田 雪 胡少樸 歐光銀 王春輝 高 磊 韓 斐

(1 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院,北京,100053; 2 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,北京,100078)

抽動障礙(Tic Disorders,TD)是兒童時期起病的神經精神性疾病,主要表現為突然的、快速的、反復的、無節(jié)奏的一個或多個部位肌肉運動性抽動和(或)發(fā)聲性抽動,其發(fā)病率為0.4%～3.8%,并且有逐年上升的趨勢[1]。TD患兒病情反復遷延難愈,易伴發(fā)多種精神疾病,嚴重影響兒童及青少年的身心健康和生長發(fā)育,給家庭帶來巨大的經濟和心理負擔[2]。自身免疫失衡引起的大腦神經炎癥反應是TD發(fā)病的重要原因,越來越多的研究提示腦內免疫吞噬細胞(小膠質細胞)的過度活化介導的腦神經炎癥反應參與TD的發(fā)病過程[3]。

課題組認為TD的核心病機為心神失養(yǎng)、內外風動,以從心論治、肝肺同調為治療大法,在古方琥珀散化裁的基礎上創(chuàng)立院內制劑靜心止動方,經十余年反復臨床驗證療效顯著,能夠緩解TD患兒的癥狀,顯著提高其生命質量,并在安全性方面體現出較大優(yōu)勢[4-6],但目前尚缺乏靜心止動方治療TD的作用機制探討。本研究擬從網絡藥理學的角度探討靜心止動方治療TD的潛在作用機制,并通過體外細胞實驗進行驗證,以期為靜心止動方臨床治療TD提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 靜心止動方活性成分篩選及靶點預測 通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和 Likeness,DL)≥0.18為篩選條件,分別獲取百部、板藍根、北沙參、柴胡、藁本、蔓荊子、木蝴蝶、酸棗仁、辛夷的活性成分;鑒于TCMSP數據庫暫未收錄方中天麻的相關活性成分數據,所以我們從中醫(yī)藥百科全書(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)數據庫獲取天麻的活性成分。將上面獲取的中藥各種活性成分,導入PubChem數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得各成分的canonical SMILES序列號,然后將序列號導入SwissTargetPrediction數據庫(http://swisstarget prediction.ch/)中,限定物種為“Homosapiens”,以“probability”>0為篩選條件,以預測各活性成分的作用靶點。

1.2 TD靶點的預測 利用關鍵詞“Tic Disorders”從以下數據庫中收集疾病相關靶點:GeneCards(https://www.genecards.org/),人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://www.omim.org/),治療性靶標數據庫(Therapeutic Target Database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/),PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/)。然后利用jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)獲得交集靶點,即為TD相關靶點。

1.3 構建中藥-活性成分-疾病靶點網絡 將各中藥和TD的靶點導入jvenn平臺,二者交集靶點作為靜心止動方治療TD的潛在作用靶點。運用Cytoscape 3.8.0軟件(https://cytoscape.org/)建立中藥-活性成分-疾病靶點網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡的構建及核心靶點篩選 將靜心止動方和TD的交集靶點導入STRING 11.5數據庫(https://cn.string-db.org/),限定物種為Homosapien”,并以最低互作分數為中度可信度(0.4分)為條件,構建PPI。將得到的PPI網絡的數據以.tsv格式保存,導入Cytoscape 3.8.0軟件進行可視化分析,然后使用軟件的內置插件CytoNCA計算該PPI網絡的中間性中心性(Betweenness Centrality,BC)、緊密性中心性(Closeness Centrality,CC)、程度中心性(Degree Centrality,DC)、特征向量中心性(Eigenvector Centrality,EC)、網絡中心性(Network Centrality,NC)和局部平均連通性(Local Average Connectivity,LAC)參數用于評估PPI網絡節(jié)點的拓撲屬性,隨后以各參數的中位值為篩選條件,篩選得到靜心止動方治療TD的核心靶點。

1.5 核心靶點通路注釋分析 使用R 4.1.3軟件的clusterProfiler包對上述得出的核心靶點進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。然后使用enrichplot包對分析結果進行可視化,使用ggplot2包繪制圖片。然后在KEGG數據庫(https://www.genome.jp/kegg/)對相關通路進行分析。

