劉 根 ，李世宗 ，信愛國，王怡敏，嚴(yán)紅亞，常志順，高 洪，李 珂

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明，650224；3.云南森林自然中心，昆明，650224）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）屬腸桿菌科（Enterobacteriaceae）變形桿菌屬，革蘭氏染色為形狀不一、兩端鈍圓的陰性短桿狀、球桿狀，無芽孢和莢膜，有鞭毛及菌毛，能侵襲生長的兼性厭氧菌［1］，是重要的人獸共患條件致病菌。Bisgaard［2］于1981 年首次從患輸卵管炎的產(chǎn)蛋雞中分離到奇異變形桿菌；江益民等［3］于1989 年在我國首次從病死肉雞中分離到奇異變形桿菌。近年來，奇異變形桿菌的分布范圍和寄主譜越來越廣，在食品、土壤、污水和動(dòng)物的腸道內(nèi)容物以及臨床標(biāo)本中均可以檢測到［4］。在家禽鴨［5］，家畜牛［6］、山羊［7］，野生動(dòng)物眼鏡蛇（Najasp.）［8］、北樹鼩（Tupaia belangeri）［9］、華南虎（Panthera tigris amoyensis）［10］和大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）［11］中均有感染案例發(fā)生。

馬來穿山甲（Manis javanica）屬于鱗甲目（Pholidota）鯪鯉科（Manidae）鯪鯉屬（Manis）［12］，是全球現(xiàn)存的8種穿山甲之一［13］，IUCN 將其列為極危（CR）物種［14］。本研究旨在查明疑似細(xì)菌感染的野生馬來穿山甲發(fā)病死亡原因，經(jīng)臨床剖檢、實(shí)驗(yàn)室診斷和細(xì)菌分離鑒定等得到1 株奇異變形桿菌，并開展了分離菌株的生物學(xué)特性研究。目前關(guān)于野生馬來穿山甲感染奇異變形桿菌的研究鮮有報(bào)道，本研究結(jié)果可為預(yù)防和控制野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌感染其他動(dòng)物提供科學(xué)的臨床治療和診斷依據(jù)，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 病料來源及試驗(yàn)動(dòng)物

病料取自1 只由野生動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)送檢的不明原因發(fā)病死亡的野生馬來穿山甲。成年小白鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 分離純化及生長特性

無菌挑取死亡野生馬來穿山甲的肝臟和肺臟組織，三區(qū)劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基（購自廣州環(huán)凱微生物有限公司），37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取疑似菌落于血瓊脂培養(yǎng)基分離純化。再挑取純化后的單菌落用革蘭氏染液（購自北京索萊寶科技有限公司）染色鏡檢，并劃線接種至麥康凱、SS和LB瓊脂培養(yǎng)基（購自廣州環(huán)凱微生物有限公司）上，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h，觀察菌落形態(tài)特征。獲得的純培養(yǎng)物置于50%甘油血清管中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生化試驗(yàn)

按照腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定盒（購自廣州環(huán)凱微生物有限公司）使用說明書，將分離菌株純培養(yǎng)物溶于生理鹽水管中，與5.0 麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，再接種至各生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間后觀察并讀取結(jié)果。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化樹分析

按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司）步驟提取分離菌株的基因組DNA，以其為模板，參照趙鶴庭等［15］方法擴(kuò)增16S rRNA，擴(kuò)增引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含目的條帶的產(chǎn)物及其對應(yīng)引物送至昆明碩擎生物有限公司雙向測序，測序結(jié)果利用SeqMan Ⅱ軟件拼接，將獲得的全長序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的參考菌株進(jìn)行BLAST 同源性比對，利用MEGA 7.0將來自GenBank中的已知參考菌株進(jìn)行多重序列比對，并采用最大似然法（maximum likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 細(xì)菌生長曲線

采用酶標(biāo)儀測量分離菌株的生長曲線。挑取上述純培養(yǎng)物于25 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每間隔1 h各取300 μL菌液于3個(gè)酶標(biāo)板孔中，測量OD600值。利用GraphPad Prism 軟件以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)菌生長曲線。

1.6 藥敏試驗(yàn)

選用恩諾沙星、復(fù)方新諾明等22 種臨床常用抗菌藥物（購自杭州濱和微生物試劑有限公司），采用K-B 紙片擴(kuò)散法測量抑菌圈大小，并參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）制定的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)來判定分離菌株的藥物敏感性［16］。具體操作：挑取純培養(yǎng)物于3 mL 滅菌PBS 中充分混勻，均勻涂布于血瓊脂培養(yǎng)基上，按一定間隔貼上藥敏片，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.7 細(xì)菌部分耐藥基因檢測

