董 艷 李 軍 張振鵬 高嘉良 王 階

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京,100053)

一直以來中醫(yī)藥為人們的健康保駕護(hù)航,但隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,中醫(yī)藥客觀化、精確化和靶向化問題已逐漸成為阻礙其現(xiàn)代化發(fā)展的壁壘。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究特定生長周期或生理狀態(tài)下某個細(xì)胞或組織所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的一門學(xué)科[1],它包括編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(Messenger RNA,mRNA)和不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA(Non-coding RNA,ncNRA)。轉(zhuǎn)錄組是決定基因表達(dá)與否,連接基因與表型的關(guān)鍵環(huán)節(jié),它受外源和內(nèi)源因素的共同調(diào)控,能反映內(nèi)部基因組與外部物理特征的整體動態(tài)聯(lián)系,符合中醫(yī)整體觀理論及中藥多靶點整體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的特性。有鑒于此,從轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面研究中藥作用靶點,將有助于揭示中藥多成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的分子機(jī)制,是中醫(yī)藥向精準(zhǔn)醫(yī)療邁進(jìn)的一大步。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)理念符合中醫(yī)藥作用特征

隨著當(dāng)前藥物研究從“一藥一靶一病”的單靶點理念向多層次、多靶點整體調(diào)節(jié)的方向轉(zhuǎn)變[2],越來越多的研究者開始關(guān)注組學(xué)技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[3]。各種組學(xué)技術(shù),包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)等已經(jīng)成為中藥藥理機(jī)制、中藥復(fù)雜體系、中藥活性成分篩選及中藥材鑒別等的主要策略。其中,轉(zhuǎn)錄組學(xué)受內(nèi)源和外源因素的協(xié)同調(diào)控,在基因承載和表達(dá)之間起著關(guān)鍵的樞紐作用。它的整體性、時空性和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系尤其適用于中藥靶點及機(jī)制的研究,故而其技術(shù)應(yīng)用也極為廣泛[4]。借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),中藥活性成分、單味中藥以及中藥復(fù)方的多層次、多靶點協(xié)同作用機(jī)制得以逐步闡釋[5-6]。通過研究mRNA的差異表達(dá)能反映中藥在基因轉(zhuǎn)錄水平的潛在作用,而有關(guān)微小RNA(Micro RNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(Long Non-coding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)等ncRNAs及其lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA及miRNA-mRNA等復(fù)雜關(guān)系的研究則能進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄后基因修飾和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)層面揭示中藥的作用靶點和分子機(jī)制。因此,轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)有望成為挖掘中醫(yī)藥寶藏的有力武器,基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究中藥的作用靶點及分子機(jī)制已經(jīng)成為了當(dāng)前的熱點領(lǐng)域。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的常用檢測技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展的逐漸深入,基于mRNA和多種ncRNAs的表達(dá)譜日趨完善,多種轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也應(yīng)運而生。目前該技術(shù)主要包括基因芯片、RNA測序、單分子測序、單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組等,其中RNA測序運用最廣泛,單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組則是當(dāng)前的熱點技術(shù),已逐步運用到中醫(yī)藥研究中。

2.1 基因芯片 基因芯片技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)中發(fā)展較早和傳統(tǒng)的技術(shù)方法。它由數(shù)以萬計的核酸探針排列構(gòu)成,其中每條探針都對應(yīng)特定的基因序列,用以檢測基因的表達(dá)豐度?；蛐酒夹g(shù)能快速、準(zhǔn)確地檢測基因表達(dá),其操作簡便,價格相對低廉,且相關(guān)的數(shù)據(jù)分析軟件及理論也較為成熟[7]。在中藥研究領(lǐng)域,該技術(shù)主要用于藥理、毒理、藥物靶點及藥效機(jī)制的研究[8]。但是,這種基于現(xiàn)有已知基因序列的檢測方法,有其自身的局限性:1)不能識別先驗基因組序列以外的新RNA;2)雜交技術(shù)靈敏度較低,難以精確分辨同源性較高的基因序列和表達(dá)豐度較低、瞬間表達(dá)的目標(biāo)序列,亦不能檢測異常轉(zhuǎn)錄的基因;3)檢測范圍會因背景信號和熒光信號的飽和而受到限制;4)標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)分析方法,使得不同實驗和平臺之間的定量化基因表達(dá)比較研究難以實施[9-11]。有鑒于此,該技術(shù)已逐漸被RNA測序技術(shù)所替代。

