楊佳欣，王遠(yuǎn)微

（西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點實驗室，四川 成都 610041）

奇異變形桿菌是一種條件性致病菌，當(dāng)機體免疫力下降時會引起肺炎、尿路感染、腸炎等病癥，同時它又是引起人類食物中毒的病原之一。近年來由奇異變形桿菌引發(fā)的動物疾病越來越多，發(fā)病動物的日齡較小，臨床表現(xiàn)主要是腹瀉，耐過動物的生長發(fā)育也會嚴(yán)重受阻，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成很大的損失。2023年3月16日，甘孜州某藏豬場的仔豬出現(xiàn)高體溫、低食欲、精神萎靡、喜臥地不愿活動、呼吸困難、拉稀等癥狀，送檢發(fā)病仔豬的腸道樣本到本實驗室進行檢測。筆者對臨床送檢的病料進行了細(xì)菌分離以及形態(tài)學(xué)、染色特性、生化特性及16S rDNA基因同源性分析等一系列鑒定，并作藥敏檢測，以期為發(fā)病養(yǎng)殖場防控該病提供治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣本 臨床樣品采集自甘孜州某藏豬場發(fā)生腹瀉的斷奶仔豬的十二指腸。

1.2 主要試劑和儀器 LB 液體培養(yǎng)基、革蘭氏染液、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、SS培養(yǎng)基、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)；細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR 聚合酶預(yù)混液，諾唯贊生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；核酸染料、DNA MarkerII、電泳緩沖液，全式金生物有限公司生產(chǎn)；電泳儀、照膠儀、PCR 儀，生物安全柜，電子天平，普通光學(xué)顯微鏡，高壓鍋和恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 細(xì)菌的分離純化 用灼燒冷卻后的接種環(huán)無菌蘸取腸道樣本劃線接種TSA 培養(yǎng)基和SS 培養(yǎng)基，做好標(biāo)記，37 ℃培養(yǎng)24 h后，從TSA培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上選擇2～3個疑似菌落進行染色鏡檢。將鏡檢后的菌落接種到SS 培養(yǎng)基上獲得純培養(yǎng)物，將純化細(xì)菌接種到5 mL LB 液體培養(yǎng)基中擴繁，將擴繁后的純培養(yǎng)物保存于終濃度為20%的甘油中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生化鑒定 將新鮮的分離菌接種于生化鑒定管中，觀察微量生化鑒定管的反應(yīng)情況，結(jié)合生化編碼鑒定管說明書，對分離菌進行生化鑒定。

1.5 16S rDNA序列同源性分析 將分離菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，使用DNA提取試劑盒提取分離菌的總DNA。用16S rDNA通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增分離細(xì)菌的16S rDNA基因片段。反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，2×Tan Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL，共20 μL。按照如下反應(yīng)條件進行PCR 反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸10 min。配制1.2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳（120 V電壓，100 mA電流），待PCR 產(chǎn)物充分分離時放入照膠儀上拍照。將符合預(yù)期大小的目的條帶送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序獲得的序列與NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，鑒定屬種。

1.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗。將單克隆菌落取出制成菌液，在無菌條件下將菌液涂布于平板之上，靜置等待水分被吸收干凈后，將藥敏紙片分區(qū)放置于平板內(nèi)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測量每個藥敏片的抑菌圈直徑，根據(jù)產(chǎn)品說明書判斷細(xì)菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果 從病料中分離到的細(xì)菌能很好地生長于SS瓊脂培養(yǎng)基上，形成邊緣略微透明、表面濕潤光滑、中央有黑色凸起的圓形、露珠狀菌落，直徑在0.5～1.0 mm（見圖1）。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果如圖2所示，分離菌染色呈紅色，革蘭氏陰性，形狀為短桿和長桿，多數(shù)為短桿狀，無芽孢和莢膜。

圖1 SS培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 革蘭氏染色特性（1 000×）

2.2 生化鑒定結(jié)果 選取SS培養(yǎng)基上的典型菌落進行生化試驗。分別與葡萄糖、山梨醇、枸櫞酸鹽、尿素、鳥氨酸脫羧酶、硫化氫反應(yīng)呈陽性，與賴氨酸脫羧酶、乳糖、靛基質(zhì)、甘露醇、七葉苷反應(yīng)呈陰性，生化特征與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中奇異變形桿菌的一致。

2.3 16S rDNA 序列同源性分析結(jié)果 用細(xì)菌16S rDNA通用引物對分離菌的DNA進行PCR擴增，將擴增后的產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在照膠儀下檢測，顯示擴增目的片段的大小約為1 500 bp，和預(yù)期一致，結(jié)果見圖3。從圖中結(jié)果可以看出細(xì)菌的16S rDNA 序列得到了有效擴增。將PCR 擴增產(chǎn)物送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行基因測序，結(jié)果獲得片段大小為1 410 bp 的序列。把該測序結(jié)果與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，結(jié)果顯示分離菌與奇異變形桿菌16S rDNA基因的相似性為99%，確定該菌株為奇異變形桿菌。