參照文獻(xiàn)［17］報(bào)道的細(xì)菌5大類15種耐藥基因引物序列（表1）及PCR 擴(kuò)增條件，進(jìn)行分離菌株的耐藥基因檢測，引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 耐藥基因引物序列Tab.1 Primer sequences of drug resistance genes

1.8 毒力基因檢測

參照楊霞等［5］關(guān)于奇異變形桿菌部分毒力基因研究的引物序列（表2），引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為25.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，溫度見表2，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 毒力基因引物序列及PCR擴(kuò)增條件Tab.2 Virulence gene primer sequences and PCR amplification conditions

1.9 小鼠致病性試驗(yàn)及病理切片觀察

將純化好的分離菌株經(jīng)LB 液體擴(kuò)增培養(yǎng)后 洗滌和富集菌體，溶于無菌生理鹽水中。使用分光光度計(jì)在OD420下調(diào)整菌液濃度，分為8.50×108、1.70×109、3.40×109、6.80×109、1.36×1010cfu/mL 5 個(gè)劑量組。每個(gè)劑量組對小鼠腹腔注射1 mL 菌液，空白對照組腹腔注射等量LB液體，4只/組，共24只，注射后每組分籠飼養(yǎng)，每隔6 h 觀察記錄小鼠死亡情況，連續(xù)觀察1周。

根據(jù)改良寇氏法：lgLD50=Xm-i（∑P-0.5）計(jì)算分離菌株對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）［18］，式中Xm為最大劑量組的對數(shù)值，i為相鄰兩劑量組對數(shù)劑量之差，P為死亡率。對死亡小鼠立即剖檢，無菌挑取肝臟和肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，根據(jù)參考文獻(xiàn)［19］報(bào)道的奇異變形桿菌OMPA 基因特異性引物（上游引物：5′-CGGAATTCATGAAAAAGACAGC-TATCGC-3′；下游引物：5′-TTGCGGCCGCTTATTGACCAGGTTGAACAAC-3′），通過PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證是否由該分離菌株導(dǎo)致的小鼠死亡。引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系為25.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，10.0 μmol/L 工作濃度的上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。分別取試驗(yàn)組和對照組小鼠肝臟和肺臟組織浸泡在4%多聚甲醛中固定后制備病理組織切片，觀察各組織病理變化情況。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢情況

野生馬來穿山甲發(fā)病時(shí)臨床癥狀為精神萎靡、身體蜷縮和食欲不振；死亡后舌脫離口腔，舌表面有大小不一的潰瘍灶，剖檢可見氣管喉頭處有少量膿性和黏性分泌物，肝臟淤血腫大，呈黑褐色，肺出血且黏膜水腫，其余組織器官未見明顯病變（圖1）。

圖1 野生馬來穿山甲肝臟（A）和肺臟（B）剖檢特征Fig.1 Anatomical characteristics of liver（A）and lung（B）of wild Manis javanica

2.2 細(xì)菌分離及形態(tài)學(xué)特征

分離菌株在麥康凱瓊脂、SS 瓊脂、血瓊脂和LB瓊脂培養(yǎng)基上均生長出圓形、表面光滑、邊緣整齊和形態(tài)均一的半透明灰白色單菌落（圖2A-D），生長過程中伴有腐敗臭味。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)為形狀不一的紅色桿狀、短桿狀和球桿狀（圖3）。

圖2 分離菌株形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the isolated bacteria

圖3 分離菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（1 000×）Fig.3 Gram staining result of the isolated strain（1，000×）

2.3 生化鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示：分離菌株能發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能發(fā)酵乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖；葡萄糖磷酸鹽胨水（MR）、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP）、硫化氫和尿素試驗(yàn)呈陽性；蛋白胨水、西蒙氏檸檬酸鹽試驗(yàn)呈陰性（表3）。生化鑒定結(jié)果與奇異變形桿菌的生化特征相符合，結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)與生化特性可初步判定該菌為奇異變形桿菌，將其命名為YN2018株。

表3 分離菌株生化特性鑒定結(jié)果Tab.3 Biochemical identification results of the isolated strain