2.2 RNA測序 RNA測序技術(shù),即RNA-seq技術(shù)、第二代測序技術(shù)、全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),直接對RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA序列進(jìn)行測序。該技術(shù)采用邊合成邊測序方法,能一次性測定幾十萬到幾百萬條核苷酸序列,靈敏度高,檢測范圍廣,且無需設(shè)計探針,具有整體性、組織差異性和時間獨立性等特點,故而可構(gòu)建不同組織、不同時間段的基因轉(zhuǎn)錄譜。目前,RNA測序技術(shù)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的主要方法,通過分析不同轉(zhuǎn)錄譜之間的差異表達(dá)基因,進(jìn)一步整合生物信息學(xué)方法,有助于明確中藥治療疾病的作用機(jī)制。但是,測序片段讀長相對較短、擴(kuò)增時易引入偏差以及無法完整解析復(fù)雜重復(fù)區(qū)域,依然是RNA測序技術(shù)的主要挑戰(zhàn)。同時,當(dāng)前數(shù)據(jù)處理模型的發(fā)展落后于測序技術(shù),導(dǎo)致海量數(shù)據(jù)難以得到有效分析和合理利用。因此,盡管運用RNA測序能獲得全轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá),但是這些結(jié)果模糊而龐雜,難以聚焦到關(guān)鍵的作用靶點或明確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。

2.3 單分子測序 單分子測序,即第三代測序技術(shù),具有長讀長、單分子及實時測序等特點[12],主要包括單分子實時測序技術(shù)和單分子納米孔測序技術(shù)等[13-15]。目前,大部分單分子測序技術(shù)還處于發(fā)展階段,其中較為成熟的是單分子實時(Single Molecule Real-time,SMRT)測序技術(shù)。它基于單分子水平,邊合成邊測序,擁有更高的通量、超長讀長、運行快速、精確性更高、無需模板擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄等優(yōu)勢[13],現(xiàn)主要運用于小型基因組從頭測序和組裝、轉(zhuǎn)錄組測序和甲基化分析等[16]。有學(xué)者利用SMRT技術(shù)進(jìn)行地中海貧血相關(guān)hba1/2和hbb基因的全長測序,解析了其基因的完整變異信息,而這些基因信息難以用傳統(tǒng)的RNA測序技術(shù)獲得[17]。另有研究運用單分子測序的長讀長模式分析一對智力障礙綜合征的雙胞胎患兒,發(fā)現(xiàn)了源于母系的12 kb染色體倒轉(zhuǎn),而該倒轉(zhuǎn)能直接影響brpf1基因表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致遺傳性智力發(fā)育障礙[18]。值得注意的是,單分子測序技術(shù)已逐漸應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域,有學(xué)者聯(lián)合SMRT測序與高通量測序深入分析中藥材丹參成分,發(fā)現(xiàn)丹參的主要活性成分之一——丹參酮,其主要產(chǎn)生并積累于植物的根皮部位[19]。另有研究利用SMRT與RNA測序技術(shù)研究三七的轉(zhuǎn)錄組序列,結(jié)果顯示三七花是合成其主要活性成分人參皂苷的主要部位,而三七根則是貯藏人參皂苷的部位,且三七開花時間受光周期調(diào)節(jié),編碼光受體蛋白的基因通過大量擴(kuò)增,提高其光能利用率[20]。由此而見,單分子測序技術(shù)在研究單味中藥轉(zhuǎn)錄組及其活性成分代謝相關(guān)基因方面已經(jīng)初露頭角,在后續(xù)針對具體疾病的中醫(yī)藥作用靶點及機(jī)制研究方面值得期待。

