特性,結(jié)果顯示兩種因子之間具有良好的協(xié)同作用,與單獨轉(zhuǎn)染其他因子相比具有更高的成骨指數(shù)[34]。

3 ACSDs與基因增強(qiáng)組織工程

基因增強(qiáng)組織工程是將兩者相結(jié)合的新技術(shù),選擇合適的基因轉(zhuǎn)移方式、理想的目標(biāo)基因、優(yōu)化種子細(xì)胞、制備高效的轉(zhuǎn)移體系來進(jìn)行骨修復(fù)。其優(yōu)勢為：轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可持續(xù)高效地表達(dá)特定功能因子以促進(jìn)其自身及其他效應(yīng)細(xì)胞的增殖與分化,從而能更好、更快地形成骨修復(fù)再生所需的組織;合成分泌的特定功能因子在缺損部位的濃度和活性更高,避免了外源性功能因子大劑量反復(fù)使用所帶來的副作用;載體的穩(wěn)定性好,半衰期長,持續(xù)時間足以滿足缺損修復(fù)再生的需要[35]。有學(xué)者將TGF-β1和BMP-2加載到殼聚糖上,然后與海藻酸鈉/透明質(zhì)酸/膠原(Alg/HA/Col)結(jié)合構(gòu)建頜骨支架,并對Alg/HA/Col頜骨支架的含水量、孔隙率、拉伸性能、生物相容性和成骨誘導(dǎo)分化能力進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)該方法能夠成功構(gòu)建一種全新的三維多孔頜骨支架,其孔徑為100～250 μm,孔隙率>90%,與正常骨組織極為接近,同時對ADSCs無細(xì)胞毒性,支架的ALP定量、OC表達(dá)量均上調(diào),這種三位支架具有廣泛的應(yīng)用前景[36]。Vakhshori[37]將編碼BMP-2的Lv轉(zhuǎn)導(dǎo)ADSCs后植入TCP/HAP載體上來評估大鼠股骨缺損的療效,實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)Lv的BMP-2(約0.48 μg)誘導(dǎo)形成的骨質(zhì)量與10 μg重組人BMP-2相當(dāng),在平均扭矩、扭轉(zhuǎn)剛度和扭轉(zhuǎn)致骨折的力度方面與正常骨比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4 總結(jié)與展望

ADSCs來源穩(wěn)定豐富,具有良好的成骨效應(yīng),是骨再生領(lǐng)域最有前景的種子干細(xì)胞之一。隨著基因載體的選擇性逐漸增加、復(fù)合支架的物理及化學(xué)特性,材料之間的融合技術(shù)日趨成熟,ADSCs在體外以及動物實驗中都取得了較大進(jìn)展。但基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在體內(nèi)的穩(wěn)定性,以及ADSCs向成骨、成軟骨分化的具體機(jī)制尚不明確,雖然偶有ADSCs應(yīng)用于臨床的治療報導(dǎo),但其安全性仍需進(jìn)一步評估。