2.4 16S rRNA測序及遺傳進(jìn)化樹分析

16S rRNA 分別擴(kuò)增出大小為500、750、560 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果拼接后獲得全長為1 387 bp 的序列。經(jīng)BLAST 比對分析后，發(fā)現(xiàn)與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知菌株P(guān)roteus mirabilisATCC 29906 的同源性達(dá)到100%。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可知，YN2018 株的16S rRNA 基因與奇異變形桿菌（ATCC 29906、JCM 1669 和M17_J16）的親緣關(guān)系最為接近，處于同一分支；與變形肥桿菌（Obesumbacterium proteus，NCIMB 8771）有一定差異；與?？茞鄣氯A氏菌（Edwardsiella hoshinae，JCM 1679）、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.，L3）和沙門氏菌（Salmonellasp.，D194-2）處于不同分支。因此，分離菌株YN2018株鑒定為奇異變形桿菌。

圖4 奇異變形桿菌16S rRNA核酸序列遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA nucleotide sequences of Proteus mirabilis

2.5 細(xì)菌生長曲線

細(xì)菌生長曲線表明YN2018株接種2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期；16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期（圖5）。

圖5 分離菌株YN2018株生長曲線Fig.5 Growth curve of the isolated YN2018 strain

2.6 藥敏試驗(yàn)

YN2018株對復(fù)方新諾明、羅紅霉素、林可霉素、多西環(huán)素和卡那霉素等14 種抗菌藥物耐藥；對頭孢他啶、大觀霉素和頭孢噻肟敏感度較高；對慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林、妥布霉素和鏈霉素中度敏感（表4）。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Drug sensitivity test result

2.7 細(xì)菌部分耐藥基因檢測

YN2018 株檢測到氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aadB，磺胺類耐藥基因sul1、sul2，四環(huán)素類耐藥基因dfrA1，其余2 種β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類耐藥基因均未檢測出（圖6）。

圖6 耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of resistant genes

2.8 細(xì)菌部分毒力基因檢測

YN2018 株的毒力基因檢測結(jié)果表明，mrpA、rsbA、ureC、zapA、rsmA、hpmA、fliL、ucaA、pmfA和atfA毒力基因均被檢測到（圖7），目的條帶大小和預(yù)期一致。

圖7 毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of virulence genes

2.9 小鼠致病性試驗(yàn)及病理切片觀察

試驗(yàn)組小鼠攻菌1 h后表現(xiàn)為身體蜷縮，呆立不動(dòng)，精神萎靡，食欲不振，被毛凌亂，6 h 后開始陸續(xù)死亡，48 h后再無死亡（圖8）。對照組小鼠行為表現(xiàn)均正常。從分離菌株對小鼠LD50的試驗(yàn)結(jié)果（表5）得出YN2018 株的半數(shù)致死量（LD50）為2.02× 109cfu/mL。死亡小鼠剖檢可見肝臟淤血腫大，肺臟充血出血，腸道腫脹其內(nèi)充滿黃色內(nèi)容物。從試驗(yàn)組死亡小鼠肝臟和肺臟組織中分離得到的病原菌生化特性和培養(yǎng)特性與YN2018 株一致，OMPA 鑒定除陰性對照外，均擴(kuò)增出與文獻(xiàn)［19］大小一致的1 107 bp的目的條帶（圖9）。病理組織切片結(jié)果可見試驗(yàn)組小鼠肝臟組織肝細(xì)胞壞死，胞核固縮深染，胞質(zhì)崩解，伴有中性粒細(xì)胞浸潤，血管及肝竇淤血并擴(kuò)張，肺臟組織的肺泡壁可見中性粒細(xì)胞浸潤，支氣管和血管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤，偶見血管重度擴(kuò)張，管腔不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞扁平化（圖10）。對照組小鼠肝臟和肺臟組織均正常。

圖8 不同濃度YN2018株對小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Pathogenicity test results of YN2018 strain with different concentrations on mice

圖9 奇異變形桿菌OMPA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.9 PCR amplification results of Proteus mirabilis OMPA gene

圖10 小鼠肝臟和肺臟病理組織切片（HE 200×）Fig.10 Histopathological observation of liver and lung in mice（HE 200×）

表5 分離菌株對小鼠LD50試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 LD50 test results of the isolated strain in mice

