夏志強，單云芳，李俊芳，張慶勛，賀永惠，崔艷紅，鐘震宇，柏 超，張成林，白加德，孟慶輝

（1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院北京麋鹿生態(tài)實驗中心，北京，100076；2.河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，新鄉(xiāng)，453003；3.圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京動物園管理處，北京，100044）

有角動物存在于有蹄類反芻動物分支中，現(xiàn)存約80 個屬，近300 個種，超過30 億的個體［1］，其角可以分為骨質(zhì)角和角質(zhì)角2 個類群，鹿類是現(xiàn)存具骨質(zhì)角的哺乳動物類群［2］。牛羊的角因內(nèi)含骨質(zhì)核［3］，終生不脫落，隨年齡增長逐漸變粗大，幼齡階段如因營養(yǎng)緊缺生長受限，待成年營養(yǎng)解除限制后，也無法代償性恢復(fù)生長［4］；而鹿角則不同，會周期性全部脫落，留下骨柄［5］，并在1～2個月內(nèi)實現(xiàn)完全再生，后期逐漸骨化和脫落茸皮，把骨質(zhì)角裸露在外，作為性選擇重要特征，參與繁殖爭霸［6］。出生后雄鹿角柄的激活對于鹿角的生長極為重要［7］，鹿類角柄的青春期發(fā)育對于鹿的個性與等級序位形成［8］、鹿角大?。?］、爭奪配偶［10］、種間競爭［11］及應(yīng)對天敵［12］等有重要的意義。

麋鹿（Elaphurus davidianus）屬季節(jié)性繁殖動物，作為其強大攻擊和保護性武器的角，分枝向后與生境形成了完美匹配，成功占據(jù)了濕地生態(tài)位，導(dǎo)致其從演替出現(xiàn)直至滅絕都尚未走出濕地的死胡同窘境，成就了“成也麋鹿，敗也麋鹿”局面［13］。經(jīng)過近38年的保護努力，中國境內(nèi)共有10 000余頭麋鹿，重新恢復(fù)了野生種群，但是遺傳多樣性指數(shù)仍然較低，除大豐和石首2 種群超過1 000 頭外，其他分布地麋鹿均在200 頭以下且隨時可能面臨再次滅絕的風(fēng)險，因此需要加強麋鹿保護界的居安思危和對麋鹿保護重啟新的重視［14］。本研究利用紅外測距儀，開展麋鹿角柄生長發(fā)育規(guī)律的宏觀測量；對不同年齡組1歲、2歲和3歲的角柄骨膜組織取樣，對信號通路表達和血液樣品激素水平進行檢測。角不僅可作為動物本身重要的性選擇標(biāo)志，對于人類醫(yī)學(xué)也具有重要研究價值，針對麋鹿角柄骨膜發(fā)育的初步研究，以期為幼齡鹿類的飼養(yǎng)管理、鹿品種培育、茸再生、再生醫(yī)學(xué)和中藥材應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1985 年從英國烏邦寺重引進的麋鹿，半散放于北京南海子，平均海拔9.6 m，年均氣溫13.1 ℃，年均降水量約600 mm，常年濕度30%～70%，年均日照時間5 000～6 200 h，無霜期（132.0±9.7）d［15］。麋鹿種群自由采食、飲水和繁衍，雄性麋鹿冬季解角。因受生態(tài)承載力限制，北京麋鹿種群常年維持在160～220頭，每年出生幼子50頭左右，其中雄性15～30頭。

試驗選取健康無病、體況優(yōu)良、同父異母和出生日期（2018年4月5—25日）接近的雄性麋鹿，依出生時間佩戴耳標(biāo)以阿拉伯?dāng)?shù)字編號。試驗麋鹿飼養(yǎng)方案：每日09：00、15：30各投喂1次，自由飲水，符合北京麋鹿苑麋鹿四季飼養(yǎng)管理方案，粗料為主，精料為輔［15］。