2.4 單細(xì)胞測序 單細(xì)胞測序是目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的新興技術(shù),也是當(dāng)前生物科學(xué)領(lǐng)域的焦點,它能實現(xiàn)單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)的測序?，F(xiàn)有針對單細(xì)胞的測序主要基于RNA測序技術(shù),RNA測序所需樣品較少且無需片段化RNA,因而能完成單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測序[21]。單細(xì)胞測序適用于分析不同細(xì)胞類型或亞群以及揭示細(xì)胞異質(zhì)性,在探索單個細(xì)胞對藥物反應(yīng)的動態(tài)變化,以及不同細(xì)胞對藥物反應(yīng)的異質(zhì)性方面表現(xiàn)出巨大優(yōu)勢[22]。一項研究運用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(Single-cell RNA-Seq,scRNA-Seq)分析正常及心肌梗死后不同時間節(jié)點的內(nèi)皮細(xì)胞簇,發(fā)現(xiàn)在心肌梗死過程中內(nèi)皮細(xì)胞存在缺氧、炎癥反應(yīng)及增殖的動態(tài)病理演變[23]。而針對動脈粥樣硬化的scRNA-Seq和質(zhì)譜流式細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),高脂誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化主要是炎性單核巨噬細(xì)胞群增多,而非固有巨噬細(xì)胞及2型樹突細(xì)胞[24]。另有學(xué)者將單細(xì)胞測序與單分子測序技術(shù)結(jié)合,開發(fā)了單細(xì)胞基因組單分子測序(Single-cell Genome Long-read Sequencing Technology,SMOOTH-seq)新方法,該方法克服了傳統(tǒng)單分子測序?qū)颖玖康囊?實現(xiàn)了對微量樣品和單細(xì)胞樣品的單分子測序[25]。值得注意的是,單細(xì)胞測序的細(xì)胞已然失去了自身的組織空間信息,而這種微環(huán)境的改變有可能會導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化,這在一定程度上限制了單細(xì)胞測序的應(yīng)用[26]。此外,測序成本較高和測序時間較長也是當(dāng)前影響scRNA-Seq推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。

2.5 空間轉(zhuǎn)錄組 空間轉(zhuǎn)錄組目前已被廣泛應(yīng)用于心血管、腫瘤、腎病及肝病等領(lǐng)域[27-30]。它不僅可以分析基因表達(dá)數(shù)據(jù),還能獲得細(xì)胞空間位置信息,在一定程度上可以彌補單細(xì)胞測序的不足?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)包括基于原位雜交、基于高通量測序、基于原位測序和基于活細(xì)胞標(biāo)記等[31]。其中,高通量測序性價比較高,是目前運用比較廣泛的技術(shù)[31]。有研究整合了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù),研究正常和心肌梗死后不同階段的心肌組織,發(fā)現(xiàn)心肌梗死后不同病理區(qū)域的心肌細(xì)胞存在顯著的差異空間基因調(diào)控,并繪制了心肌梗死后心臟重構(gòu)的高分辨率整合圖譜[32]。另有學(xué)者應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭患者的心肌組織進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了5種胎兒標(biāo)記基因,而這些基因由于表達(dá)量微弱,正常情況下很難被檢測[33]。此外,為了揭示不同生長階段、不同解剖部位的心臟特異性基因圖譜,該學(xué)者進(jìn)一步結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組和scRNA-Seq技術(shù),構(gòu)建了人類心臟的時空基因表達(dá)圖譜,并形成了公開數(shù)據(jù)庫[34]。由此可見,空間轉(zhuǎn)錄組作為當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點,必將為推進(jìn)人類組織原位細(xì)胞真實基因表達(dá)、微環(huán)境互作和生理病理變化研究提供重要手段。盡管如此,目前采用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中醫(yī)藥仍處于探索階段,未來該技術(shù)將在不斷完善自身的基礎(chǔ)上為中醫(yī)藥精準(zhǔn)醫(yī)療提供可靠技術(shù)支撐。

