顧靜雯 樸 香 傅 偉 程克文 董晨潔 沈毅韻

(1 上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院,上海,200431; 2 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203; 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶山醫(yī)院,上海,201999)

兒童時(shí)期最常見(jiàn)的慢性氣道疾病是支氣管哮喘,它是以慢性炎癥、氣道高反應(yīng)為特征的異質(zhì)性疾病,主要表現(xiàn)為反復(fù)的咳嗽、喘息、胸悶、氣急[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,兒童哮喘的發(fā)病率約為1%～4%,我國(guó)每10年即增加50%以上的兒童哮喘患者,因此,最有效的控制兒童哮喘的方式就是及時(shí)診斷并接受規(guī)范化的治療[2-3]。目前主要的研究認(rèn)為,Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在前期的研究中,我們發(fā)現(xiàn),疏肝平喘方對(duì)哮喘患兒具有一定的療效,表現(xiàn)在能夠減輕咳嗽癥狀,改善中醫(yī)證候,抑制氣道炎癥,現(xiàn)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 40只清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠(體質(zhì)量18～22 g),4～6周齡,于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司采購(gòu),公司許可證號(hào):SYXK(滬)2017-0008。動(dòng)物倫理審批號(hào):PZSHUTCM210919010。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。環(huán)境室溫25 ℃、濕度60%～70%,IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物 疏肝平喘方由炙麻黃6 g(批號(hào):200401)、苦杏仁9 g(批號(hào):200301)、生石膏15 g(批號(hào):200201)、生甘草6 g(批號(hào):200302)、紫蘇子9 g(批號(hào):200402)、萊菔子9 g(批號(hào):200501)、地龍干9 g(批號(hào):200102)、桃仁9 g(批號(hào):200202)、椒目6 g(批號(hào):200101)、黃芩9 g(批號(hào):200502)、柴胡6 g(批號(hào):200403)、白芍9 g(批號(hào):200203)、丹參9 g(批號(hào):200403)組成,由上海虹橋中藥飲片有限公司提供。以上藥材煎煮提取方法參照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006年)以及臨床實(shí)際應(yīng)用的煎煮方法。地塞米松購(gòu)自辰欣藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):2003012211)。

1.1.3 試劑與儀器 卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA,美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):A5253)、氫氧化鋁(AlOH3,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20171150)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-10、IL-17A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)于上海酶研生物科技有限公司(貨號(hào):EK-R36902、EK-R36864、EK-R38788、EK-R38727)。核孤兒受體(Retinoid-related Orphan Nuclear Receptor,ROR)γt抗體、叉頭框蛋白(Forkhead Box ProteinFox)p3抗體(上海雅吉生物科技有限公司,貨號(hào):IHC0113587,IH-0269R)。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)RT-PCR試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號(hào):mIE6067)。超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍,型號(hào):503AI型),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek公司,美國(guó),型號(hào):ELX808),流式細(xì)胞儀(BD公司,美國(guó),型號(hào):FACSCalibur),石蠟切片機(jī)(Leica,德國(guó),型號(hào):RM2235),PCR分析儀(羅氏公司,瑞士,型號(hào):LightCycler.480Ⅱ),電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó),型號(hào):Fluorchem FC3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,每組10只:空白對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松組、疏肝平喘方組。按照以往支氣管哮喘成熟的造模條件,建立哮喘模型。除空白對(duì)照組外,在第1天和第14天,每只實(shí)驗(yàn)小鼠給予10%OVA混合液注射致敏;第23天到第29天,將實(shí)驗(yàn)小鼠放置于5升的密閉容器中,用5%OVA+生理鹽水超聲霧化,每日1次,每次40 min,誘發(fā)哮喘?？瞻讓?duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠給予等量生理鹽水注射并超聲霧化。