試驗分2 組，分別是角柄發(fā)育前、角柄發(fā)育后兩階段，其中角柄發(fā)育后階段又分為首次生茸前（12月1—22 日）和生茸期（12 月23 日—翌年3 月15 日）。血樣采集于2020 年1 月—2022 年12 月，每月第1 周周一上午，其中2020 年29 份，2021 年27 份，2022 年 20份，共76份。

1.2 研究方法

1.2.1 角柄發(fā)育與骨膜取樣

每日飼喂的同時觀察和測量幼齡麋鹿角柄發(fā)育及生茸狀況。對不同發(fā)育階段的角柄拍照，記錄角柄發(fā)育過程和生茸過程中頂端傷口愈合、分枝時間。角脫落后記錄編號，切取鹿角基部第1 片橫切片（厚1 mm），稱其質(zhì)量［15］。2020、2021和2022年分別于生茸前和生茸期進行角柄皮下骨膜組織采樣，軟尺測量茸長度，記錄左、右側(cè)茸發(fā)育情況。組織取樣后立刻送回實驗室，分別浸泡在甲醛液中固定，-80 ℃冷凍保存。

1.2.2 血液激素水平檢測

采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測定血清中的激素含量，提前將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡1～2 h。（1）加樣：標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；待測樣品孔中先加稀釋液40 μL，再向孔底部加入血清樣品10 μL，輕晃均勻。（2）加酶：除空白孔外，每孔加入100 μL。（3）溫育：封板，干燥箱中37 ℃溫育60 min。（4）配液：洗滌液稀釋后備用。（5）洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)5次。（6）顯色：加入顯色液A 50 μL，顯色液B 50 μL，混勻后置于37 ℃避光顯色15 min。（7）終止：加終止液50 μL 終止反應(yīng)。（8）測定：450 nm 波長測量各孔的吸光度（OD 值）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算實際濃度。

1.2.3 信號通路檢測

稱取樣品組織，利用Trizol 法提取組織RNA，并通過紫外分光光度計檢測RNA 樣品濃度及純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后將樣品稀釋分裝保存。參照NCBI 網(wǎng)站提供的馬鹿基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計所需引物，所有引物均由北京擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果均符合正態(tài)分布，齊次性檢驗中，若方差齊時選擇LSD 法檢驗各個水平間存在的差異；若方差不齊時選擇Tamhane’s T2 檢驗總體方差不等的兩組之間的差異，通過使用ANOVA 分析及LSD多重比較來分析不同激素的年度變化及判斷不 同激素與角柄及茸再生的相關(guān)性差異。顯著性水平α＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 角柄發(fā)育

初生仔鹿額部未表現(xiàn)隆凸，僅有左右對稱的逆序毛旋，旋毛稍長、色深；雄性麋鹿在第1 年秋季開始出生后的角柄發(fā)育，由毛旋處長出骨質(zhì)突起，逐漸形成初角基，是茸角生長的基礎(chǔ)；翌年2—3 月角柄長度2.5～3.0 cm，初角茸不分枝，與成年麋鹿不同，5—6月陸續(xù)開始首次生茸，冬至脫落，形成完整的角柄。經(jīng)初角茸后，角柄繼續(xù)發(fā)育，直至體成熟，角柄骨膜不斷地持續(xù)增殖，在此期間，鹿角每年發(fā)生周期性脫落，翌年茸再生變大分枝增多；角柄逐漸變粗變短，至完全成熟（圖1）。

圖1 幼齡階段雄性麋鹿角柄發(fā)育Fig.1 Antler pedicle development in young male Père David’s deer