3 中藥作用靶點及分子機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究思路與方法能實現(xiàn)從宏觀到微觀,從單一到網(wǎng)絡(luò)的中藥作用靶點與分子機(jī)制探索。目前常用研究思路為:初期小樣本篩選差異RNA表達(dá)譜,經(jīng)過生物信息學(xué),或聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),或結(jié)合其他多組學(xué)篩選方法,分析關(guān)鍵RNA和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)對關(guān)鍵RNA進(jìn)行大樣本驗證,以確定中醫(yī)藥對特定RNA調(diào)控的穩(wěn)定性;然后,利用RNA干擾技術(shù),對驗證后的關(guān)鍵RNA進(jìn)行沉默和(或)過表達(dá),從功能學(xué)上證實中醫(yī)藥與該RNA之間的靶向關(guān)系及其涉及的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后,通過探索RNA與藥物分子的結(jié)合位點,證實中藥干預(yù)RNA的直接靶向作用。見圖1。

圖1 中藥作用靶點及分子機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究思路

3.1 轉(zhuǎn)錄譜篩選及關(guān)鍵RNA初步驗證研究——利用基因芯片/RNA測序/單細(xì)胞測序等聯(lián)合RT-PCR技術(shù) 利用基因芯片或RNA測序技術(shù)檢測中藥治療前后的轉(zhuǎn)錄譜變化,結(jié)合生物信息學(xué)方法分析基因的功能和通路,能較為全面地篩查中藥潛在靶基因。但由于測序費用相對昂貴,臨床上往往先進(jìn)行小樣本的差異轉(zhuǎn)錄譜篩選,然后進(jìn)一步針對關(guān)鍵基因擴(kuò)大樣本量進(jìn)行RT-PCR檢測,以驗證這些基因作為中藥靶點的有效性和穩(wěn)定性。因此,將基因芯片或RNA測序與RT-PCR技術(shù)結(jié)合才能完成一項完整的初篩和驗證工作,目前這種方法也是研究中藥治療疾病的RNA靶點及其機(jī)制的主要手段。有學(xué)者在篩選冠心病血瘀證差異轉(zhuǎn)錄譜基礎(chǔ)上,開展了關(guān)鍵基因的RT-PCR驗證和中藥干預(yù)研究,闡釋了血塞通軟膠囊治療冠心病血瘀證的潛在靶點和作用機(jī)制[35]。利用基因芯片篩選出冠心病血瘀證患者差異表達(dá)的1 081個mRNAs和25個miRNAs,結(jié)合生物信息學(xué)分析,進(jìn)一步構(gòu)建了miR-146b-5p/CALR/炎癥反應(yīng)和miR-199a-5p/TP53/凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并用RT-PCR驗證了以上關(guān)鍵基因的表達(dá)。經(jīng)血塞通軟膠囊干預(yù)后,RT-PCR檢測結(jié)果顯示冠心病血瘀證患者h(yuǎn)sa-miR-199a-5p、hsa-miR-146b-5p和TP53的異常表達(dá)被逆轉(zhuǎn)[36];且細(xì)胞學(xué)研究顯示,血塞通軟膠囊能通過調(diào)節(jié)hsa-miR-146b-5p表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[37]。

