唐成怡，吳玄燁，吳 盡，楊 帆，劉學(xué)東

（東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040）

CDK8 是細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclindependent kinases，CDK）家族的一員［1］，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控［2］，并以中介體復(fù)合物和CDK8亞基復(fù)合物的形式參與調(diào)控NOTCH 信號通路［3］、Wnt/β-catenin 信號通路［3-5］。當(dāng)下，關(guān)于CDK8的研究集中于腫瘤細(xì)胞中的功能及靶向CDK8的腫瘤抑制劑方面，對野生動物CDK8的研究相對較少。

鹿茸為雄性鹿科（Cervidae）動物未骨化而帶茸毛的角，每年周期性地生長發(fā)育，然后脫落。鹿茸是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動物器官，可被用作研究器官再生的生物學(xué)模型［6］。鹿茸生長由軟骨內(nèi)骨化所驅(qū)動，涉及軟骨發(fā)育、骨化、血管生長和神經(jīng)發(fā)育等生理過程。NOTCH 信號通路和Wnt/β-catenin 通路能促進(jìn)鹿茸軟骨細(xì)胞的增殖和分化［7］，在鹿茸軟骨形成過程中扮演重要角色［8］。而CDK8 作為轉(zhuǎn)錄機(jī)器中介體復(fù)合物的重要組成部分，在鹿茸再生中的功能尚無研究。為研究CDK8 是否在馬鹿（Cervus elaphus）鹿茸的再生發(fā)育中起作用，本研究克隆了馬鹿CDK8基因編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時利用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測CDK8的mRNA 在馬鹿鹿茸各組織中的表達(dá)差異，為了解鹿茸再生過程中CDK8 的作用機(jī)制與功能提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為馬鹿的遺傳資源保護(hù)與利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022 年7 月，在秦皇島野生動物園采集雄性鹿茸，消毒殺菌去除表面茸毛后，將表皮層、間充質(zhì)層、前軟骨和軟骨分離并剔除多余組織，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的小塊，放入裝有組織保存液的 1.5 mL離心管中，冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鹿茸總RNA的提取和cDNA的合成

將組織塊取出稱量，液氮研磨后按RNA 提取試劑盒（南京諾維贊生物科技股份有限公司）說明書提取RNA，并用NanoDrop One（賽默飛公司）測定提取RNA 的濃度及純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾維贊生物科技股份有限公司）說明書合成總cDNA，冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CDK8基因CDS區(qū)擴(kuò)增和克隆

引物設(shè)計：參照GenBank上預(yù)測的馬鹿CDK8基因（GenBankXM_043891847.1）序列和GAPDH基因（XM_043881239.1），在Primer Premier5 軟件設(shè)計擴(kuò)增CDS 區(qū)引物，在Primer3 input（https：//primer3.ut.ee/）在線設(shè)計qPCR 引物，送哈爾濱睿博興科（東北）生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

用PCR 儀擴(kuò)增（型號SEDI G，威泰克（香港）有限公司），PCR 擴(kuò)增體系為50 μL：2×RapidTaqMaster Mix（南京諾維贊生物科技股份有限公司）25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；產(chǎn)物4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測（電泳儀型號Power-PacTMHV，Bio-Rad（美國）公司），回收擴(kuò)增成功的目的條帶，再次利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One檢測質(zhì)量及濃度。

將純化后的PCR 產(chǎn)物與pMD-18T 載體（寶生物工程（大連）有限公司）連接，連接體系10 μL：pMD-18T 載體1 μL，PCR 產(chǎn)物2 μL，ddH2O 2 μL，Solution Ⅰ 5 μL；16 ℃連接30 min。連接完成后取3 μL 產(chǎn)物與30 μL 大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司）混合轉(zhuǎn)化，涂布到含氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h，隨后挑取陽性菌落于500 μL 含氨芐抗性的液體LB 培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)，4 h后進(jìn)行菌液PCR驗證。

將驗證成功的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后送往哈爾濱睿博興科（東北）生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，利用DNAStar 軟件查看峰圖，對序列拼接，并將序列翻譯為氨基酸序列。