亞成體麋鹿角脫落與再生期角柄的發(fā)育，也主要經(jīng)歷生茸初期、快速生長期及生茸后期等階段。（1）生茸初期，脫角形成的碗狀傷口1～2 d 結(jié)痂，傷口周圍“皮膚環(huán)”增殖變厚，是茸生長的基礎(chǔ)［8］。生茸8～9 d 表面開始長出稀疏淺白色茸毛，中心傷口結(jié)痂也不斷向內(nèi)收縮變小，鹿茸主枝形成，生長速度逐漸加快。此階段，角柄逐漸恢復(fù)營養(yǎng)供給，變粗大，骨芯代償加快，皮膚和血管也開始活躍，代謝加速，為下一階段茸快速生長做足準(zhǔn)備。（2）快速生長期，茸主枝增長到一定長度后頂端出現(xiàn)2 個生長中心（生茸23～25 d），待眉枝完全出現(xiàn)（生茸30 d 左右），結(jié)痂脫落，傷口處完全愈合且不留疤痕，是皮膚再生能力的體現(xiàn)［9］。此時，角柄代謝達到 最旺盛狀態(tài)，局部血液循壞加快，角柄秋季萎縮 造成的阻塞管道全部打通，營養(yǎng)供給達年度最高峰，角柄和茸生長最快。（3）生茸后期，鹿茸成型并逐漸停止增長（生茸70 d），鹿茸開始骨化變硬，茸皮逐漸脫落，最終形成堅硬鹿角。角柄也逐漸開始萎縮，血管封閉，鈣磷代謝減慢，并有少部分礦物質(zhì)回流（表2）。

表2 鹿茸生長階段及角柄特征變化Tab.2 Characteristics of Père David’s deer antler and pedicle in different growth stages

隨年齡增長角柄不斷地變粗成熟，雄鹿由于每年生茸前，角柄內(nèi)部鈣質(zhì)被吸收，脫落時帶走了部分死亡的細(xì)胞和骨質(zhì)，老年后角柄逐漸縮短，角基盤和生長面不斷擴大和下移；解角后，創(chuàng)面逐年變大，封口時間逐年延長。

2.2 角柄發(fā)育參數(shù)

青春期角柄第2 次發(fā)育后，隨年齡增長，逐漸變粗；老年后隨脫落次數(shù)增多，角柄逐漸變短。角柄圍長由2 歲時的（17.17±1.00）cm 增加到3 歲時的（35.43±0.83）cm，差異極顯著（F1，9=4.128 1，n=9，p=0.005 3）；角柄直徑由2 歲時的（3.66±0.59）cm 增加到3歲時的（5.91±0.72）cm，差異極顯著（F1，9=3.174 0，n=9，p=0.024 6）；角橫切面外徑長由2 歲時的（10.30±1.25）mm增加到3歲時的（32.50±3.11）mm，差異極顯著（F1，9=5.266 1，n=9，p=0.000 9）；角橫切面外徑寬由2 歲時的（7.60±0.83）mm 增加到3 歲 時的（27.50±1.84）mm，差異極顯著（F1，9=4.820 3，n=9，p=0.001 5）（表3）。

表3 不同年齡段麋鹿角柄生長數(shù)據(jù)Tab.3 Growth data of Père David’s deer antler pedicle at different ages

2.3 血液激素水平

幼齡雄性麋鹿睪酮的分泌水平與角柄發(fā)育密切相關(guān)，生長素、IGF-1 與角柄發(fā)育也存在關(guān)聯(lián)。睪酮分泌水平由1 歲時的（564.27±41.16）pg/mL 增加到3 歲時的（737.96±66.57）pg/mL，差異極顯著（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2）；生長素分泌水平由1 歲 時的（3.10±0.32）ng/mL 增加到3 歲時的（6.60± 0.57）ng/mL，差異顯著（F1，9=2.511 5，n=9，p=0.035 9）；IGF-1 分泌水平由1 歲時的（122.55±12.21）ng/mL增加到3 歲時的（169.13±33.18）ng/mL，差異顯著（F1，9=2.773 0，n=9，p=0.020 1）（表4）。

表4 不同年齡段幼齡雄性麋鹿血液激素水平Tab.4 Blood hormone levels of young male Père David’s deer at different ages