另有研究利用RNA測序技術(shù)對冠心病及其冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證和正常對照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證存在39個lncRNA,229個miRNA和221個mRNA的差異表達(dá);并運用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊晚f恩分析,獲得轉(zhuǎn)錄譜中的關(guān)鍵節(jié)點和lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[38-39]。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開展血塞通軟膠囊干預(yù)冠心病血瘀證的臨床試驗[40],采用RT-PCR方法驗證中藥對其關(guān)鍵lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用,從而證實了血塞通軟膠囊治療冠心病血瘀證在轉(zhuǎn)錄層面的靶點及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由此可見,基于差異轉(zhuǎn)錄譜篩選和RT-PCR驗證,可以初步確定中藥的潛在RNA靶點,但這種RNA的差異變化僅僅體現(xiàn)了中藥與轉(zhuǎn)錄組之間存在相關(guān)性,更直接的靶向調(diào)節(jié)證據(jù)仍需進(jìn)一步開展RNA干擾實驗。

值得注意的是,隨著單細(xì)胞測序理念的發(fā)展,傳統(tǒng)針對組織或多細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄組測序已無法滿足當(dāng)前研究的需要,針對單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組的測序正逐漸應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域。一項運用單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)合DESeq2差異表達(dá)分析的研究發(fā)現(xiàn),左歸丸可以逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的14個核糖體通路相關(guān)基因的下調(diào),上調(diào)呼吸鏈相關(guān)基因和氧化磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)糖代謝,抑制高糖導(dǎo)致的胚胎細(xì)胞死亡[41]。此外,利用單細(xì)胞測序聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組能更全面系統(tǒng)地揭示中醫(yī)藥作用的時空信息,但目前相關(guān)研究報道較少,值得將來進(jìn)一步探索和挖掘。

3.2 功能學(xué)靶點及上下游調(diào)控機(jī)制研究——基于RNA干擾技術(shù)的基礎(chǔ)研究 通過轉(zhuǎn)錄譜篩選和關(guān)鍵RNA驗證工作后能初步明確中藥作用的潛在靶點。但是,要進(jìn)一步確定這些潛在靶點能否在功能上直接影響藥效,仍需通過RNA沉默或過表達(dá)才能證實。有鑒于此,越來越多的研究利用慢/腺病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染、化學(xué)合成siRNA或其他靶點抑制劑實現(xiàn)基因表達(dá)的干擾,從功能學(xué)上觀察靶點與藥效的關(guān)系。有研究聯(lián)合siRNA和shRNA方法對miR-3 656和lncR CTB-114C7.4基因進(jìn)行表達(dá)干擾,發(fā)現(xiàn)三七總皂苷能上調(diào)lncR CTB-114C7.4和BCL2A1表達(dá),下調(diào)miR-3 656表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡;將lncR CTB-114C7.4過表達(dá)或阻滯miR-3 656后,均能獲得與三七總皂苷完全一致的調(diào)控作用;進(jìn)一步在三七總皂苷干預(yù)基礎(chǔ)上分別敲降lncR CTB-114C7.4和過表達(dá)miR-3 656發(fā)現(xiàn),前者能完全逆轉(zhuǎn)三七總皂苷的調(diào)節(jié)作用,而后者未能達(dá)到同樣的效果,由此揭示lncR CTB-114C7.4的表達(dá)水平能影響三七總皂苷的療效,是三七總皂苷發(fā)揮抗H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的功能學(xué)靶點之一[42]。三七總皂苷能通過上調(diào)lncR CTB-114C7.4,激活lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑網(wǎng)絡(luò),從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。另有學(xué)者報道,小檗堿能以P53依賴性方式上調(diào)肝細(xì)胞癌中miR-23a的表達(dá),抑制Nek6,并促進(jìn)P53相關(guān)腫瘤抑制基因p21和GADD45α的轉(zhuǎn)錄激活,從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞死亡,G2/M細(xì)胞周期停滯和腫瘤生長抑制;而當(dāng)miR-23a抑制時,小檗堿誘導(dǎo)的保護(hù)作用被減弱,從而反向證實了miR-23a是小檗堿發(fā)揮抗腫瘤作用的重要靶點[43]。此外,另一項研究顯示lncRNA UCA1在前列腺癌中高表達(dá),與患者的不良預(yù)后正相關(guān)。青蒿琥酯能顯著降低lncRNA UCA1表達(dá),并調(diào)節(jié)下游miR-184/Bcl-2軸,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制轉(zhuǎn)移能力;相反,當(dāng)lncRNA UCA1過表達(dá)時又可逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯誘導(dǎo)的上述保護(hù)作用,由此證實了lncRNA UCA1是青蒿琥酯的治療靶點,并揭示了其下游的miR-184/Bcl-2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[44]。