1.2.2 給藥方法 各個(gè)實(shí)驗(yàn)組均在致敏后2周開(kāi)始灌胃,1次/d,灌胃1周。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法學(xué)》(人民衛(wèi)生出版社,2001年)中公式dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3,計(jì)算實(shí)驗(yàn)劑量。疏肝平喘方組用0.1 mL/(g·d)劑量的藥液灌胃(原生藥濃度為5.33 g/mL);地塞米松組用0.1 mL/(g·d)劑量的藥液灌胃(地塞米松濃度為0.075 mg/mL);空白對(duì)照組、模型組用0.1 mL/(g·d)的生理鹽水灌胃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 肺組織病理 小鼠處死后開(kāi)胸取部分右側(cè)肺組織,將其用甲醛固定48 h,再用乙醇脫水、二甲苯透明,最后浸蠟包埋,運(yùn)用蘇木精(Haematoxylin)、伊紅(Ehong)進(jìn)行HE染色并封片。

1.2.3.2 ELISA檢測(cè)肺組織IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平 取小塊肺組織加入裂解液進(jìn)行裂解,按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,在450 nm波長(zhǎng)依次測(cè)定各孔的吸光度值,計(jì)算后得出各實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織中IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1的實(shí)際濃度。

1.2.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)肺組織中RORγt、Foxp3的蛋白表達(dá) 取小鼠少量右側(cè)肺組織,分解成碎片,加入裂解液勻漿,按12 000 r/min,離心半徑5 cm,離心10 min取上清,進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)肺組織中RORγt、Foxp3的蛋白表達(dá)。

1.2.3.4 RT-PCR 檢測(cè)肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)水平:取小塊右側(cè)肺組織進(jìn)行裂解,參照Trizol方法測(cè)定肺組織中的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠呼吸平穩(wěn),毛發(fā)有光澤,進(jìn)食飲水、排便情況等均正常。哮喘模型組小鼠經(jīng)霧化激發(fā)后,出現(xiàn)呼吸急促,蜷縮,易激惹、肌肉顫動(dòng)、毛發(fā)豎立,進(jìn)食進(jìn)水少,大便失禁等表現(xiàn)。疏肝平喘組和地塞米松組小鼠用藥后呼吸急促緩解,活動(dòng)度較前改善,其他一般情況良好。

2.2 電鏡下各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 空白對(duì)照組肺組織完整,肺泡內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞滲出,支氣管壁結(jié)構(gòu)完整光滑,管腔內(nèi)徑正常,無(wú)炎性滲出,肺間質(zhì)無(wú)水腫。哮喘模型組肺組織中肺泡有滲出,支氣管變形,管徑變窄,管腔內(nèi)有大量的炎性滲出物,肺間質(zhì)有水腫,有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及積聚。疏肝平喘方組肺組織間少許破壞,支氣管管徑稍窄,管內(nèi)有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺間質(zhì)無(wú)水腫,地塞米松組支氣管壁結(jié)構(gòu)完整,管周有少許的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺間質(zhì)無(wú)水腫。見(jiàn)圖1。

圖1 電鏡下各組小鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色,×100)注：A.空白對(duì)照組,B.哮喘模型組,C.疏肝平喘方組,D.地塞米松組

2.3 肺組織中IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平比較 與空白對(duì)照組比較,哮喘模型組IL-6、IL-17A和TGF-β1水平均升高,IL-10水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同哮喘模型組比較,疏肝平喘方組和地塞米松組的的IL-6、IL-17A、TGF-β1水平均降低,IL-10水平增高(均P<0.05)。與地塞米松組比較,疏肝平喘方組IL-6、TGF-β1水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),IL-10、IL-17A差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組肺組織中IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平比較

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織中Treg和Th17細(xì)胞量 與空白對(duì)照組比較,哮喘模型組CD4+IL-17A+/CD4+、CD4+Foxp3+/CD4+、Th17/Treg的比值均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同哮喘模型組比較,地塞米松組、疏肝平喘方組的CD4+IL-17A+/CD4+、CD4+Foxp3+/CD4+、Th17/Treg的比值均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。疏肝平喘方組與地塞米松組相比,以上三項(xiàng)數(shù)值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組肺組織中Th17和Treg細(xì)胞量比較