1.6 細胞實驗驗證

1.6.1 材料

1.6.1.1 細胞 小鼠BV2小膠質細胞(上海富衡生物科技有限公司,貨號:FH0355),使用DMEM培養(yǎng)基(含有10%FBS和1%雙抗)置于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2)中常規(guī)培養(yǎng)。

1.6.1.2 藥物 靜心止動方顆粒劑(酸棗仁12 g、珍珠粉0.9 g、柴胡9 g、天麻9 g、辛夷9 g、藁本9 g、蔓荊子9 g、木蝴蝶6 g、板藍根9 g、百部9 g、北沙參9 g)由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院提供。參考既往文獻[7],藥品制備時取2付藥量,共180 g,加水濃縮至180 mL,獲得1 g/mL分裝至離心管,1 500 r/min,離心半徑12.5 cm,離心25 min,取上清液,0.22 μm篩網過濾除菌,-20 ℃保存以供后續(xù)細胞實驗。

1.6.1.3 試劑與儀器 BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P0010S);磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(Phosphorylated Phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)抗體(BIOSS,貨號:BS-5570R);磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抗體、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated Protein Kinase B,p-AKT)抗體和蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)抗體(Cell Signaling Technology,美國,貨號分別為4257、4060和4691);β-actin抗體(Boster,美國,貨號:BM3873);740 Y-P(MedChemExpress,美國,貨號:HY-P0175);脂多糖LPS(Solarbio,貨號:L8880);特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,P0018AS);放射免疫沉淀測定(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海碧云天生物技術有限公司,P0013B)等。Multiskan酶標儀(Bio-Rad公司,美國,型號:Go1510);ChemiDocMP成像和分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國,型號:1708283)。

1.6.2 方法

1.6.2.1 BV2細胞活化模型建立 用聚丁二酸丁二醇酯(Poly Butylenes Succinate,PBS)配制1 mg/mL脂多糖母液,于-20 ℃冰箱避光保存。以2×104個細胞/孔的濃度將BV2細胞接種到6孔板中,待細胞量長至80%時,加入脂多糖(終濃度1 μg/mL)共同孵育,藥物作用24 h以使BV2細胞達活化狀態(tài)[8]。

1.6.2.2 細胞分組及干預方法 將活化的BV2細胞分為4組:1)脂多糖組用無血清培養(yǎng)基干預24 h;2)740Y-P組用25 μg/mL 740Y-P干預24 h;3)JXZDF組用25 mg/mL JXZDF干預24 h(給藥濃度參考文獻[9]);4)JXZDF+740 Y-P組用25 μg/mL 740Y-P+25 mg/mL JXZDF聯(lián)合干預24 h。

1.6.2.3 蛋白質免疫印跡法檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、β-actin蛋白的表達水平 使用RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min,收集裂解液于離心管內,4 ℃、15 000 r/min,離心半徑12.5 cm,離心20 min,收集上清液,并采用二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法進行濃度檢測。將各組蛋白濃度配平并變性,進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜100 min,5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)室溫封閉1 h。按抗體說明書加入最優(yōu)比例一抗,4 ℃冰箱孵育過夜。第2天用洗膜緩沖液(Tris Buffered Saline-Tween 20,TBST)洗膜3次,10 min/次。加入相應種屬二抗,室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,10 min/次。采用增強型化學發(fā)光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)法顯影,將圖片導入ImageJ軟件中進行定量分析。

1.6.2.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism軟件進行數據分析,組間顯著性檢驗采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 靜心止動方活性成分及靶點 共獲取靜心止動方活性成分173個。共收集到靜心止動方中153個活性分子的潛在靶點1 175個。

2.2 靜心止動方治療TD潛在靶點 得到2 693個TD相關靶點。共得到交集靶點291個。見圖1。

圖1 TD靶點韋恩圖和靜心止動方與TD交集靶點韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-疾病靶點網絡 所構建的中藥-活性成分-疾病靶點網絡模型共涉及447個節(jié)點,以及3 780條邊,不同顏色及形狀分別代表靜心止動方的藥物、活性成分以及治療TD的潛在靶點。其中黃色菱形代表藥物,紫色矩形代表活性成分,藍色圓形代表作用靶點,其Degree越大,則節(jié)點形狀越大。見圖2。選取到Degree前5的活性成分主要為槲皮素、豆甾醇、高車前素、β-谷甾醇、山柰酚等。見表1。