由此可見,采用RNA干擾的方法對潛在靶基因進(jìn)行研究,可以從功能學(xué)上證實中醫(yī)藥的作用靶點,并明確該靶點的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò),但該靶點與中藥在結(jié)構(gòu)上的關(guān)系及其結(jié)合位點仍需進(jìn)一步深入探索。

3.3 RNA-小分子結(jié)合位點研究——基于機(jī)器學(xué)習(xí)的結(jié)合位點預(yù)測 藥物與RNA結(jié)合位點的研究是當(dāng)前實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄層面精準(zhǔn)醫(yī)療的熱點和難點問題。在明確了特定RNA與中藥之間存在功能上的相互作用關(guān)系后,進(jìn)一步深入挖掘RNA與中藥或其活性成分的結(jié)合位點顯得尤為必要,能為揭示中藥治療靶點提供更為直接的證據(jù)。由于RNA高度結(jié)構(gòu)化,具有小分子可觸及的結(jié)合袋或裂口[45],形成潛在的結(jié)合位點。因此,小分子物質(zhì)可能通過與之結(jié)合誘導(dǎo)RNA功能的抑制或激活,從而發(fā)揮治療疾病的作用。目前運用較廣泛的熒光原位雜交檢測能相對定位RNA的表達(dá),結(jié)合RNA沉降(RNA Pull Down)和RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)實驗?zāi)苓M(jìn)一步證實不同RNA之間以及RNA與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合和共表達(dá)關(guān)系;而雙熒光素酶報告基因檢測則能通過位點突變的方法,實現(xiàn)ncRNA的靶基因驗證,預(yù)測ncRNA與mRNA的結(jié)合位點。但是,關(guān)于RNA與藥物小分子相互作用結(jié)合位點的預(yù)測方法則應(yīng)用有限,主要包括基于先驗知識、基于經(jīng)驗及機(jī)器學(xué)習(xí)[46]。其中,基于先驗知識的方法是指運用已知的RNA-小分子結(jié)合位點數(shù)據(jù)庫,預(yù)測可能與藥物相關(guān)的RNA識別基序[47]?；诮?jīng)驗的方法則主要依賴RNA結(jié)構(gòu)的幾何特征,通過尋找這些特征的極值,將其作為結(jié)合位點的潛在指標(biāo)[48]。機(jī)器學(xué)習(xí)方法是指通過計算RNA的結(jié)構(gòu)和序列特征,從而推測其結(jié)合位點,該方法體現(xiàn)了多學(xué)科交叉的優(yōu)勢,已成為當(dāng)前應(yīng)用最主要的手段[46,49]。已有研究發(fā)現(xiàn),許多天然、半合成及合成抗生素可以通過靶向調(diào)節(jié)RNA發(fā)揮抗感染作用[50-51]。另有一些小分子藥物正處于臨床和臨床前開發(fā)中,它們通過作用于RNA靶點,發(fā)揮治療遺傳病和抗腫瘤的作用[52-54]。然而,遺憾的是目前針對RNA靶向結(jié)合位點的中藥或其活性成分研究報道較少,未來關(guān)于RNA治療的天然藥物研究,中醫(yī)藥仍大有可為。