2.5 肺組織中RORγt、Foxp3的蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較,模型組中RORγt蛋白升高,Foxp3蛋白下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同哮喘模型組相比,地塞米松組、疏肝平喘方組中RORγt蛋白下降,Foxp3蛋白增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。疏肝平喘方組同地塞米松組相比,RORγt/Foxp3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組肺組織中RORγt、Foxp3的蛋白表達(dá)

2.6 肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá) 與空白對(duì)照組比較,哮喘模型組的TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),而Smad7的表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同哮喘模型組相比,疏肝平喘方組、地塞米松組的TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平降低,而Smad7的mRNA水平增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同地塞米松組相比,疏肝平喘方組的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組肺組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)水平

3 討論

現(xiàn)代研究表明,氣道炎癥是哮喘急性發(fā)作期的重要機(jī)制,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg免疫平衡的打破所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[4]。過(guò)去的二十多年,關(guān)于哮喘的發(fā)病機(jī)制,研究的重點(diǎn)一直集中在Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡,但是近年來(lái),隨著新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群Th17的發(fā)現(xiàn),其已成為新的研究熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞作為促炎細(xì)胞,即可增強(qiáng)機(jī)體防御能力,又能加強(qiáng)炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生[5]。研究發(fā)現(xiàn),哮喘患兒在急性期其外周血中Th17細(xì)胞明顯高于緩解期患兒和健康兒童,同時(shí)增高程度和哮喘兒童的病情呈正相關(guān)[6]。Th17特異性地產(chǎn)生IL-17效應(yīng)因子,IL-17A的高表達(dá)和哮喘相關(guān)。Treg細(xì)胞通過(guò)抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化、增殖及殺傷毒性作用來(lái)抑制機(jī)體免疫反應(yīng),Treg細(xì)胞數(shù)量、功能的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)和多種嚴(yán)重的超敏反應(yīng)。Treg細(xì)胞分泌lL-4、lL-10和TGF-β1,其介導(dǎo)的免疫耐受在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用,與呼吸道炎癥密切相關(guān)[7]。

綜上所述,哮喘發(fā)病中的一個(gè)重要因素即促炎Th17細(xì)胞和抑制性Treg細(xì)胞間平衡的失調(diào)。Treg與Th17之間在功能和分化上互相遏制,但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。研究表明,CD4+Foxp3+的T細(xì)胞是小鼠體內(nèi)Th17和Treg的共同前體細(xì)胞,加入TGF-β1時(shí),前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)reg細(xì)胞,加人TGF-β1和IL-6時(shí),前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)h17細(xì)胞。其中IL-6作為關(guān)鍵因子決定前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)reg細(xì)胞或者Th17細(xì)胞,并且這兩種轉(zhuǎn)化作用是互相排斥的[8]。本研究發(fā)現(xiàn),與哮喘模型組比較,地塞米松組、疏肝平喘方組肺組織中的IL-6、IL-17A、TGF-β1水平均降低,IL-10水平增高。檢測(cè)肺組織Treg和Th17細(xì)胞量,與哮喘模型組比較,地塞米松組、疏肝平喘方組的CD4+IL-17A+/CD4+、CD4+Foxp3+/CD4+、Th17/Treg的比值均降低。說(shuō)明疏肝平喘方能夠調(diào)節(jié)哮喘小鼠炎癥介質(zhì)水平,從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥。

RORγt是Th17細(xì)胞的系別決定性轉(zhuǎn)錄因子,驅(qū)動(dòng)NaiveT細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[9]。RORγt在T細(xì)胞的分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用,它能夠調(diào)控T細(xì)胞和免疫器官的發(fā)育和成熟,以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生,是誘導(dǎo)Th17分泌IL-17的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[10]。Foxp3可通過(guò)外顯子2編碼序列與RORγt結(jié)合,減少RORγt對(duì)IL-17表達(dá)的抑制作用,而且抑制Foxp3與DNA的結(jié)合能力可以減少對(duì)IL-17表達(dá)的抑制[11],提示RORγt/Foxp3的表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞平衡密切相關(guān)。初始T細(xì)胞被抗原刺激后朝Th17還是Treg方向轉(zhuǎn)化是由細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的RORγt/Foxp3平衡決定的[12]。此次研究發(fā)現(xiàn),同哮喘模型組相比,地塞米松組、疏肝平喘方組肺組織中RORγt蛋白表達(dá)下降,Foxp3蛋白表達(dá)上升,與地塞米松組相比,疏肝平喘方組RORγt/Foxp3表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示疏肝平喘方使RORγt/Foxp3蛋白的表達(dá)降低,使Th17/Treg免疫失衡向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞傾斜。