3 討論

野生動(dòng)物是多種人獸共患病病原體的潛在攜帶者和傳播者，與攜帶病原體的野生動(dòng)物接觸可造成人類和家畜感染，并存在人與人之間相互傳播的風(fēng)險(xiǎn)。奇異變形桿菌是重要的人畜共患條件致病菌，機(jī)體常因免疫力降低而感染發(fā)病，威脅家養(yǎng)畜禽、野生動(dòng)物和人的健康，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，雛雞感染該菌后可引起雛雞生長速度變慢和大批量死亡［20］；犢牛、成年牛［21］和豬［22］感染后可出現(xiàn)急性脫水腹瀉和死亡；母貉（Nyctereutes procyonoides）感染后可引起流產(chǎn)和發(fā)病死亡［23］。

本研究從發(fā)病死亡的野生馬來穿山甲肺臟組織中成功分離得到1 株致病菌，通過不同培養(yǎng)基形態(tài)觀察、革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)和生長特性與翟頎等［24］從竹鼠肺臟組織中分離得到的奇異變形桿菌相似，16S rRNA 基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果與奇異變形桿菌（ATCC 29906）高度同源且處于同一遺傳進(jìn)化分支，最終確定該致病菌為奇異變形桿菌。進(jìn)一步對該分離菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)該菌株生長繁殖快，對小鼠具有較強(qiáng)的致病性且病變明顯。菌株攜帶的毒力基因可能是影響致病過程和感染嚴(yán)重程度的主要因素。分析奇異變形桿菌攜帶毒力基因的情況有助于了解其致病性。相關(guān)研究表明，從導(dǎo)致鴨死亡的奇異變形桿菌中檢測出除rsbA的9種毒力基因［5］；從導(dǎo)致妊娠期母貉流產(chǎn)的奇異變形桿菌中檢測出除rsmA的9 種毒力基因［23］；從腹瀉動(dòng)物糞便中分離得到的奇異變形桿菌存在的最普遍的毒力基因是ureC，ureC被作為靶基因用于鑒定奇異變形桿菌［25］。本研究發(fā)現(xiàn)10 種已報(bào)道的奇異變形桿菌毒力基因均可在YN2018 株中被檢測到，結(jié)合動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果，這可能是導(dǎo)致YN2018株對小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)致病性并引起野生馬來穿山甲死亡的重要原因。

篩選抗菌敏感藥物是有效防治細(xì)菌性疾病的重要方式之一，但隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益突出，逐漸引起人們的重視。奇異變形桿菌的耐藥性問題同樣不容忽視，龐洪澤等［26］報(bào)道了在10 日齡雛雞中分離得到的奇異變形桿菌對環(huán)丙沙星、林可霉素等5 種抗菌藥物敏感；董貴等［27］研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致新疆羔羊腹瀉的奇異變形桿菌對新霉素、復(fù)方新諾明等12 種抗菌藥物敏感。本研究分離的YN2018 株僅對頭孢他啶、頭孢噻肟和大觀霉素等 8 種抗生素敏感，其余受檢抗生素均表現(xiàn)為耐藥，不同來源的奇異變形桿菌藥物敏感性存在差異，可能與分離菌株所含的耐藥基因、宿主地域差異、使用抗生素不同和抗生素殘留等因素有關(guān)。耐藥基因介導(dǎo)了菌株的耐藥性和耐藥表型，研究發(fā)現(xiàn)YN2018株耐藥基因檢出與耐藥表型存在一定差異，β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類耐藥基因均未檢出，但頭孢氨芐、氨芐西林和恩諾沙星等藥物表現(xiàn)為耐藥，與楊睿等［28］的奇異變形桿菌耐藥基因研究中喹諾酮類耐藥基因未完全檢出，但對喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為耐藥的結(jié)果相似；氨基糖苷類藥物耐藥基因aadA1、aadB被檢出，aadA2未被檢出，卡那霉素、新霉素表現(xiàn)為耐藥，其余氨基糖苷類藥物表現(xiàn)為敏感。據(jù)此推測，YN2018株可能存在本研究未涉及的其他耐藥基因所介導(dǎo)的耐藥性和耐藥表型，或存在其他耐藥機(jī)制，需待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究成功從野生馬來穿山甲肺臟組織中分離得到1 株奇異變形桿菌，命名為YN2018 株。該分離菌株攜帶的毒力基因種類較多，耐藥基因包括aadA1、aadB、sul1、sul2和dfrA1，藥敏試驗(yàn)表現(xiàn)為多重耐藥，對小鼠有強(qiáng)致病性。本試驗(yàn)對野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌的防治和研究提供參考。