1.4 CDK8 基因生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將測序所獲得的馬鹿CDK8基因序列及翻譯后的氨基酸序列與在NCBI 獲得的家馬（Equus caballus）、普氏野馬（Equus przewalskii）、山羊（Capra hircus）、野豬（Sus scrofa）、小家鼠（Mus musculus）、川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）、紅原雞（Gallus gallus）、艾草松雞（Centrocercus urophasianus）、美國鰣魚（Alosa sapidissima）、斑馬魚（Danio rerio）和人（Homo sapiens）的CDK8氨基酸序列比對，并利用SnapGene、MEGA 5.0 軟件將以上氨基酸序列進(jìn)行相似性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

利用ExPASy 服務(wù)器ProtScale 模塊（https：//web.expasy.org/protscale/）對馬鹿CDK8基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性預(yù)測，利用在線分析工具SignalP 4.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）對CDK8 蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，運(yùn)用在線分析工具DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）對CDK8 蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析，用NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1）進(jìn)行磷酸化預(yù)測，再使用SOPMA 在線分析網(wǎng)站預(yù)測馬鹿CDK8基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html），并 用SWISS-MODEL 同源建模法（https：//swissmodel.expasy.org/）對馬鹿CDK8基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 CDK8基因?qū)崟r熒光定量分析

以合成的表皮層、間充質(zhì)層、前軟骨和軟骨組織的cDNA 稀釋液為模板進(jìn)行熒光定量PCR（熒光定量PCR 儀型號CFX96，Bio-Rad（美國）公司），測量CDK8在馬鹿鹿茸不同組織內(nèi)的表達(dá)量；以GAPDH為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計算CDK8在不同組織中的相對表達(dá)量，使用引物見表1，每個樣本設(shè)置3 個重復(fù)孔。反應(yīng)體系：模板4.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）10.0 μL，ddH2O 5.2 μL，總體系為20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)。為驗 證引物的特異性，設(shè)置熔解曲線程序：95 ℃變性 10 s，由65 ℃升溫到95 ℃，每5 s 上升0.5 ℃并讀板1次。

2 結(jié)果

2.1 馬鹿CDK8基因CDS區(qū)克隆

以馬鹿鹿茸茸皮組織cDNA 為模板擴(kuò)增CDK8基因CDS 區(qū)，電泳后獲得約1 300 bp 的特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。條帶回收后與pMD-18T載體連接并轉(zhuǎn)化，選取菌液PCR陽性樣品送測序，將測序結(jié)果與不同物種的CDK8及馬鹿CDK8基因 各轉(zhuǎn)錄本比對，測序結(jié)果與人、鼠和羊等物種的CDK8高度相似，與馬鹿CDK8的預(yù)測轉(zhuǎn)錄本4 完全一致，證明馬鹿中確實存在轉(zhuǎn)錄本4 且被克隆成功。

圖1 馬鹿CDK8基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of CDK8 gene CDS region in red deer

2.2 馬鹿CDK8蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列同源性比對與進(jìn)化樹分析

馬鹿、普氏野馬、山羊、人、小家鼠、紅原雞和斑馬魚等物種的CDK8 蛋白序列比對結(jié)果顯示：該蛋白在哺乳類、鳥類間的相似性高達(dá)98%以上，在哺乳類、鳥類和魚類間的相似性達(dá)93%以上（圖2）；進(jìn)化樹結(jié)果也顯示CDK8 在各物種間進(jìn)化保守（圖3），說明該蛋白在各物種內(nèi)的功能及作用機(jī)制相對保守。

圖2 不同種屬的CDK8蛋白相似性Fig.2 Comparison of CDK8 protein similarities among different species

圖3 不同種屬CDK8蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree ofCDK8 protein among different species

2.2.2 CDK8蛋白質(zhì)分析

理化性質(zhì)：CDK8分子式為C2125H3286N588O631S18，用ProtParam 分析該蛋白序列，馬鹿的CDK8基因CDS全長為1 254 bp，共編碼417 個氨基酸，含量最多 的為亮氨酸（7.9%）；相對分子質(zhì)量為47 744.11，理論等電點（pI）為7.28，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）和帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）均為55。親水性平均值為-0.759，為親水性蛋白，脂肪系數(shù)66.19，不穩(wěn)定系數(shù)40.12，是不穩(wěn)定蛋白。