3.4 中藥作用的多組學(xué)靶點及機(jī)制研究——整合多組學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) 隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、甲基化組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等檢測技術(shù)逐漸發(fā)展,人們越來越關(guān)注各組學(xué)之間的聯(lián)合研究,以系統(tǒng)、整體、動態(tài)的角度認(rèn)識疾病的發(fā)生發(fā)展變化以及中藥干預(yù)的作用機(jī)制。不同于單組學(xué)研究可能帶來的認(rèn)識誤差,多組學(xué)可縱向解釋從基因到代謝物產(chǎn)生的整體過程,這種研究思路更符合中醫(yī)整體恒動的思維,也與中藥復(fù)方多成分、多靶點的特性一致,因此有關(guān)多組學(xué)在中醫(yī)藥中的運用也越來越多。見圖2。1)轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合基因組學(xué)、甲基化組學(xué):將基因組、轉(zhuǎn)錄組和甲基化組同時研究能繪制包括DNA、RNA及基因修飾在內(nèi)的復(fù)雜圖譜,進(jìn)而從基因?qū)用娼沂究赡馨l(fā)生或正在發(fā)生的變化,為中藥藥效及靶點研究提供證據(jù)。一項研究采用單分子測序技術(shù)研究中藥蛹蟲草的基因組、甲基化組和轉(zhuǎn)錄組圖譜,發(fā)現(xiàn)其具有安眠作用的N6-(2-羥乙基)腺苷和抗腫瘤作用的麥角甾醇代謝通路[55]。2)轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué):通過將轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組、代謝組聯(lián)合應(yīng)用,能從已經(jīng)發(fā)生的分子變化層面揭示中藥作用靶點和機(jī)制。有學(xué)者利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)研究中藥復(fù)方治療慢性阻塞性肺疾病的長期療效機(jī)制[56]。通過分別采用基因芯片、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)蛋白質(zhì)組學(xué)和LC-MS代謝組學(xué)技術(shù),檢測到補肺益腎方干預(yù)后的1 106個差異RNA、187個差異蛋白和32個差異代謝物;進(jìn)一步整合分析多組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的RNA、蛋白和代謝物,參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和黏著斑等過程。3)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué):將組學(xué)技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合也是當(dāng)前中藥靶點研究常用的方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建化學(xué)成分-化學(xué)成分、化學(xué)成分-靶點以及靶點-疾病之間的相互關(guān)系,能幫助研究藥物多靶點治療疾病的作用機(jī)制,這種網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的方法能節(jié)省實驗初篩工作所耗費的人力、物力和財力,極大地提高了科研效率,故而在具有多成分、多靶點特性的中藥研究中表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢[57-58]。目前已有研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合,研究五味子乙素治療肝纖維化的靶點和作用機(jī)制[59]。采用RNA-seq技術(shù)檢測五味子乙素上調(diào)的2 584個基因和下調(diào)的1 659個基因,分析其參與的氧化還原反應(yīng)、四氯化碳(CCl4)代謝、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等生物過程。運用化學(xué)信息學(xué)方法建立肝纖維化的靶點數(shù)據(jù)庫,通過高通量、快速“成分-靶點”對接分析,虛擬篩選藥物的潛在生物學(xué)靶點。針對網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的靶點開展實驗研究,進(jìn)一步證實了五味子乙素的潛在靶點為CB2受體以及相關(guān)的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。另有學(xué)者則基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)3種技術(shù)研究葛根芩連湯對2型糖尿病的作用機(jī)制,結(jié)果顯示黃酮類和生物堿類是葛根芩連湯發(fā)揮藥效的主要成分,能促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferators-activated Receptor γ,PPARγ)和PPARα表達(dá),參與糖脂代謝,從而治療2型糖尿病[60]。