TGF-β1是一種重要的炎性介質(zhì)及致纖維化生長(zhǎng)因子,促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展,上調(diào)炎癥細(xì)胞及多種細(xì)胞因子的表達(dá),參與氣道重塑[13-14]。氣道重塑是哮喘治療的難點(diǎn)之一,也成為過(guò)去幾年研究的熱點(diǎn)。其中TGF-β1/Smad信號(hào)通路是氣道重塑中的重要因子而受到關(guān)注。Smad是目前已知的唯一TGF-β1受體的胞內(nèi)激酶底物,其參與TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TGF-β1在氣道重塑中的生物活性通過(guò)Smad蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn),同時(shí),TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白的活性進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成,此過(guò)程在氣道重塑纖維化形成過(guò)程中有重要作用[15]。Smad蛋白參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、合成、分泌和凋亡過(guò)程,直接介導(dǎo)TGF-β1在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[16]。由于蛋白結(jié)構(gòu)和功能的不同,Smad蛋白家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用也是不同的。家族9種蛋白中Smad2、Smad3為受體調(diào)節(jié)型蛋白,Smad4為通用調(diào)節(jié)型蛋白,Smad6、Smad7為抑制型蛋白,以上蛋白都參與TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1/Smad信號(hào)通路在機(jī)體Treg/Th17分化平衡中起重要的調(diào)控作用。機(jī)體處于炎癥狀態(tài)時(shí),TGF-β1/Smad信號(hào)通路被激活,通過(guò)活化Smad2/3、抑制Smad7,從而可能啟動(dòng)RORγt介導(dǎo)的Th17細(xì)胞的分化,導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡的破壞。本研究中發(fā)現(xiàn),哮喘模型組的Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平增高,但是Smad7的表達(dá)水平明顯下降,與哮喘模型組比較,疏肝平喘方組、地塞米松組的Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平降低,但是Smad7的表達(dá)水平增高。提示該方通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路改善氣道炎癥。

平喘方是繼承海派徐氏兒科的經(jīng)驗(yàn)方,臨床應(yīng)用20余年,對(duì)于哮喘、咳嗽變異性哮喘等疾病,辨證使用,具有良好的療效。該方立法宣肺平喘、化痰祛瘀[18]。近年來(lái),因患兒情志起病病因增多,故而在其基礎(chǔ)上增加上了柴胡、白芍加強(qiáng)疏肝理氣作用,增加了丹參加強(qiáng)活血作用,宣肺平喘、疏肝理氣,活血祛瘀。是從“肺”與“肝”兩臟入手,調(diào)暢肺氣,并且理氣,并使“痰瘀”祛除。

前期對(duì)疏肝平喘方的研究發(fā)現(xiàn),其對(duì)咳嗽變異性哮喘患兒良好的臨床療效[19]。該方對(duì)哮喘小鼠升高的IL-13水平及mRNA均有降低作用,對(duì)其降低的IL-18水平及mRNA均有升高作用,對(duì)IL-13/IL-18比值的調(diào)節(jié)同地塞米松的作用相似,表明疏肝平喘方對(duì)哮喘小鼠Th1/Th2免疫失衡的調(diào)節(jié)有較為確切的干預(yù)作用[20]。

本研究驗(yàn)證了疏肝平喘方能夠改善哮喘小鼠的氣道炎癥,調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫失衡,TGF-β1/Smad信號(hào)通路是該方調(diào)節(jié)Th17/Treg免疫平衡上游通路,對(duì)于細(xì)胞炎癥介質(zhì)有調(diào)節(jié)作用,從而進(jìn)一步改善肺組織炎癥,改善氣道狹窄。該實(shí)驗(yàn)作為有益的探索,將為新藥研發(fā)與推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突聲明:無(wú)。