親疏水性與跨膜區(qū)域：采用在線分析工具ProtScale 中Hphob./Kyte &Doolittle 算 法，以19 為 1 個閱讀框（大于1.6 的區(qū)域為疏水區(qū)，小于-1.6 的區(qū)域為親水區(qū)，1.6～-1.6 的區(qū)域為兩性區(qū)域），對蛋白質(zhì)的親疏水性進(jìn)行分析（圖4A），最大值為1.268，最小值為-3.037，且親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，與Prot-Param 預(yù)測結(jié)果一致，屬親水性蛋白，無跨膜區(qū)域。用DeepTMHMM 對該蛋白進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果顯示無跨膜區(qū)域，與ProtScale預(yù)測結(jié)果一致。

圖4 馬鹿CDK8蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of red deer CDK8 protein

信號肽與亞細(xì)胞定位：SignalP 4.0 分析預(yù)測結(jié)果顯示CDK8 蛋白質(zhì)不具有信號肽（圖4B）。用WoLF PSORT 工具預(yù)測CDK8蛋白的亞細(xì)胞定位，分?jǐn)?shù)分別為細(xì)胞核17.00，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)15.67，細(xì)胞質(zhì)12.00，線粒體7.70，說明CDK8 蛋白可能定位在細(xì)胞核中。

磷酸化位點：用NetPhos 3.1 預(yù)測CDK8 蛋白的氨基酸磷酸化位點，用NetOGlyc 4.0 程序預(yù)測糖基化位點。結(jié)果表明，CDK8 蛋白有38 個可能的磷酸化位點（圖4C），分別為4 個酪氨酸（Tyr）、16 個蘇氨酸（Thr）和18 個絲氨酸（Ser）；CDK8 蛋白具有25 個可能的糖基化位點。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：用在線軟件SOPMA 對CDK8 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，CDK8 蛋白主要以無規(guī)則蜷曲為主，占53.96%，其次為α-螺旋和延伸鏈，分別占29.98%、12.47%，最少的是β轉(zhuǎn)角，占3.60%（圖4D）。

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：用在線分析軟件ExPASy中的SWISS-MODEL Work space 程序預(yù)測馬鹿CDK8蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（圖4E），相似性達(dá)99.72%，GMQE 為0.72（取值為0～1，值越大可信度越大），以無規(guī)則蜷曲和α螺旋為主，結(jié)構(gòu)較松散，可能與其在復(fù)合物中的支架作用有關(guān)。

2.3 CDK8 基因在馬鹿鹿茸各組織中的相對表達(dá)量

利用RT-PCR 技術(shù)檢測CDK8基因在馬鹿鹿茸各組織中的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法分析，結(jié)果如圖5 所示。經(jīng)t檢驗和單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)CDK8在馬鹿鹿茸各組織間的mRNA表達(dá)水平差異顯著（P＜0.000 1）。4種組織中，CDK8在茸皮中表達(dá)量最高，其后依次是間充質(zhì)和軟骨，前軟骨中CDK8表達(dá)水平最低。以前軟骨為對照組，表達(dá)量為（1.00±0.03），茸皮、間充質(zhì)和軟骨的相對表達(dá)量依次是（4.22±0.38）、（2.71±0.21）和（1.94±0.25）。

圖5 馬鹿CDK8在鹿茸各組織中的表達(dá)差異Fig.5 mRNA relative expression of CDK8 gene in different tissues of red deer antler

3 討論

本研究成功克隆了馬鹿CDK8基因CDS 區(qū)序列，該序列長1 254 bp，共編碼417 個氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白在馬鹿、山羊、家馬、普氏野馬和紅原雞等物種間的相似性高達(dá)98%以上，在哺乳類、鳥類和魚類間達(dá)93%以上，說明CDK8在物種間保守性較高，生理功能作用機(jī)制相似，該基因在不同物種間的研究結(jié)果有較高的參考意義。

對馬鹿CDK8 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析，結(jié)果顯示CDK8分子式為C2125H3286N588O631S18，相對分子質(zhì)量為47 744.11，理論等電點為7.28，是親水性、無信號肽和無跨膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定蛋白，有 38 個可能的磷酸化位點。磷酸化、乙?；图谆鹊鞍椎姆g后修飾可以調(diào)節(jié)蛋白的激活、滅活和降解。已有研究用蛋白質(zhì)組學(xué)方法找出8 個CDK8蛋白的磷酸化位點，但不同位點的修飾對CDK8 功能的調(diào)節(jié)作用還有待研究［9-10］。CDK8 二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白有大量的無規(guī)則卷曲和α螺旋，三級結(jié)構(gòu)與很多蛋白相比較松散，這可能與該蛋白的功能有關(guān)。CDK8 可作為支架結(jié)合Med12、Med13 和周期蛋白C（cyclin C）形成CDK8 亞基復(fù)合物，以獨(dú)立于中介體復(fù)合物的形式行使組蛋白激酶的功能［11］。