表1 度值前5的活性成分

圖2 靜心止動方治療TD的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡

2.4 PPI網絡及核心靶點 結果顯示有291個節(jié)點,3 670條邊,平均節(jié)點度值為25.2。見圖3。篩選核心靶點過程及各參數閾值見圖4。最后得到28個核心靶點。見表2。

表2 28個核心靶點及其度值

圖3 靜心止動方與TD交集靶點PPI網絡

圖4 PPI網絡拓撲分析核心靶點流程

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通過對28個核心靶點的富集分析,最后得到GO富集條目共有1 893條,其中生物過程(Biological Process,BP)1 760條,細胞組分(Cellular Component,CC)51條,分子功能(Molecular Function,MF)82條。BP排名靠前的有神經膠質細胞分化、膠質細胞再生、肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾、神經元死亡等;CC排名靠前的有早期內體、膜筏、膜微結構域、谷氨酸能突觸、晚期內體等;MF排名靠前的有磷酸酶結合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結合轉錄因子結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、脫氧核糖核酸-結合轉錄因子結合、蛋白磷酸酶結合等。KEGG富集通路分析條目有158條。BP,CC,MF各排名前10的GO條目和排名前20的KEGG相關通路見圖5。結果提示,PI3K/AKT信號通路可能是靜心止動方治療TD的關鍵通路,預測相關作用靶點為AKT1、MAPK3、IL6、TP53、EGFR、MTOR、VEGFA、MAPK1、NTRK2、ERBB2、RELA、GSK3B、MAP2K1、ERBB4。見圖6。

圖5 GO和KEGG富集分析氣泡圖

2.6 細胞實驗結果 740 Y-P組和靜心止動方組分別與脂多糖組比較,結果顯示,PI3K激動劑740 Y-P組可提高PI3K/p-PI3K和AKT/p-AKT蛋白表達水平,靜心止動方組抑制BV2細胞PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT蛋白的表達,而當聯(lián)合應用740 Y-P時,靜心止動方的抑制效應被逆轉。見圖7。

圖7 免疫組化檢測各組PI3K/AKT通路關鍵蛋白表達注:與模型組比較,**P<0.01,***P<0.001;與對照組比較,△△P<0.01,△△△P<0.001

3 討論

韓斐教授從臨床實踐中發(fā)現,患有TD的患兒或多或少均存在性格內向、執(zhí)拗,脾氣暴躁易怒,甚至狂躁的性格特點,這種情緒問題出現在抽動癥狀出現之前,并且貫穿疾病的整個過程。而“心為臟腑之主,而總統(tǒng)魂魄,并駭意志”(張介賓《類經》),患兒長期存在情緒問題,耗傷心血,會導致心神失養(yǎng),統(tǒng)領失權,而五志各異;故心神失養(yǎng)是導致患兒出現抽動癥狀的病理基礎,而癥狀的易于變化、易于反復,是肝陽風動或肝血不足,導致肝風內動的表現;心肺同屬上焦,患兒心血虧虛,日久傷及肺陰、肺氣,致使易感外邪而至肺竅不利,鼻咽癥狀突出,而成為抽動癥狀發(fā)生的重要誘因。據此,韓斐教授總結出“從心論治,肝肺同調”的治療大法,創(chuàng)立靜心止動方(由酸棗仁、珍珠粉、柴胡、天麻、辛夷、藁本、蔓荊子、木蝴蝶、板藍根、百部、北沙參等11味藥物組成)[10],方中以珍珠粉、酸棗仁寧心安神為君,天麻、柴胡疏肝解郁為臣,加以疏風解表之藁本、蔓荊子等,全方共奏寧心安神、祛風疏肝之功。課題組前后進行了持續(xù)而多維度的臨床研究[4-6,10-20],從不同角度證實了靜心止動方治療TD的臨床療效,發(fā)現其在改善運動性抽動和發(fā)聲性抽動的次數、頻率及總損害率方面明顯優(yōu)于西藥,同時能改善TD患兒心理情緒癥狀,顯著提高其生命質量,并在安全性方面體現出較大優(yōu)勢。