圖2 各組學(xué)研究認(rèn)識階段及特點

多組學(xué)方法是當(dāng)前研究中藥靶點及分子機(jī)制的重要手段,尤其是將組學(xué)思維與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合,有利于從數(shù)據(jù)量龐大的基因圖譜中進(jìn)一步明確中藥藥效成分及其作用靶點。同時,針對中藥ncRNA層面的靶點研究,充分利用網(wǎng)絡(luò)藥理的基因及蛋白數(shù)據(jù)庫,有助于尋找ncRNA的下游調(diào)控基因、蛋白及通路,從而揭示中藥的ncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。但是,隨之出現(xiàn)的不同組學(xué)的海量數(shù)據(jù)如何充分利用和合理分析,如何聚焦出具體而完整的“基因-RNA-蛋白-代謝產(chǎn)物”生物調(diào)控機(jī)制,仍然是目前需要解決的關(guān)鍵與瓶頸問題。

4 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展使得中藥在RNA層面的靶點和機(jī)制研究成為了可能?；趍RNA在DNA和蛋白質(zhì)之間的關(guān)鍵樞紐作用,以及不同ncRNA之間、ncRNA與mRNA之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)特性,采用全轉(zhuǎn)錄組學(xué)的檢測技術(shù)和研究方法能系統(tǒng)揭示中藥的全部RNA靶點及轉(zhuǎn)錄后修飾作用,并聚焦到關(guān)鍵的生物功能和分子機(jī)制。但是,作為一個相對年輕的新興學(xué)科,目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中藥靶點及機(jī)制研究領(lǐng)域仍然存在以下幾個問題:1)由于全轉(zhuǎn)錄組測序費用昂貴,目前多數(shù)研究僅僅是檢測某種特定的RNA類型,例如mRNA、miRNA、lncRNA或circRNA表達(dá)譜。這種單一類型的RNA轉(zhuǎn)錄譜并非真正意義上的轉(zhuǎn)錄組學(xué),因此它也不能全面揭示中藥在轉(zhuǎn)錄層面的所有差異表達(dá)的RNA。2)目前大部分研究僅進(jìn)行了RNA表達(dá)譜篩選和RT-PCR驗證,表明了中藥與差異表達(dá)RNA的相關(guān)性以及潛在的信號通路。但更直接、更確切的治療靶點和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步開展關(guān)鍵RNA的干擾實驗和相應(yīng)結(jié)合位點研究才能實現(xiàn)。3)不同類型RNA之間存在相互調(diào)控關(guān)系,尤其對于lncRNA和circRNA這種內(nèi)源性競爭性RNA而言,它們能與miRNA和mRNA構(gòu)成自上而下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而,現(xiàn)有研究大多側(cè)重尋找中藥單一層面的RNA靶點,而忽視其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。4)轉(zhuǎn)錄組學(xué)能用于解釋目前正在發(fā)生的基因變化,但導(dǎo)致其發(fā)生的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ),及其是否確切發(fā)生并帶來了什么后果仍不得而知,因此近年來多組學(xué)研究逐漸興起。值得注意的是,在單組學(xué)技術(shù)仍未充分理解并利用時,過早開展多組學(xué)研究不僅耗費大量的研究經(jīng)費,隨之產(chǎn)生的海量組學(xué)數(shù)據(jù)更難以分析。而轉(zhuǎn)錄組作為中心法則的中間環(huán)節(jié),對于承接遺傳物質(zhì)表達(dá),推進(jìn)蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物的生成至關(guān)重要;同時ncRNA的出現(xiàn)更豐富了中心法則以外的基因修飾過程,使得原本線性關(guān)聯(lián)的遺傳物質(zhì)之間變得更加立體和真實。有鑒于此,充分利用最新轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),找到適合中醫(yī)藥的檢測手段和數(shù)據(jù)分析方法,挖掘中藥療效背后的關(guān)鍵mRNA和ncRNA,形成系統(tǒng)明確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),仍然是下一步中藥作用靶點及分子機(jī)制研究的重點。

利益沖突聲明:無。