馬鹿鹿茸不同組織中，茸皮和間充質(zhì)層的CDK8表達(dá)量最高，CDK8可能在茸皮和間充質(zhì)組織中起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。馬鹿鹿茸中茸皮與間充質(zhì)在最外層，生長最快，細(xì)胞增殖和分化也快。CDK8在很多癌癥細(xì)胞中被認(rèn)為是原癌基因，有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。在乳腺癌中，CDK8在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，用miR-26b 抑制CDK8的表達(dá)，可以抑制癌細(xì)胞的增殖，并使人乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231、MCF-7 周期停止［12］。但在子宮內(nèi)膜癌中，CDK8表現(xiàn)為抑癌基因，在內(nèi)源CDK8低表達(dá)的KLE細(xì)胞中使CDK8過表達(dá)，在體內(nèi)小鼠模型中，抑制細(xì)胞增殖，有效阻斷腫瘤生長，并在體外試驗Transwell中抑制細(xì)胞遷移；而在內(nèi)源CDK8高表達(dá)的AN3 CA和HEC-1A 細(xì)胞系中敲除CDK8結(jié)果則恰好相反［13］。在包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞模型中，CDK8還能驅(qū)動上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化。CDK8可通過招募YAP1控制對TGF-β/BMP 骨形態(tài)發(fā)生蛋白敏感的SMAD 轉(zhuǎn)錄激活和周轉(zhuǎn)，SMAD1在廣泛的癌癥模型中以嚴(yán)重依賴于基質(zhì)剛度和YAP1 的方式驅(qū)動上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化（EMT）［14］。在胰腺癌中，突變的K-ras激活CDK8，部分CDK8通過Wnt/β-catenin 信號通路刺激胰腺癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［15］。

CDK8在鹿茸前軟骨中的表達(dá)量比軟骨高，比茸皮和間充質(zhì)低，可能與CDK8調(diào)節(jié)軟骨分化，維持骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)作用相關(guān)。研究人員在用TGF-β誘導(dǎo)梅花鹿（Cervus nippon）、塔里木馬鹿（C.elaphus yarkandensis）鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化過程中，檢測到多個Wnt家族基因表達(dá)量增加，初步說明Wnt 通路對軟骨及軟骨骨化有重要的影響［16-17］。除大量研究證明CDK8可調(diào)控Wnt 通路外，小鼠遺傳研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的CDK8通過CDK8-RANKL-STAT1軸控制破骨細(xì)胞形成，在骨吸收和體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用［18］。所以推測CDK8可能參與鹿茸的生長發(fā)育，本研究結(jié)果也表明，鹿茸不同組織間的CDK8的mRNA 表達(dá)水平有差異。下一步可通過在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)/敲減CDK8，進(jìn)一步研究與軟骨及骨化有關(guān)的CDK8下游基因。

相比于CDK8調(diào)控下游基因的研究，CDK8上游基因研究較少，對調(diào)控CDK8上游因子研究多集中于miRNA，在一些腫瘤細(xì)胞試驗中略有提及CDK8的調(diào)控通路，在乳腺癌細(xì)胞中Skp2 與CDK8 與腫瘤狀態(tài)呈正相關(guān)，與mH2A1呈負(fù)相關(guān)。Skp2可泛素化mH2A1，敲低Skp2 使mH2A1 上調(diào)、CDK8 下調(diào)，腫瘤增殖減小［19］。目前以CDK8 為靶點的腫瘤治療方式引起高度關(guān)注，但多以化學(xué)類CDK8 抑制劑為主，僅有極少數(shù)抑制劑進(jìn)入臨床研究。研究CDK8的作用及調(diào)控機(jī)制在鹿茸生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展與抑制方面都有重大意義，后續(xù)可就CDK8對馬鹿不同組織細(xì)胞增殖、分化的具體作用做深入研究。