2.4 信號通路表達水平

信號通路TGF-β/Smads 與幼齡麋鹿角柄骨膜發(fā)育有關(guān)。TGF-β1mRNA 相對表達水平由角柄萌發(fā)前的（1.07±0.04）增加到3 歲時的（4.47±1.14），差異極顯著（F1，9=3.711 7，n=9，p=0.006 6）；TGF-β1RmRNA 相對表達水平由角柄萌發(fā)前的（0.96±0.07）增加到3 歲時的（2.01±0.34），差異極顯著（F1，9=3.332 9，n=9，p=0.009 9）（表5）。

表5 幼齡麋鹿角柄組織mRNA相對表達情況Tab.5 mRNA relative expression in antler pedicle tissues of young male Père David’s deer

3 討論

不同鹿科（Cervidae）動物因分布緯度不同，占據(jù)生態(tài)位不同，丘陵狍（Capreolus pygargus）、林緣梅花鹿（Cervus nippon）、高山森林馬鹿（C.elaphus）和平原濕地麋鹿的鹿角脫落周期節(jié)律與繁殖期節(jié)律各異［16］。平原濕地麋鹿因生態(tài)位決定［13］需要在5 月底開始圈群、打斗、爭奪配偶和繁殖［17］，所以須在嚴(yán)寒冬季，微調(diào)內(nèi)分泌水平和相關(guān)因子表達水平，提前開始舊角脫落和新茸再生，使其在發(fā)情期到來之前形成堅實的硬角，參與競爭繁殖。而幼齡麋鹿與成年麋鹿不同［15］，出生后第2年5—6月開始首次生茸（出生后第2年2—3月角柄生長長度為2.5～3.0 cm，為初角基），冬至脫落，此時形成完整的角柄［18］。青春期麋鹿經(jīng)初角茸后，角柄則繼續(xù)發(fā)育，直至體成熟［19］，角柄骨膜不斷地持續(xù)增殖，在此期間，鹿角每年發(fā)生周期性脫落，翌年茸再生變大在原來基礎(chǔ)上分枝逐漸增多［8，20］，推測角柄骨膜細(xì)胞具有記憶功能。

本研究表明，青春期雄性麋鹿睪酮分泌水平與角柄發(fā)育密切相關(guān)（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2），生長素、IGF-1 與角柄發(fā)育存在關(guān)聯(lián)，信號通路TGFβ/Smads 也參與了角柄骨膜的發(fā)育。TGF-β1 可能收到來自雄激素刺激的下游信號激活鹿茸角柄骨膜組織細(xì)胞膜上的受體，隨后由Smad2、Smad3 將信號傳遞到角柄骨膜組織細(xì)胞核內(nèi)并與Smad4 結(jié)合形成復(fù)合物，識別靶基因并調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達，最終完成信號的傳遞和角柄的增殖。結(jié)果顯示，在角柄骨膜快速增殖的細(xì)胞分裂階段，TGF-β/Smads通路十分活躍，說明TGF-β1 還能通過參與調(diào)節(jié)鹿茸骨膜細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期，增加S 期細(xì)胞比例，并可能促進細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，參與骨膜細(xì)胞增殖。

角柄是鹿茸周期性再生的基礎(chǔ)［21］。幼齡鹿類角柄發(fā)育及調(diào)控研究目前仍進展緩慢，本研究對麋鹿角柄發(fā)育及機制開展了初步研究，探討了幼齡階段雄性麋鹿激素發(fā)育水平的變化規(guī)律與相關(guān)分子表達情況，為持續(xù)開展麋鹿角柄發(fā)育、舊角脫落與新茸冬至再生多樣化機制奠定了基礎(chǔ)，對提高幼齡鹿類的管理與福利水平等有重要實際應(yīng)用意義。

致謝：本研究是在北京麋鹿生態(tài)實驗中心多位員工的參與下共同完成的，在此對所有參與人員表示感謝。