圖3 PCR檢測結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果詳見表1。該豬源奇異變形桿菌分離株對頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、麥迪霉素等藥物敏感，對鏈霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮中度敏感，而對青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢呋辛、四環(huán)素、強力霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、多粘菌素B、紅霉素、桿菌肽、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、克林霉素、氨芐西林、卡那霉素、新霉素等19 種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗結(jié)果 mm

3 討論

3.1 奇異變形桿菌的分離鑒定 奇異變形桿菌作為一種人畜共患病病原，不但造成養(yǎng)殖業(yè)的重大經(jīng)濟損失，而且還嚴(yán)重威脅著人類的健康［1-3］。近年來，全國各地養(yǎng)豬場暴發(fā)奇異變形桿菌病的報道不斷攀升［4-8］。有些豬場奇異變形桿菌病病情反復(fù)，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致80%以上的發(fā)病率和高達(dá)60%的病死率，給發(fā)病豬場帶來極大的經(jīng)濟損失，因此該病已經(jīng)引起了養(yǎng)殖場的高度重視［9-12］。奇異變形桿菌病的發(fā)病日齡、臨床癥狀、剖檢變化與沙門氏菌比較相似，因此臨床確認(rèn)需要進行實驗室檢測輔助［13］。本研究從甘孜州某藏豬場臨床出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、腹瀉的病豬剖檢病料中分離獲得了一株革蘭氏陰性短桿菌，經(jīng)鑒定該菌的培養(yǎng)特性和生化特性與奇異變形桿菌基本一致。

16S rDNA 序列同源性分析作為一種未知細(xì)菌的鑒定技術(shù)，已經(jīng)被國際上諸多研究機構(gòu)所認(rèn)可，可以用該方法快速確認(rèn)細(xì)菌的種屬，同源性在99%～100%之間即可認(rèn)定為同種，同源性在97%～99%可認(rèn)定為同屬［8］。從純化平板中挑取單個菌落制成菌懸液，用16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，獲得約1 500 bp 大小的目的條帶，對PCR 產(chǎn)物測序，所獲得的序列與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)分離菌與奇異變形桿菌16S rDNA基因的相似性為99%，故可確定該分離菌為豬源奇異變形桿菌。

3.2 奇異變形桿菌病的臨床用藥 在細(xì)菌性疾病的治療上，目前最常采用且最有效的方法還是抗生素療法。奇異變形桿菌是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，一般對氨基糖苷類、喹諾酮類及磺胺類藥物比較敏感［14］。但當(dāng)前細(xì)菌耐藥性問題普遍存在，如果不進行敏感藥物的篩選，臨床用藥的治療效果都不太理想，因此非常有必要對分離菌株進行敏感藥物篩選。本次藥敏試驗結(jié)果表明，該奇異變形桿菌分離株只對慶大霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星、氧氟沙星、頭孢他啶、麥迪霉素等藥物敏感，對鏈霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮中度敏感，而對青霉素等19 種藥物耐藥。

臨床上很多養(yǎng)殖戶通過大量添加抗生素來防治諸如奇異變形桿菌等細(xì)菌病，這些都導(dǎo)致奇異變形桿菌對抗生素的耐藥譜逐漸擴大。董萌萌等［4］報道，奇異變形桿菌對先鋒霉素IV、氨芐西林、先鋒霉素VI、新霉素、先鋒霉素V、四環(huán)素、美洛西林、強力霉素、卡那霉素等耐藥。葛強等［15］研究發(fā)現(xiàn)，奇異變形桿菌分離株對22種抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥，對多西環(huán)素、四環(huán)素、磺胺甲惡唑、氨芐西林的耐藥率達(dá)100%，對頭孢噻肟、頭孢呋辛、亞胺培南、頭孢氨芐的耐藥率在57.1%以上。

本次藥敏試驗結(jié)果從一定程度上表明，該豬場在養(yǎng)殖過程中存在嚴(yán)重濫用抗生素的情況，對19 種藥物耐藥，用藥情況不樂觀。為了更好、更有效地防治該病，建議在采用藥物防治時，應(yīng)先進行體外藥敏試驗，根據(jù)試驗結(jié)果針對性地選擇敏感藥物，從而有效防控該病。本研究為該豬場后續(xù)用藥提供了參考，在對豬源奇異變形桿菌病的治療過程中，可從7 種敏感抗生素中適當(dāng)選擇用藥，同時考慮多種抗生素配合使用或輪換使用，避免長期使用同一種抗生素。