本研究首先采用網絡藥理學的方法,以靜心止動方與TD為研究對象,通過數據庫與文獻索引獲得交集靶點,借助PPI網絡預測靜心止動方治療TD的活性成分及潛在的分子靶點。最后通過信號通路富集分析,將研究的重點聚焦在了PI3K/AKT信號通路上。

TD作神經精神類疾病,嚴重影響兒童身心健康,雖然TD的發(fā)病機制不清,但自身免疫失衡引起的大腦神經炎癥反應是重要的一種假說。作為“腦內吞噬細胞”,小膠質細胞發(fā)揮免疫與神經的交互作用,在TD的發(fā)病過程中起到重要作用。2016年LENNINGTON等[21]對TD患者尸檢后腦組織的研究發(fā)現,TD患者腦尾狀核區(qū)小膠質細胞異常活化,研究同時采用基底神經核區(qū)腦組織RNA測序的方法,發(fā)現這些區(qū)域同樣存在過度活化的小膠質細胞分泌的炎癥介質的高表達。因此TD患者腦中存在異常活化的小膠質細胞,同時分泌炎癥介質,這些炎癥介質作為重要的神經炎癥調節(jié)分子,起到神經與炎癥之間的交互作用,是中樞神經系統(tǒng)炎癥反應的主要參與者,可以增加血腦屏障的通透性,誘發(fā)自身免疫,促進神經遞質的異常釋放,進而導致TD的發(fā)病。

PI3K/AKT信號可能參與TD發(fā)病。研究表明,PI3K/AKT/NF-κB通路在DOI誘導的TD動物模型中被激活,而LY294002(一種PI3K抑制劑)治療后不僅減輕了TD動物的癥狀,同時也減少了PI3K/AKT/NF-κB介導的神經炎癥[22],其關鍵靶標亦被證實與神經精神疾病有關,主要作用包括促進神經營養(yǎng)因子釋放,調控谷氨酸能系統(tǒng)功能,抑制海馬神經元凋亡,改善線粒體功能異常,調節(jié)糖和脂質代謝紊亂,促進腦血管新生等。PI3K/AKT信號通路調控小膠質細胞活化介導的神經炎癥的研究越來越多,其中最具總結性的文獻[3]綜述指出,在神經炎癥的發(fā)生過程中,PI3K通路發(fā)揮了至關重要的作用,PI3K的激活/沉默直接影響小膠質細胞M1/M2極化平衡狀態(tài),即發(fā)揮促炎還是抗炎效應,這對于神經系統(tǒng)的保護尤為重要。

本研究通過體外實驗驗證靜心止動方是否通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮TD的治療作用,為此研究選擇了活化的小膠質細胞作為研究對象,旨在模擬TD患兒大腦神經炎癥反應狀態(tài)。在靜心止動方干預后,小膠質細胞中PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT蛋白的表達水平下調。為進一步證實該信號通路的存在,本研究進一步加用了PI3K激動劑作為合并用藥,從結果中也可以看出,PI3K激動劑740 Y-P上調了PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT蛋白的表達,740 Y-P與靜心止動方聯(lián)合干預后,靜心止動方對PI3K/AKT信號通路的抑制效應被逆轉,提示PI3K/AKT信號通路參與了靜心止動方治療TD的生物過程。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學和體外細胞實驗證實,靜心止動方的主要活性成分為槲皮素、豆甾醇、高車前素、β-谷甾醇、山柰酚等,其通過PI3K/AKT信號通路調控紋狀體小膠質細胞過度活化,抑制大腦神經炎癥反應,從而發(fā)揮TD治療作用。從上述主要活性成分的藥物來源來看,柴胡和蔓荊子在本方中的意義較為重大,在臨床應用中可考慮適當加大用量,而二者與TD的具體量效關系待于進一步研究。本研究為闡釋“心神失養(yǎng)、內外風動”的TD病機、“從心論治、肝肺同調”的治療大法提供了生物學線索和依據,為下一步開展高級別臨床研究提供了實驗支持。

利益沖突聲明:無。